View source for Nekodirajoča regulatorna RNA pri arhejah

== Uvod ==

Ne kodirajoča regulatorna RNA(ncRNA) ali tudi poimenovana majhna RNA(sRNA) je prisotna v vseh domenah življenja. V bakterijah in evkariontih je že dobro raziskana in opravlja naloge transkripcijske regulacije, replikacije kromosomov, procesiranja RNA in njene modifikacije, mRNA stabilnosti in translacije in tudi degradacije in translokacije protinov. 

V evkariontih je bilo najdeno več različnih vrst sRNA. Med njimi najbolj raziskana je mikroRNA(miRNA), ki regulira ekspresijo proteinov v ključnih celičnih procesih. Te so dolge 20–30 nt in tvorijo komplekse z argonavtskimi proteini, katerih homologe najdemo tudi v arhejah, a imajo drugačno funkcijo in ni dokazov za podobno interakcijo z sRNA. 

V bakterijah so sRNA ponavadi dolge od 50 do 300 nt in delujejo na mRNA translacijo in stabilnost ali se vežejo na proteine. Poznamo dva tipa glede na način vezave baz na tarčne mRNA: Cis-kodirano protismerno RNA(asRNA) in Trans-kodirano protismerno RNA ali tudi intergenska sRNA(itsRNA). asRNA so kodirane na DNA nasprotni svojem tarčnem genu. Njihova funkcija je represija transpozonov in sinteze strupenih proteinov ter modulirajo ekspresijo transkripcijskih regulatorjev. itsRNA pa so kodirane na lokacijah stran od gena svoje tarčne mRNA, kot so intergenske regije. itsRNA se vežejo le z delno komplementarnostjo na 5′ ali 3′ konec mRNA in blokirajo vezavo ribosomov ali sprožijo degradacijo mRNA. Preko vezave na več tarčnih genov in ključnih transkripcijskih faktorjev ter regulatorjev lahko itsRNA modulira ekspresijo velikih regij DNA.
 
V arhejah pa so funkcije in mehanizmi sRNA še slabše razumljene. Velikost arhejske sRNA je od 50 do 500 nt. Več vrst sRNA so našli tudi v arhejah, med njimi tudi asRNA in itsRNA, podobne tiskim ki jih najdemo v bakterijah. V tem povzetku se bomo fokusirali na te dve vrsti sRNA. Najprej bomo pogledali, kakšne metode se uporabljajo za detekcijo arhejskih sRNA in katere smo našli v arhejah do zdaj. Potem bomo razložili mehanizme delovanja nekaterih raziskanih arhejskih sRNA in pogledali s katerimi molekulami sRNA interagira. Na koncu bomo pogledali še prihodnost arhejskih sRNA raziskav.

== Metode odkrivanja sRNA ==

Na začetku so se za identifikacijo sRNA zanašali na bioinformacijske analize celotnega genomska zaporedja arhej. 

Danes se uporabljajo metode sekvenciranja RNA(RNA-seq), ki omogočajo merjenje genske ekspresije, anotacijo mej transkripcije in operonov, poleg tega pa identifikacijo sRNA in protismernih RNA. Tako lahko karakteriziramo celoten set transkriptov v celici in njihovo količino v določenem razvojnem nivoju ali fiziološkem stanju. Temu rečemo tudi transkriptom.  V ospredju so vse metode, ki izkoriščajo visoko globino sekvenciranja in visoke zmogljivosti Illumina tehnologij. Globina sekvenciranja opiše celotno številom branj pridobljeno od visoko zmogljivega sekvenciranja, te številke so v milijonih. Glavni metodi sta diferencialno RNA sekvenciranje(dRNA-seq) in velikostno-določeno,  verigo-specifično sRNA sekvenciranje(sRNA-seq).

dRNA-seq omogoča identifikacijo globalnih začetnih transkripcijskih mest na resoluciji nukleotida, s selektivno obogatitvijo primarnih transkriptov, a ta metoda ne pove nič o dolžini sRNA.

Posebej modificirana metoda sRNA-seq protokola je bila uporabljena za verigo-specifično globoko sekvenciranje na tisoče sRNA v H. volcanii. S to metode lahko zaznamo celotno dolžino sRNA, prepoznamo če so asRNA ali itsRNA in potencialne tarče teh sRNA.

