View source for Načrtovanje in razvijanje sintetičnih mikrobnih celičnih platform za pridobivanje bioenergije

== '''Uvod''' ==
Naraščajoče zanimanje po pridobivanju energije iz obnovljivih virov se odraža tudi na področju sintezne biologije. Manipulacija mikroorganizmov z namenom pridobivanja metabolnih produktov, ki bi služili kot vir energije, postaja eden izmed pomembnih gradnikov nove biodobe. Naloga sinteznih biologov je ustvarjanje mikroorganizmov z minimalnimi genomi, ki omogočajo kar se da učinkovito pretvorbo biomase v želeni metabolit z visoko energijsko vrednostjo. Pogosto izbrišejo gene oziroma skupine genov, ki porabljajo energijo za neželene stranske reakcije ter dodajo module, ki omogočajo funkcije, ki pripomorejo k produkciji bioenergenta. To so najpogosteje razgradni encimi, transporterji za privzem ogljika, fotosintetski sistem, sistem fiksacije CO2 itd [1,2]. 
Prednosti napram fosilnim gorivom so trajnost, obnovljivost in odsotnost ogljikovih emisij. Najšibkejše točke so izjemno nizki donosi tovrstnih sistemov, dragi substrati in pogosta inhibicija mikroorganizmov s produktom. Uporabnost je seveda širša – možne so aplikacije v farmacevtski industriji, bioremediaciji, za biosenzorje in v biorafinerijah. Do sedaj znana biogoriva, ki so jih pridobili na ta način so etanol, biodizel, butanol, terpenoidi, singas in vodik [1,2]. 
Napredek na tem področju ne gre pripisati le sinteznim biologom temveč tudi genomski in sistemski biologiji. Ključ do uspeha pri načrtovanju in manipuliranju mikroorganizmov za proizvodnjo biogoriv je dobro razumevanje metabolnih poti. Predvsem njihovo obnašanje v odvisnosti od raznolikih okoljskih pogojev. Energetska bilanca celice je osnovnega pomena za dobre izkoristke in visoko produktivnost. Nanjo pa vplivamo ravno preko preurejanja metabolnih poti [1].

== '''Strategije načrtovanja in razvoja celičnih tovarn''' ==
'''Minimalne celice''' so sestavljene le iz komponent, ki so nujne za delovanje osnovnih procesov. Pri konstrukciji tovrstnih celic ločimo dva pristopa – od »zgoraj navzdol« preko redukcije bakterijskega genoma ''in vivo'' ter pristop od »spodaj navzgor« z integracijo ključnih delov celice ''in vitro''. Reduciranje genomov pogosto prinese tudi nepričakovane lastnosti, ki lahko pomenijo prednost. Pri določenih sevih so opazili povišano učinkovitost elektroporacije. Poleg tega se lahko izboljšajo še prilagoditve na strese iz okolja (toplotni, solni, antibiotiki itd.). Z reduciranjem odvečnih oz. stranskih reakcij v neki metabolni poti lahko pridemo do višjih izkoristkov pri pridobivanju želenega produkta. Torej odstranitev nepoglavitnih genov lahko privede do višje ekonomske vrednosti določenega procesa. Vsekakor mora biti takšen sistem funkcionalno stabilen in predvidljiv. Za dosego tega pa moramo močno poglobiti svoje znanje o osnovah kompleksnosti delovanja celic. Na področju ustvarjanja sintetičnih celic je najvidnejši pečat pustil Inštitut J. Craiga Venterja iz ZDA [1,3].

