View source for Molekularni biosenzor za zaznavanje kaspaze-3 in detekcijo apoptoze

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s11427-021-1986-7 A switch-on molecular biosensor for detection of caspase-3 and imaging of apoptosis of cells]

==Uvod==
Eden pomembnejših fizioloških procesov za živalske celice je zagotovo kontrolirana celična smrt ali apoptoza, ki sodeluje pri rasti, delitvi in diferenciaciji celic ter povzroča številne spremembe v morfologiji in presnovi. V nasprotju z nekrozo, tj. patološka celična smrt, je apoptoza kontrolirana in ne privede do vnetnega odziva. Gre torej za uravnan proces, ki je potreben, saj se s tem odstranjujejo celice iz organizma, ki so potencialno okužene, imajo poškodovano DNA, so rakasto spremenjene ali pa so organizmu odvečne. Disregulacija apoptoze lahko povzroči številne bolezni, kot so Alzheimerjeva bolezen, Huntingtonova bolezen in še vrsto drugih avtoimunih bolezni. Pomembno je torej razumeti sam fiziološki mehanizem apoptoze z namenom, da bi v nadaljevanju pravočasno odkrili in zdravili določene bolezni. 

Kot nam je že vsem znano lahko apoptoza poteka na dva različna načina. Poznamo intrinzično in ekstrinzično pot. Kaspaza-3 ima zelo pomembno vlogo pri apoptozi, saj gre za efektorsko kaspazo, ki razgrajuje in vrši proces apoptoze. Signalizacija obeh poti poteka preko kaspaze-3, zato predstavlja dobro tarčo za raziskovalne namene [1].

==Koncept zasnove biosenzorja==
Običajno se za odkrivanje apoptoze uporabljajo morfološke in biokemične metode, ki pa niso zadostne in dovolj natančne, da bi odražale realno stanje kakšni so apoptotski mehanizmi. S pomočjo danes dobro razvite proteomike bi lahko identificirali kaspazne substrate, vednar gre za precej zamuden in kompleksen proces. Tekom raziskovanja so raziskovalci ugotovili, da so kaspaze zelo močno povezane s celično apoptozo. Med njimi je kaspaza-3 najpogostejša, lahko bi rekli tudi glavna spodnja efektorska molekula, ki lahko prenaša in ojača apoptotične signale in se zato uporablja kot tarča z namenom analitičnega prepoznavanja apoptoze. Da bi torej lahko v celicah zaznali koncentracijo efektorske kaspaze-3, so oblikovali biosenzor s hidrolitično aktivnostjo kratkega peptida DEVD, ki ga je le-ta sposobna prepoznati.

Da bi bolje razumeli koncept zasnove biosenzorja se moramo seznati še z enim posebnim fizikalnim pojavom imenovanim Försterjev prenos resonančne energije (angl. Förster resonance energy transfer, FRET). Gre za pojav, pri katerem pride do energijskega prenosa med dvema svetlobno občutljivima molekulama, na primer kromoforjema. Sam proces prenosa energije poteka tako, da kromofor, ki je donor, v vzbujenem stanju prenese svojo energijo na drugi kromofor, v tem primeru je to akceptor, preko dipol-dipol interakcije [2]. Ideja je torej zasnovana na dveh kromoforjih (cyan-modro flurescirajoči protein (CFP) in rumeni flurescirajoči protein (YFP)), ki sta medseboj kovalentno povezana z linkerjem DEVD. V primeru, da je linker intakten, lahko eksitacija CFP vzbudi YFP pri valovni dolžini 525 nm. Če pa linker cepi kaspaza-3, se FRET izgubi in dobili bomo samo emisijo CFP pri 475 nm. V članku je bilo opisanih še nekaj drugih primerov proteinskih kompleksov, pri katerih se potem spremenijo same osnovne funkcijske lastnosti zaradi cepitve kaspapaze-3.

Drugi primeri proteinskih kompleksov: 

-	CA-GFP, ki je v osnovnem stanju neaktiven, ko pride do cepitve peptida DEVD, se povrne prvotna fluorescenca,
 
-	Ciklizirana luciferaza z vključkom DnaE inteina in zaporednja DEVD na različnih koncih -> cepitev kaspaze-3 je povrnila encimsko aktivnost.