Glede bioinformacijskih analiz pa še ni bila narejena nobena specifična metoda za identifikacijo podatkov sRNA-seq v arhejah.

== Identifikacija arhejske sRNA ==

Naše znanje o sRNA v arhejah je omejeno le na nekaj raziskav hipertermofilov, metanogenov in haloarheona Haloferax volcanii. 

Haloarheoni so halofilne haloarheje, ki jih najdemo v raztopinah z visoko koncentracijo soli. Najbolj presenetljivi raziskavi sta bili narejeni na H. volcanii. Te mikroorganizmi so izjemno odporni na visoke nivoje oksidativne stresa, ki jih povzročajo zunanji pogoji. S škodo povzročeno zaradi oksidativnega stresa se spopadajo z različnimi mehanizmi, a bistveno za robustnost teh procesov je najverjetneje genska regulacija preko transkripcijskih faktorjev in sRNA. Konstrukcije genskih mutantov z izbrisanimi geni za znana sRNA zaporedja je pokazala pomembnost le teh za veliko bioloških funkcij.

Z sRNA-seq so našli več kot 2900 sRNA v tej arheji, katere genom kodira le 4000 proteinov. Iz teh dveh raziskav je jasno, da je velik delež RNA pravzaprav nekodirajoče. Bilo je identificiranih 1500 asRNA in 400 itsRNA, torej jih je večina protismernih. Kar 30 % sRNA je vsebovala bazalne transkripcijske promotorje, kot je škatla TATA in so kazali podobne ekspresijkse nivoje tem od mRNA, kar kaže njihovo pomembnost pri globalni regulaciji genskih omrežij. V arhejah kot v bakterijah so števila itsRNA v merilu stotih in je potrebno več dela za validacijo in karakterizacijo njihovih vlog.

V manjših številkah so bile sRNA najdene tudi v drugih vrstah arhej. V Sulfolobus solfataricus so našli 185 asRNA in 125 itsRNA, kar predstavlja 6.1% njenega genoma.

== Protismerne RNA==
sRNA regulatorji imajo mnoge znane prednosti, kot npr. znižanje metabolnih potreb, dodatni načini regulacije celičnih procesov in hitrejši odziv na stres – celični odziv se lahko zazna že po minutah. Protismerne sRNA – največja skupina sRNA regulatorjev - so v arhejah zapisane na nasprotni verigi DNA, kot njihova tarča. Pokazano je bilo, da imajo v nekaterih arhejah vlogo v regulaciji železa, transkripciji, mobilnosti transpozonov, peptidazni aktivnosti… Mnogo poznanih mehanizmov regulacije protismernih RNA v arhejah prihaja iz raziskav na H. Volcanii pod povišanim oksidacijskim stresom, kjer je bilo pokazano, da se protismerne RNA izražajo povečano ali zmanjšano in se lahko posledično njihovi tarčni geni bolj izražajo ali pa utišajo.
Kljub odkritju čez 1000 arhejskih sRNA v arhejskih transkriptomih, je njihovo poznavanje večinoma še slabo raziskano. Pri Haloferax volcanii je bilo pokazano, da je večina sRNA protismernih. Od teh pa se največ prekriva s kodirajočim zaporedjem mRNA, manj prekriva 3' neprevedeno regijo, še manj pa 5' neprevedeno regijo. Pri bakterijskih in evkariontskih sRNA se le te z mRNA povezujejo na mestih imenovanih semenske (seed) regije, ki pa jih pri arhejah ne najdemo in je predvidevano, da se sRNA povezujejo z mRNA po celotnem kodirajočem zaporedju. Nekateri kompleksi CDS-sRNA pa lahko tvorijo sekundarne strukture pri čemer se povežejo le z delom kodirajočega zaporedja in tu pride do nastanka delne semenske regije. 