'''Forward engineering''' (pristop od »zgoraj navzdol«) – visok napredek tehnologije določevanja zaporedij je prinesel velike količine podatkov o mikrobnih genomih. Tovrstne informacije nam omogočajo razumevanje razlik med mikroorganizmi in molekularne osnove njihovih evolucijskih prilagoditev na okolje. Razvoju tehnologije sekvenciranja pa mora slediti tudi razvoj računalniških metod, ki nam omogočajo kvalitetno analizo podatkov ter njihovo vrednotenje. Tako lahko spoznamo, katere genetske lastnosti oziroma spremembe vodijo do sprememb v metabolizmu mikroorganizma, kar mu prinese zmožnost preživetja v drugačnem okolju. Ključni mehanizem naj bi bila izguba genov ali njihova duplikacija. Na ta način lahko s podrobnim preučevanjem pridemo do genov, ki so ključni za preživetje mikrobov [1,4]. 

Želimo si razumeti tiste minimalne mikroorganizme, ki so sposobni preživeti. Tako lahko razumemo ključne stopnje v metabolizmu, ki so neposredno povezane s preživetjem in prilagajanjem na okoljske spremembe. S tega vidika so zagotovo najzanimivejše arheje, ki lahko preživijo ekstremne pogoje, čeprav imajo genome manjše od 2 Mb. Tovrstni mikroorganizmi (npr. ''M. genitalium'') bi lahko služili za izgradnjo genomsko minimziranih platform. Najprej si želimo določiti nepogrešljive sete genov – tiste, ki omogočajo preživetje celic. Naslednji korak je določitev, kateri geni prispevajo k višji produktivnosti in kateri ne, ali pa delujejo celo nasprotno. Najosnovnejši geni, ki so potrebni za delovanje, so tisti, ki zapisujejo za komponente, ki so udeležene pri DNA replikaciji, transkripciji in nadaljnji translaciji. Poleg teh pa so pomembni še proteini udeleženi pri zvijanju proteinov ter metabolizmu mikroorganizmov. Pri tem so najpomembnejši seti genov, ki skrbijo za membranski transport, energetske procese, sintezo vitaminov ter prekurzorjev nukleinskih kislin. Sledi rekonstrukcija genoma, ki ga sintetizirajo iz oligonukleotidov. Nato te reducirane genome vnesejo v prejemniško celico [1,3].

Do redukcije genoma lahko pridemo preko deletiranja genov, ki so posamično gledano pogrešljivi. Pri tem se moramo zavedati, da lahko različne kombinacije takih genov privedejo do letalnosti, zato je zaradi slabega razumevanja kompleksnosti tovrsten pristop lahko težaven. Drugi pristop se osredotoča na gene, ki skrbijo za metabolizem malih molekul, ki so hranila za celice. Taki geni so v bakteriji ''M. genitalium'' večinski, zato bi z njihovim reduciranjem prišli do resnično skrčenih genomov. Preživetje celic pa bi zagotovili z dodajanjem hranil v gojišče [3]. 

Celice, ki so sestavljene tako, da vsebujejo minimalno število genov – torej le tiste, ki so nepogrešljivi za normalno delovanje celice – predstavljajo osnovo pri razvoju biotehnološko uporabnih sevov. Vsekakor pa je izjemnega pomena odkrivanje nepoglavitnih  genov, saj lahko z njihovo karakterizacijo razumemo, kako pride do razvoja dodatnih funkcij v posameznih mikroorganizmih. Te funkcije pogosto prinašajo določene preživitvene prednosti. Redukcije genoma do 30 % so celicam prinesle dobro preživetje, genomsko stabilnosti, povišano rast in zvišano produkcijo rekombinantnih proteinov. Prav tako v takih sistemih ni RNaz, proteaz, inkluzijskih telesc, čiščenje produkta je lažje, lažja pa je tudi kontrola reakcijskih pogojev. S celostnim razumevanjem posameznega mikroorganizma lahko izberemo pravilen pristop pri minimiziranju genomov in ustvarjanju minimalnih umetnih celičnih platform za uporabo v biotehnologiji [1,3].

