View source for Obliž iz biorazgradljive plastike, proteinov pajkove svile in bakteriocinov

<h2>Uvod</h2>

Cilj danske ekipe z University of Southern Denmark je bil izdelati obliž, ki bi bil sestavljen iz biorazgradljive plastike in proteinov pajkove mreže, na katere bi bili vezani antimikrobni peptide, ki bi zagotavljali zaščito pred infekcijami. Biorazgradljiva plastika vrste poli-β-hidroksibutirat (PHB) zadržuje vlago, proteini pajkove svile so se v predhodnih raziskavah že izkazali kot snovi, ki ugodno vplivajo na celjenje ran, bakteriocini pa bi lahko nadomestili antibiotike-.

Projekt so razdelili na tri glavne dele.
1. Testiranje antimikrobnih efektov nekaterih baktericidnih peptidov na patogene bakterije.
2. Priprava konstrukta za sintezo proteinov pajkove mreže v bakterijah
3. Optimizacija proizvodnje PHB (poli-β-hidroksibutirata), uporaba PHB kot materiala za 3d-tiskanje

<h2>1. Testiranje antimikrobnih efektov nekaterih baktericidnih peptidov na patogene bakterije</h2>

Bakteriocini so antimikrobni peptidi, katere izdelujejo nekatere vrste Gram-pozitivnih in Gram-negativnih bakterij. Lahko so širokega ali ozkega spektra, lahko imajo bakteriostatičen ali bakteriociden učinek. Delujejo tako, da se vežejo na določene receptorje na površini bakterijske celice in s tem povzročijo nastanek por na celični membrani, preko katere iz bakterijske celice uhajajo hranilne snovi. 
Člani ekipe so zapise za bakteriocine najprej vstavili v vektor pXTB1 in jih izrazili v celicah E. coli, nato pa jih izolirali in očistili. Vektor pXTB1 vsebuje zapis za hitin-vezavno domeno, kar omogoča preprosto izolacijo z afinitetno kromatografijo. Tako so izrazili in očistili bakteriocine laterosporulin, turicinS, lakticinQ, piocinS5 ter fuziji laterosporulin-turicinS in lakticinQ-lakticinZ. S temi bakteriocini so izvedli teste minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) na bakterije vrst S. aureus seva MRSA:CC398 (sev, odporen na tetraciklin in meticilin) in USA300, ter Hetero-VISA in P. aureginosa:PAO1.
Rezultati so bili primerljavi z delovanjem antibiotikov. Za najbolj učinkovitega se je izkazal hibrid lakticinQ-lakticinZ, s tem da je bil bolj učinkovit proti sevom S. aureus kot P. aureginosa. Nato so sestavili še biokocke z zapisi za omenjene bakteriocine.

<h2>2. Priprava konstrukta za sintezo proteinov pajkove mreže v bakterijah</h2>

Po definiciji je svila proteinski polimer, ki se združuje v vlakna, pri organizmih kot so pajki, metulji, itd. Za tovrstne strukture je značilno, da se primarno zaporedje ponavlja in je zato tudi sekundarna struktura homogena, značilni so npr. trojni heliksi ali beta ploskve. Znano je tudi, da imajo komponente svile pozitiven učinek na celjenje ran. Pri projektu so za pripravo konstrukta za sintezo pajkove svile želeli uporabiti kodirajoče zaporedje genov MaSP1 in MaSP2, ki sta komponenti pajkove svile pri vrsti zlati mrežar (Nephila clavipes). MaSP gen sestoji iz 25 ponovitev polialaninskih in poliglicinskih zaporedij. Ker je vstavljanje ponavljajočih se sekvenc samo po sebi težavna naloga, so poskusili z uporabo protokola, s katerim je ekipa UCLA leta 2015 uspela proizvesti proteine pajkove svile v bakterijah. 
Uporabili so fragmente genov MaSP, posamezen fragment je predstavljal eno poanvljajoče se zaporedje. Vsak fragment so ligirali v svoj plazmid pSBIC3, uspešnost ligacije in transformacije bakterij so potrdili s colonyPCR-om. 
Za sestavljanje fragmentov genov MaSp pa so uporabili metodo ICA (iterative capped assembly), ki je uporabna zlasti za sestavljanje konstruktov ponavljajočih se zaporedij. Princip te metode je, da fragmente, ki jih želimo zlepiti in ki vsebujejo ustrezne štrleče konce, v reakcijsko mešanico dodajamo enega za drugim in postopno izvajamo ligacijo. Kot nosilce uporabimo magnetne kroglice, kar omogoča preprosto izolacijo in čiščenje vmesnih produktov. Na nosilec je vezan streptavidin, začetni oligonukleotid pa je na 5'-koncu biotiniliran in je preko povezave med streptavidinom in biotinom imobiliziran na nosilec. Temu imobiliziranemu začetnemu oligonukleotidu, ki ima na 3'-koncu štrleč konec, v reakcijsko mešanico dodamo fragment, ki ima na svojemu 5'-koncu štrleč konec, ki se ujema s tistim na začetnemu oligonukleotidu, in izvedemo ligacijo. Nato z magnetom nosilec odstranimo iz mešanice, ga očistimo in ponovimo ligacijo z naslednjim fragmentom. Na koncu dodamo še terminatorsko regijo z ustreznimi lepljivimi konci, ki omogoča ligacijo v želeni vektor. Poleg nizanja repetitivnih fragmentov je možno vmes vstaviti tudi fragmente drugih genov. Na ta način je ekipa želela sestaviti konstrukte, ki bi vsebovali niz genskih fragmentov pajkove svile in bakteriocinov, 
Pripravili so fragmente z ustreznimi štrlečimi konci. Najprej jim je z metodo ICA uspelo povezati po dva fragmenta, nato pa še par fragmentov v četvorček. Nadaljnje ligacije žal niso uspešne in tako niso dosegli svojega cilja, ki je bil ustvariti monomere 12 fragmentov in jih povezati še z bakteriocini, ki so jih tudi pripravili v obliki fragmentov s konci, ki bi se morali prekrivati s fragmenti MaSP. Izkazalo se je, da so bili poskusi najverjetneje neuspešni, ker je magnetom z nosilcem že potekel rok trajanja in na njih ni bilo vezanega skoraj nič streptavidina več.

