View source for Načrtovana evolucija genetskih vezij

[http://www.pnas.org/content/99/26/16587.full Directed evolution of genetic circuit]

Genetska vezja predstavljajo nov mejnik v sintezni biologiji, vendar pa je njihova uporaba zaenkrat omejena. K temu veliko prispeva dejstvo, da med simulacijami in eksperimentalnimi rezultati obstajajo ogromne razlike. Nepoznavanje celotnega sistema v celicah nam onemogoča natančne napovedi in zaradi tega so za pravilno delovanje vezij potrebne optimizacije. V nadaljevanju so predstavljeni racionalni pristopi k načrtovanju in izvedbi tega procesa.
Strategije optimizacije 

Za razliko od električnih vezjih, kjer so elementi ločeni v prostoru, se pri bioloških vezjih vsi elementi nahajajo v istem prostoru a uporabljajo različne signale. Ker je za vsak element potreben edinstven signal, so biološka vezja težko predvidljiva zaradi različnih kinetičnih lastnosti.<ref name="weiss">R. Weiss, „[http://dspace.mit.edu/handle/1721.1/8228 Cellular Computation and Communications using Engineered Genetic Regulatory Networks]“, št. 1992, 2001.</ref>


== Racionalne strategije optimizacije genetskega vezja ==

 
'''Spreminjanje moči promotorja'''
Uvajanje mutacij v promotor spreminja afiniteto vezave RNA polimeraze nanj. S tem se spreminja število kopij mRNA 

'''Spreminjanje moči vezavnega mesta za ribosom'''
Uvajanje mutacij v vezavno mesto za ribosom (RBS) spreminja afiniteto vezave ribosoma na mRNA, kar vpliva na število sintetiziranih proteinov.

'''Spreminjanje števila genov na zapisu'''
S povečevanjem števila zaporednih zapisov na mRNA  povečamo število proteinov, ki se jih izrazi naenkrat.

'''Spreminjanje stopnje degradacije proteinov'''
Z uvajanjem mutacij v C končno aminokislinsko zaporedje proteinov lahko vplivamo na njihovo življenjsko dobo. S tem omogočimo hitrejše ali daljše obdobje delovanja proteina, kar vpliva na prenos signala iz enih logičnih vrat v druga.

'''Dodajanje avtorepresije'''
V kolikor dodamo v opreatorsko regijo mesta, ki bodo omogočala represijo s produktom, lahko preprečimo prevelik vhodni signal. S tem onemogočimo, da bi se sintetiziralo neomejeno količino proteina, ki bi lahko zmotil delovanje našega vezja.

'''Spreminjanje interakcije represor-operator'''
Da bi spreminjali to interakcijo lahko uvajamo mutacije v operatorsko zaporedje ali pa v gen, ki zapisuje represor.


== Opis genetskega vezja ==


Gensko vezje, ki je bilo uporabljeno v članku<ref name="yokobayashi">Y. Yokobayashi, R. Weiss, in F. H. Arnold, „[http://www.pnas.org/content/99/26/16587.full Directed evolution of a genetic circuit]“, let. 99, št. 26, 2002..</ref>, je sestavljeno iz dveh vektorjev. Prvi pINV-110 vsebuje zapis za protein LacI, ki sledi močnemu konstitutivnemu promotorju Placq, zapis za protein cI, ki sledi promotorju Plac. Temu zapisu sledi tudi zapis za ECFP (enhanced cyan fluorescen protein). Pred zadnjima proteinoma je enako mesto RBS II. Vektor vsebuje tudi gen za rezistenco na kanamicin in izvor replikacije p15A.
Vektor pINV-107b vsebuje zapis za rezistenco na ampicilin, izvor replikacije ColE1 in zapis za EYFP (enhanced yellow fluorescent protein), ki ima promotor λPRO12, na katerega deluje represor cI,  in vezavno mesto za ribosom RBS II.



=== Delovanje ===


Gensko vezje deluje kot logično vezje implikacije (če, potem) in je zaporedje vezij ali in negacije. Vezje ali ima vhoda LacI, ki je vedno pozitiven, in IPTG, ki ga variiramo. Ker je promotor PlacIq konstitutiven je koncentracija LacI vedno visoka. V shemi je to prikazano s prvim znakom negacije, saj pomanjkanje signala povzroči izražanje. Če IPTG ne dodamo v sistem, LacI preprečuje izražanje cI represorja in promotor λPRO12 ni represiran, kar vodi v prepis EYFP. Če IPTG dodamo, pride do prepisa proteina cI, saj represor LacI ni več vezan na promotor. V tem primeru do izražanja EYFP ne pride, ker se cI veže na promotor.


== Raziskava ==


Ob prvotnem testiranju z nespremenjenim promotorjem pINV-110 vezje ni delovalo pravilno, saj ni bilo izhodnega signala ob nobeni koncentraciji IPTG. Vzrok tega je puščanje promotorja Plac, kar omogoča konstantno izražanje represorja cI. V prejšnji študiji[1] je bilo vezje optimizirano s simulacijami in točkovno mutagenezo mesta RBS pred zapisom za cI, prav tako pa s točkovno mutagenezo mesta OR1 na operatorju λPRO12. S tem je mesto RBS postalo močnejše in omogočila izražanje manjši količini represorja cI, če je bil prisoten represor LacI. Mutacije na mestu OR1 so prav tako ošibile vezavo represorja cI na operator. S tema dejanjema se je količina cI zmanjšala na koncentracijo, ki ni bila več zmožna preprečiti prepisovanja EYFP. Postopek mutacij zahteva veliko količino dela in natančno poznavanje vseh molekul. V članku so vzeli ta racionalno optimiziran postopek za standard pri oceni svojih eksperimentov.