Razviti so bili tudi drugi fluorescenčni senzorji, ki temeljijo na prostorski translokaciji ali pa na samosestavljanju. Vse izmed omenjenih metod so bile uporabljene za preučevanje apoptoze, vendar pa ob tem kažejo nekatere pomankljivosti, ki otežujejo razumevanje samega biološkega procesa. Pri testu z luciferazo je za ustvarjanje katalitične fluorescence potreben eksogen dodatek encima, kar je za sistem neugodno. Ne glede na to, da dobimo na koncu precej visok signal ob dodatku encima, lahko to predstavlja potencialno tveganje za natanek motenj fiziološkega stanja. Na drugi strani pa imamo endogene genetsko kodirane fluorescenčne proteinske biosenzorje, ki nimajo omenjenih težav, nastopajo pa druge omejitve, kot na primer nizka občutljivost in zapozneli čas odziva, kar je posledica daljšega zorenja fluorescence [1][3].

==mNeoGreen2==
Ker je apoptoza skrajno pomemben proces, preko katerega lahko dobimo informacije o posameznih patoloških stanjih, so se odločili, da bodo do sedaj pridobljeno znanje združili in ustvarili nov biološki multikompeks mNeoGreen2. Gre za senzorični element, ki je občutljiv na cepitev s kaspazo-3 in katerega fluorescenca je 1,5-3 krat večja od GFP ali YFP. Primarno je protein fuziran s cepitvenim mestom za kaspazo (DEVD) in cikliziran preko regije Npu DnaE iz organizma Nostoc punctifrome z namenom, da se prepreči fluorescenca. Če je prisotna kaspaza-3, bo ta cepila mesto DEVD in omogočila linearizacijo proteina. Protein se bo potem konformacijsko spremenil tako, da se tvori osnovna struktura beta sodčka, s čimer se potem povrne aktivnost fluorescence. Za zmanjšanje fluorescence ozadja, je zaporedju dodana še PEST sekvenca, ki služi kot proteolitični signal [1].

==Optimiziranje biosenzorja==
Tako kot pri vsakem procesu, so tudi tukaj želeli celoten sistem optimizirati do točke, kjer jim je to biosenzor omogočal. Do sedaj so že ugotovili, da je ciklični fluorescenčni protein mNeoGreen2 izgubil svojo aktivnost na račun popačenja strukture. Ena od stvari, ki jih je tudi zanimala je to, ali lahko s spreminjanjem dolžine razcepljenega proteina vplivamo na fluorescenco biosenzorja. V ta namen so potem na novo ustvarili N- in C-terminalne konstrukte in jih razcepili pri ostankih T144/ Y145, D158/K159 in  N173/G174 z dodanimi fragmenti DnaE. 

Transfekcijo so izvedli v celicah HEK293T, ki so jih najprej gojili 18 ur, potem pa so jih stimulirali s staurosporinom (STS; reagent, ki inducira apoptozo). Slike celic so pridobili in analizirali z uporabo inststrumenta Cytation-3 vsake 2 uri. Ugotovili so, da so bili najbolj zadovoljivi rezultati pri konstruktu D158/K159, saj je ta potreboval najkrajši čas, da so lahko zaznali fluorescenco.
V nadaljevanju so naredili še nekaj poskusov, kjer so ugotavljali, ali se bo morda funkcija biosenzorja spremenila tudi ob skrajšanju N- oziroma C-konca zaporedja. Ugotovili so, da skrajšanje na C-koncu zaporedja ne vpliva signifikantno na aktivnost biosenzorja, medtem ko skrajšanje na N-koncu zaporedja precej vpliva na intenziteto in čas zorenja fluorescence. Ugotovljeno je bilo, da je vzorec D2 najprimernejši, ker je imel najkrajši odzivni čas in prisotne je bilo zelo malo fluorescence ozadja [1].