'''Reverse engineering'''  (pristop od »spodaj navzgor«) – pri tem pristopu gre za ''in vitro'' konstruiranje sintetičnih celic preko združevanja osnovnih bioloških makromolekul, njihovih genov in malih substratnih molekul. Na ta način se lahko znebimo nepomembnih in nepoznanih genov. Sistem lahko predhodno spreminjamo in nastavljamo po svojih željah, vse komponente pa so natančno določene. Nujno potrebne komponente so DNA, ki nosi zapise za želene gene, encimi, ribosomi, tRNA molekule in nizkomolekularne molekule, ki so potrebne za sintezo ostalih komponent. Želimo si določiti poglavitne gene in pripraviti očiščene delujoče biokemijske podsisteme. Te nato združimo, da dobimo samostojno podvojujoč sistem, ki ga nato inkapsuliramo v membrano. Vsekakor gre za izredno zahteven proces, ki je poln izzivov. Do danes je raziskovalcem uspelo ustvariti umetne modele celic, ki so sposobni sintetizirati proteine. Naslednji korak je priprava samopodvojujočega sistema ter nadaljnje ustvarjanje kolonij [3,4].  

Z različnimi pristopi – uravnavanje metabolnega fluksa, vnašanje novih poti ali delecija obstoječih – dosegajo boljšo produktivnost in energetsko učinkovitost procesov. Pri tem pomembno vlogo igrata poraba substrata ter odsotnost inhibicije s produktom. Pomembno je razumevanje prenosa energije in pomen respiratorne verige v odnosu na centralni metabolizem. Pri vnašanju zunanjih oz. novih metabolnih poti moramo poskrbeti, da so le-te skladne z že obstoječimi in predvsem s centralnim metabolizmom. Le tako lahko izboljšamo kinetiko metabolnih encimov ter posledično maksimiziramo metabolni fluks. Pri odkrivanju novih metabolnih encimov in poti nam močno pomagajo nove tehnike (GWAS) in tehnologije sekvenciranja. Računalniško modeliranje novonastalih metabolnih poti nam lahko služi kot dobra podlaga pri načrtovanju procesov produkcije biogoriv [1,2]. 

Različne tehnike genomskega manipuliranja in nadaljnje selekcije mikroorganizmov z želenimi lastnostmi so nam omogočile razvoj biotehnologije. Ena izmed takšnih je MAGE (''angl.'' multiplex automated genome engineering) – večlokusno avtomatizirano manipuliranje genoma. Ta visokozmogljivostna tehnika omogoča modificiranje (insercije/delecije/mutacije) genoma istočasno na več lokusih. S tem dosežemo veliko genomsko raznovrstnost preko rekombinacije z enoverižnimi oligonukleotidi. Ti so dolgi do 90 bp in se na obeh koncih ujemajo v 20-35 bp. Tehnika nam prav tako omogoča zamenjavo kodonov v celotnem genomu ''in vivo''. Nadalje lahko spreminjamo moč promotorjev, RBSov in vplivamo na regulatorne gene. MAGE temelji na inaktivaciji mehanizma popravljanja neujemanja ter lambda rdečega rekombinaznega sistema. Lahko uvedemo mutacije ter insercije do 30 bp in kromosomske delecije do 45 kbp [6]. 

Osnovni cilj je optimizirati energijski metabolizem celice. Pomembno je vedeti, ali lahko selektivno izbrišemo alternativne poti prenosa energije in ali so minimalni genomi resnično koristni za energetsko učinkovitost mikroorganizma. Kontrola in modulacija respiratornih lastnosti mikroorganizmov je lahko ena izmed učinkovitih strategij pri uravnavanju metabolnega fluksa celic. Le-tega lahko uravnavamo na ravni transkripcije, translacije ali celo na nivoju posttranslacijskih reakcij. Fluks lahko spreminjamo preko števila kopij določenega gena – bodisi število integriranih kopij v genomu ali preko števila kopij izbranega vektorja. Spreminjamo lahko moč (šibek/močan) in naravo (konstitutiven/inducibilen) promotorja, ravno tako lahko vplivamo na uspešnost terminacije transkripcije s sintetičnimi terminatorji. Metabolne poti lahko uravnavamo tudi na ravni translacije preko stabilizacije mRNA. Vplivamo lahko tudi na moč RBSov in na encimsko stabilnost preko peptidnih oznak, ki vplivajo na razgradnjo  [1,2]. 