==Intergenske sRNA==
Pri protismernih RNA ni težko ugotoviti njihovih tarč, saj se delno prekrivajo z njihovim zaporedjem. To pri intergenskih sRNA ne drži in se iskanje tarč lahko izkaže kot precej velik izziv. Posledično so mehanizmi delovanja intergenskih sRNA manj raziskani.
Pri študijah nekaterih arhej v okolju z nizko količino dušika so opazili različno količino izraženih sRNA kot odgovor na prisotnost dušika. sRNA154  se je izražala le v pomanjkanju dušika in je delovala na mRNA za alfa podenoto nitrogenaze, nif operon in glutamin sintazo 1 in 2. Zanimivo je bilo, da je nekatere mRNA stabilizirala, druge pa inhibirala in tako igrala dvojno regulatorno vlogo v procesu translacije. sRNA154  je dobro ohranjena in pokazano je bilo, da v nekaterih drugih arhejah tvori stabilne sekundarne strukture. Predlagano je bilo, da se poveže z mRNA in tako prekrije endonukleazna mesta in tako ohrani mRNA za translacijo. Hkrati pa sRNA154 vsebuje zaporedja, ki otežijo vezavo na ribosom in posledično lahko s tem tudi utiša translacijo tarč. 
Ob pomanjkanju dušika se zniža izražanje tudi sRNA41. Njene tarče sodelujejo v acetil-CoA sintaznih kompleksih, ki so navadno utišani na transkripcijskem nivoju. Ker pa se je znižala raven sRNA41 pa se je povišala količina izraženih acetil-CoA sintaznih kompleksov in posledično količina aminokislin za sintezo nitrogenaze. Predlagan mehanizem je bil, da sRNA41 prekrije vezavna mesta za ribosome v policistronski mRNA. 

==Zaključek==
Do zdaj je še vedno raziskanih relativno malo funkcij arhejskih sRNA.  Identifikacija tarč je pri sRNA zahtevna, sploh pri intergenskih sRNA, zaradi delnega parjenja z več tarčami. Pri arhejah tudi še nimamo razvitih sistemov za identifikacijo RNA-RNA dupleksov in vivo za razliko od bakterijskih in evkariontskih sistemov, kjer se za to uporabljajo MS2 lasnice (MAPS) in psoralen prečno povezovanje (SPLASH). In vitro pa je možno sRNA izolirati z obarjanjem s protitelesom in proteinom Lsm, ki je arhejski homolog bakterijskega Hfq, a njegova funkcija v celici še ni znana. 
Vlogo v regulaciji mRNA v arhejah igrajo tudi ribonukleaze, kot npr. arhejski poliadenilacijski specifični faktor in druge RNAze, zaradi česar se je potrebno vprašati, če sodelujejo tudi pri regulaciji s sRNA. Nekatere arheje imajo na mRNA zelo kratko 5' neprevedeno regijo iz česar lahko sklepamo, da ta ne nosi informacij za iniciacijo translacije ali razpada transkripta. Pri teh arhejah se na 5' neprevedeno regijo veže le malo sRNA in se informacije za sRNA regulacijo nahajajo na 3' koncu. Ker se v arhejah večina asRNA poveže s kodirajočimi zaporedji mRNA to lahko pomeni, da je prisotna endoribonukleaza – tako lahko sRNA zaščiti mRNA s prekrivanjem vezavnega mesta ali pa se zaradi vezave sRNA približa endonukleaza, ki razgradi transkript. 

== Viri ==

1. Gelsinger, Diego Rivera, and Jocelyne DiRuggiero. “The Non-Coding Regulatory RNA Revolution in Archaea.” Genes 9, no. 3 (March 2018): 141. https://doi.org/10.3390/genes9030141.

2. Gelsinger, Diego Rivera, and Jocelyne DiRuggiero. “Transcriptional Landscape and Regulatory Roles of Small Noncoding RNAs in the Oxidative Stress Response of the Haloarchaeon Haloferax Volcanii.” Journal of Bacteriology 200, no. 9 (April 9, 2018): e00779-17. https://doi.org/10.1128/JB.00779-17.

3. Buddeweg, A.; Sharma, K.; Urlaub, H.; Schmitz, R.A. sRNA41 affects ribosome binding sites within
polycistronic mRNAs in Methanosarcina mazei Gö1. Mol. Microbiol. 2017. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29271512/

4. Jäger, D.; Sharma, C.M.; Thomsen, J.; Ehlers, C.; Vogel, J.; Schmitz, R.A. Deep sequencing analysis of the
Methanosarcina mazei Go1 transcriptome in response to nitrogen availability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009,
106, 21878–21882. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19996181/


[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]