==Karakterizacija biosenzorja za kaspazo-3==
Tako kot pri vseh eksperimentih in poskusih, ki jih delamo, so tudi tukaj raziskovalci naredili za primerjavo negativno kontrolo, ki so jo poimenovali CK biosezor. Ta se od glavnega biosenzorja za zaznavanje kaspaze-3 razlikuje v tem, da ima drugačno cepitveno mesto, GSGC, katerega kaspaza-3 ne more cepiti. Ponovno so transfekcijo izvedli v celicah HEK293T, katere so potem stimulirali z dodatkom STS ali Z-VAD-fmk, ki je inhibitor kaspaze-3 ali pa z obema reagentoma. Ugotovljeno je bilo, da celice fluorescirajo tudi brez dodatka STS, kar je pričakovano, saj je apoptoza spontan in normalen proces. Dodatek STS povzroči močno fluorescenco, če dodamo Z-VAD-fmk pa popolnoma inhibiramo apoptozo. Zamenjava zaporednja iz DEVD v GSGC, ki predstavlja cepitveno mesto za kaspazo-3, ne daje fluorescence, zato lahko sklepamo, da kaspaza-3 ni delovala. Eksperimentalni podatki so pokazali tudi, da se fluorescenca pojavi že po 20 minutah, ko se pričnejo začetni procesi apoptoze. To dejstvo torej dokazuje, da lahko s pomočjo tega biosenzorja merimo apoptozo še preden so inducira nastanek apoptotskih telesc [1].

==Razširjena uporaba biosenzorja==
Ker so študijo želeli razširiti še na realne vzorce, so biosenzor mNeoGreen2 uporabili za namen indikacije tumorskih celic po stimulaciji z TNF-α, po zdravljenju s kemoterapevtiki in za namen presejalnih testov v primeru virusa Zika. Najprej so biosenzor skušali stabilno izraziti v celicah HeLa  in MCF-7 , kjer so želeli preveriti ali se aktivnost biosenzorja povrne ob dodatku TNF-α. Celicam so dodali tudi določeno koncentracijo cikloheksimida. Rezultati so pokazali, da so celice, ki niso bile stimuirane z TNF-α, imele zanemarljivo fluorescenco v primerjavi s tistimi, katerim je bil dodan TNF-α, kar je bilo za pričakovati. Uspeli so dokazati tudi, da lahko opazujejo apoptozo v celicah MCF-7, ki nimajo prisotne kaspaze-3, imajo pa prisotno kaspazo-7, ki spada v družino podobnim kaspazam-3. 

Povezavo med apoptozo in kemoterapevtiki so testirali s tremi protitumorskimi zdravili: 5-fluorouracil (5-FU), ki vpliva na sintezo nukleinskih kislin, docetaksel, ki moti sintezo proteinov in doksorubicin, ki inhibira sintezo RNA in DNA. Preučevali so torej potencial treh zdravil kako vpliva na induciranje apoptoze. Pri 5-FU so ugotovili, da inducira apoptozo pri HeLa celicah, na MCF-7 celice pa nima nobenega vpliva. Podoben trend učinka so zaznali pri doksorubicinu, večji vpliv je imel na celice HeLa. Precej zanimivo pa je bilo dejstvo, da je docetaksel imel obraten učinek na vrsto celic, večji učinek je bil na celice MCF-7. Iz ugotovitev in eksperimentov lahko sklepamo, da je apoptoza celic HeLa in MCF-7 precej odvisna od tipa celic in same koncentracije zdravila. 

Tudi pri virusu Zika so prišli do končnega sklepa, kjer so ugotovili, da lahko virus inducira apoptozo HeLa celic, hkrati pa pri tem biosenzor zagotavlja zelo dober način zaznave fiziološkega procesa na katerem bodo lahko bazirale sodobne tehnike fluorescenčnega aktivnega sortiranja celic (FACS) [1].

==Literatura==
[1]	R. Gong, D. Wang, G. Abbas, S. Li, Q. Liu, M. Cui, X. E. Zhang: A Switch-on Molecular Biosensor for Detection of Caspase-3 and Imaging of Apoptosis of Cells. Sci. China Life Sci. 2022, 65, 540–549.

[2]	Förster resonance energy transfer - Wikipedia https://en.wikipedia.org/wiki/Förster_resonance_energy_transfer (accessed May 23, 2022).

[3]	S. J. Martin: Caspases: Executioners of Apoptosis. Pathobiol. Hum. Dis. A Dyn. Encycl. Dis. Mech. 2014, 16, 145–152.