'''Produkcija biogoriv na osnovi biomase z modificiranimi mikroorganizmi''' – čeprav se še vedno trudimo z izboljšavami predvsem v ekonomski in energetski upravičenosti tovrstnih sistemov, so znanstveniki že razvili nekaj obetajočih procesov za pridobivanje biogoriv. Trenutno je najbolj uporabljen pristop pri manipulaciji metabolnih poti gostitelja z vstavitvijo posameznega encima ali celotnega modula metabolne poti. Ko govorimo o celičnem metabolizmu, ga v grobem razdelimo na metabolizem preživetja (prehrane) celice ter proizvodni metabolizem. Mikrobne poti pri produkciji biogoriv so preko nefermentativnih alkoholov, celuloze, maščobnih kislin, izoprenoidov, fotosinteze s fiksacijo ogljikovega dioksida in fermentativnih alkoholov [1,2].

== '''Zaključek''' ==
Izreden razmah v obsegu genomskih informacij nam omogoča nova spoznanja o delovanju številnih mikrobnih metabolnih poti. Na ta način jih lažje razumemo in preurejamo v našo korist. Tako so znanstveniki prišli na idejo, da bi ustvarili umetne celične tovarne iz posameznih modulov, ki predstavljajo različne metabolne poti. Le-te bi sestavili v delujočo celoto za proizvodnjo biogoriv. Tu gre sintezna biologija močno nad principe manipuliranja posameznih genov ali skupkov le-teh. Njen cilj je ustvarjanje življenja iz obstoječih gradnikov – bioloških naprav, ki se povezujejo v module, ti pa ustvarjajo zapleteno mrežo, ki omogoča delovanje celice. Gradnja posameznih bioloških delov po principu lego kock pa je vse prej kot lahka naloga, saj se lahko posamezni gradniki obnašajo precej raznoliko glede na različne kombinacije gradnikov, pogoje ter gostitelje. Takšne mreže so vse prej kot predvidljive, njihova kompleksnost pa je trenutno nad našim razumevanjem. V prihodnjih letih znanstvenike na tem področju zagotovo čaka še precej dela [7,8,9].

== '''Literatura''' ==
[1] – Sang L. J. ''in sod''. Design and development of synthetic microbial platform cells for bioenergy. ''Frontiers in microbiology'', 2013, letn. 4(92), str. 87-99.

[2] – Peralta-Yahya P. P. ''in sod''. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. ''Nature'', 2012, letn. 488, str. 320-328.

[3] – Jewett C. M. in Forster C. A. Update on designing and building minimal cells. ''Current Opinion in Biotechnology'', 2010, letn. 21, str. 697-703.

[4] – Gonzalez A. in Knight R. Advancing analytical algorithms and pipelines for billions of microbial sequences. ''Current Opinion in Biotechnology'', 2012, letn. 23, str. 64-71.

[5] – Stano P. in Luisi L. P. Semi-synthetic minimal cells: origin and recent developments. ''Current Opinion in Biotechnology'', 2013, letn. 24, str. 633-638.

[6] – Singh V. in Braddick D. Recent advances and versatility of MAGE towards industrial applications. ''Syst Synth Biol'', 2015, letn. 9, str. S1-S9.

[7] – Schwille P. Bottom-up syntetic biology: engineering in a tinkerer's world. ''Science'', 2011, letn. 333, str. 1252-1254.

[8] – Andrianantoandro E ''in sod''. Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline. ''Molecular Systems Biology'', 2006, str. 1-14.

[9] – Kwok R. Five hard truths for synthetic biology. ''Nature'', 2010, letn. 463, str. 288-290.