<h2>3. Optimizacije sinteze PHB</h2>

Poli-β-hidroksibutirat, na kratko PHB, je poliester, ki ga proizvajajo nekatere vrste bakterij, katerim služi kot vir ogljika in je torej biorazgradljiv. Ima podobne lastnosti kot polivinilklorid in polietilen, ki se uporabljata proizvodnjo obližev in bi zato bil primerno nadomestilo. Za sintezo PHB v celicah so odgovorni produkti genov operona phaCAB, to so encimi β-ketotiolaza, acetoacetil-CoA reduktaza in PHB-sintaza. Biosinteza PHB poteka tako, da najprej β-ketotiolaza katalizira kondenzacijo dveh molekul acetil-CoA in nastane acetoaceti-CoA. Acetoacetil-Coa reduktaza ga reducira v hidroksibutiril-CoA, PHB-sintaza pa katalizira nastanek estrske vezi med dvema hidroksibutiril- skupinama, odcepi se HS-Coa.. 
Ekipa je optimizirala proces pridobivanje PHB v E. coli v več korakih. Najprej so pripravili konstrukte, ki so vsebovali dodaten promotor in RBS, ter primerjali, katera kombinacija je najbolj učinkovita. Količino proizvedenega PHB v celicah so ocenili tako, da so celice barvali z barvilom nilsko rdeče in s pretočnim citometrom določili intenziteto obarvanja. Izkazalo se je, da sam dodatni promotor nima posebnega vpliva na količino PHB, pač pa, da dodatek srednje močnega RBS močno vpliva na količino fluorescence, torej količino PHB v celici. 
Proizvodnjo PHB so poskusili povečati še tako, da so konstruktom dodali zapis za encim pantotenat kinazo II, na kratko panK. PanK je prvi encim v biosintezni poti koencima A, ki je substrat za sintezo PHB, torej bi celice s tem konstruktom morale proizvajati več koencima A, posledično več PHB. Izvedli so analizo proteoma celic, ki so vsebovale ta konstrukt in izkazalo se je, da se ob prisotnosti panK v celici dvigne koncentracija trioza fosfat izomeraze, fosfoglicerat kinaze in piruvat kinaze, torej treh proteinov, udeleženih v glikolizo, vpliva pa še na nekatere druge metabolne proteine. Povečana koncentracija teh proteinov nakazuje na povečanje porabe energije v celici, ki jo sproži pantotenat kinaza.
Nato so preizkusili več metod za ekstrakcijo PHB, in sicer razgradnjo celic s hipokloritom, s hipokloritom ob dodatku tritona X-100. V tem primeru hipoklorit uniči celične komponente, PHB pa ostane.  Poskusili so še ekstrakcijo z dvema topiloma, v katerih je PHB topen in sicer z etil acetatom in s kloroformom. Izkoristek ekstrakcij so ocenili tako, da so s plinsko kromatografijo določili količino PHB v celicah. Izkazalo se je, da je največji izkoristek dala izolacija s hipokloritom. S protonskim NMR so preverili, pri katerem postopku je bil produkt najbolj čist. Najbolj čist produkt so izolirali s kloroformom, vendar je bil optimalen način vendarle ekstrakcija s hipokloritom, saj je bil izkoristek velik, nečistoč pa je bilo malo.
Zaradi lažje ekstrakcije in čiščenja pa so se nato namenili pripraviti sistem, ki bi omogočal izločanje PHB v okolico. Pri tem so se poslužili poti izločanja toksina hemolizina. Hemolizin A je toksin, ki se iz celic izloča s pomočjo transmembranskih proteinov hemolizina B in D. Da pa bi hemolizin A lahko iz celice odvajal PHB, so pripravili fuzijo hemolizina A in fazina, ki se veže na PHB in regulira dolžino polimerov. Sistem je deloval, saj so bili skupki PHB vidni na gojišču s prostim očesom. Želeli so ugotoviti, ali celice s konstruktom s hemolizinom lahko proizvedejo več PHB, vendar so bili rezultati teh poskusov nekonsistentni.
Končni konstrukt je torej vseboval hibridni promotor, operon phaCAB, hemolizinski sistem ter pantotenat kinazo. 
Primerjali so še hitrost rasti celic z vstavljenimi konstrukti v različnih gojiščih ter poiskali tistega, v katerem celice niso rasle prehitro. Za najprimernejšega se je izkazalo gojišče TB.
PHB, ki so ga proizvedli, so s pomočjo naprave FilaStruder oblikovali v niti, ki so jih lahko uporabili za 3D-tisk.

<h2>Povzetek</h2>

Če torej na kratko povzamemo projekt danske ekipe: ovrednotili so MIC različnih bakteriocinov in pripravili biokocke z zapisi za te bakteriocine, sestavili so konstrukt za optimizirano  proizvodnjo PHB v celicah, ni pa jim uspelo sestaviti proteinov pajkove svile z vgrajenimi bakteriocini.

<h2>Viri</h2>
Bacto-Aid (dne 09.01.2017) http://2016.igem.org/Team:SDU-Denmark