Pri načrtovani evoluciji gre za uporabo naključne mutageneze in nato načrtnega odbiranja želenih rezultatov. Mutagenezo lahko usmerjamo v manjše segmente vezja in tako hitro ugotovimo, kako dana sprememba vpliva na sam sistem. V racionalni optimizaciji smo omejeni na mutacije, katerih rezultat lahko predvidimo. S tem je bila prejšnja optimizacija usmerjena na operator in RBS, samega proteina cI pa se zaradi kompleksnosti sprememb ni lotevala. 


=== Načrtovana mutageneza in evolucija ===

Sama mutageneza je bila izvedena s PCR z napakami, pri kateri se je uporabila Vent DNA polimeraza v raztopini z neoptimalno koncentracijo MgCl2. V prvi PCR reakciji so z dvema oligonukleotidoma pomnožili regijo pINV-110 izven gena za cI ter s tem vnesli dve restrikcijski mesti BsaI. S tem so dobili vektor pINV-110-lib. V drugi PCR reakciji sta bila uporabljena dva oligonukleotida za pomnoževanje in uvajanje mutacij v cI genu. Pri tem so uporabili neoptimalne pogoje, kar je vodilo do nastanka mutiranih genov za cI. Ker so jim z oligonukleotidoma vnesli tudi že prej omenjeno mesto BsaI so lahko te fragmente legiral v pINV-110-lib. Konstrukte so vnesli v celice E. coli seva DH5α.


=== Rezultati ===

V prvem krogu so kolonije testirali za prisotnost fluorescence ob odsotnosti IPTG. Okoli polovica kolonij je za razliko od prvotnega poskusa s pINV-110 svetila, kar je pomenilo odsotnost represosrja cI. Te kolonije s prestavili v raztopino z 800 µM IPTG in znova testirali za fluorescenco. Nefluorescirajočih je bilo med 5 in 10 % kolonij. Iz teh kolonij so izolirali plazmidno DNA in jo sekvenirali. Iz zbranih podatkov so ugotovili, da je bil del mutacij v RBS, kar je sovpadalo z racionalno optimizacijo. Nekaj . Bolj signifikantne so bile mutacije v zapisu za cI, ki so uvedle stop kodon. Večina teh je bila skoncentrirana pred C končno regijo, ki je odgovorna za dimerizacijo proteina. Ta omogoča tesnejšo in bolj stabilno vezavo na operator. Ker so želeli ohraniti elotno dolžino proteina cI so za nadaljnjo mutagenezo izbrali vektorje, ki so vsebovali mutacije v zapisu za protein brez vnosa stop kodona. V drugi fazi poskusa so kolonije najprej testirali ob prisotnosti 800 µM IPTG. Nefluorescirajoče kolonije so nato prenesli v medij brez IPTG in znova testirali. Od tako dobljenih delujočih vezij so sekvenirali plazmide in takoj zanemarili tiste,ki so bili enaki prejšnji generaciji. Ostale mutacije so bile večinoma sinonimne za štiri ali več aminokislinskih ostankov. Sprememba v delovanju vezja je tako prišla zaradi hitrosti translacije zaradi spremembe rabe kodona.


== Diskusija ==

Osnovno nedelujoče vezje je predstavljalo primer običajnega genetskega vezja, ki je bilo načrtovano a še ne optimizirano na in vivo sistem. Z uporabo racionalnega načrtovanja optimizacije vezja lahko operiramo le z mutacijami, katerih rezultate lahko predvidimo, kar pa nam bistveno zmanjša nabor možnosti mutacij. V opisanih poskusih, v katerih je bila uporabljena načrtna evolucija, se je postopek izkazal za hitrejšega in bolj učinkovitega kot racionalno načrtovanje vezja. Končni rezultat je bistveno spremenil razliko med fluorescenco v prisotnosti in odsotnosti IPTG in jo v primerjavi s kontrolo povečal za skoraj dvakrat. Poleg tega pa je ugotavljanje mesta mutacij dal nov vpogled v strukturo in delovanje represorja cI. Mutacije v C končni regiji so  se nahajale večinoma namestih aminokislinskih ostankov, ki so zadolženi za dimerizacijo. To je zmanjšalo afiniteto proteinov do DNA, vendar je protein še vedno lahko deloval kot represor. Dodatne mutacije so bile tudi v N končni domeni, ki je pomembna za interakcije protein-DNA. Mutacij v povezavi med domen ni bilo, saj te niso ključne za samo vezje.


== Zaključek ==

Načrtovana evolucija genetskih vezij je način optimizacije, ki je od racionalne optimizacije veliko hitrejši in učinkovitejši. Omogoča nam generacije večjega števila možnih mutant, ki jih lahko nato karakteriziramo in izberemo najboljšega. Bistvena prednost je tudi to, da za optimizacijo ni potrebno poglobljeno poznavanje vsakega elementa v vezju. 


== Viri  ==
 <references/> 
----
[[Seminarji SB 2016/17]]