View source for P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe

S projektom "P.L.A.N.T - Plant-Based Ligand Activated Noxious agent Tracker" je skupina podiplomskih študentov Bielefeld-CeBiTec iz Nemčije leta 2021 sodelovala na tekmovanju iGEM in se uvrstila med deset najboljših.

Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:Bielefeld-CeBiTec

Avtorica povzetka: Tina Logonder

=='''Problem: odlagališča kemičnih orožij'''==
V Nemčiji se nahaja preko 200 odlagališč kemičnih orožij iz obeh svetovnih vojn. Orožja so bila odvržena nekontrolirano, zato lahko pride do uhajanja strupov v naravo, kar predstavlja grožnjo za zastrupitev ljudi in okolja. V projektu so predstavili rešitev tega problema – detekcija bojnih strupov s pomočjo rastlin [1].

=='''Cilj projekta'''==
Ideja je pripraviti rastline, ki bi se ob prisotnosti bojnih strupov v tleh obarvale iz zelene v rdečo. V okviru projekta so razvili specifične receptorje za bojne strupe, ki ob vezavi tarčne molekule sprožijo signalno kaskado. Aktivira se izražanje reporterskih proteinov, kar privede do sinteze rdečega barvila in obarvanja listov. To bi zagotovilo poceni in prilagodljiv detekcijski sistem za lokalizacijo ostankov kemičnih strupov. Sledilo bi zavarovanje kontaminiranega območja in odstranitev strupov iz okolja [1].

=='''Sintetična signalna kaskada'''==

Signalna kaskada za detektiranje bojnih strupov temelji na sistemu, ki omogoča zaznavanje okolijskih pogojev. Mehanizem je dobro ohranjen pri različnih vrstah in ga najdemo tako pri rastlinah kot pri bakterijah. Izbrali so sistem iz ''E. coli'', ki je vključen v kemotakso [1].
Prvi korak je vezava liganda na specifični receptor PBP (periplazemski vezavni protein), med katere spada tudi RBP (riboza vezavni protein). Pri tem pride do konformacijske spremembe, ki omogoči interakcijo s transmembranskim receptorjem Trg [2]. Na citoplazemski del receptorja se veže kinaza CheA, katere vezavo olajša konformacijska sprememba ob vezavi RBP na Trg [3]. Po vezavi liganda se aktivnost kinaze zniža, kar posledično zavira aktivnost CheB in CheY, ki sta regulatorja odziva [3]. Metilaza CheB je antagonist metilacijskega encima CheR. Ko CheR metilira Trg, je ta manj odziven na vezavo liganda. CheB zavrne to reakcijo in poveča občutljivost na ligand. Fosforilirani CheY se poveže z motornim proteinom bička in povzroči spremembo smeri gibanja bakterije. Inhibicija aktivnosti CheB in CheY po vezavi liganda omogoči stabilno plavanje vzdolž naraščajočega gradienta liganda [3].

Leta 1994 so konstruirali fuzijski protein Trz [4]. Sestavljata ga periplazemska in transmembranska domena receptorja Trg povezani s citoplazemskim delom histidin kinaze EnvZ preko domene HAMP [4, 5]. Trz je sposoben prepoznati RBP z vezanim ligandom in po interakciji z RBP fosforilirati transkripcijski faktor OmpR, ki inducira izražanje genov pod kontrolo promotorja OmpC [6]. Skupina Medford je ta pristop prenesla z bakterij na rastline [7].

=='''Računalniško zasnovani receptorji'''==
Ključen korak je bil razvoj receptorjev, ki specifično vežejo tarčno molekulo. Kot izhodni protein so si izbrali RBP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3900001 BBa_K3900001]). Z računalniškimi metodami so ustvarili funkcionalne in specifične receptorje, ki vežejo kemičnim orožjem podobne molekule, saj bi bilo delo z dejanskimi spojinami kemičnih orožij preveč nevarno in toksično. Benzen-1,3,5-trikarboksilna kislina (BTCA) je zaradi podobnosti v tridimenzionalni strukturi nadomestila uporabo strupenega eksploziva 2,4,6-trinitrotoluena (TNT). Za načrtovanje so uporabili program Rosetta v kombinaciji z EvoDock, ki temelji na evolucijskem algoritmu, kar je povečalo učinkovitost procesa načrtovanja [1].

=='''Reporter RUBY ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3900028 BBa_K3900028])'''==
Želeli so, da bi bil izhodni signal sistema viden s prostim očesom, in sicer kot obarvanje listov rastlin iz zelene v rdečo [1]. Listi rastlin so večinoma obarvani zeleno, lahko pa rastline sintetizirajo tudi veliko različnih barvitih pigmentov. Za vzpostavitev novega reporterskega sistema RUBY so si izbrali pigment betacianin (betalain) [7, 8]. Za njegovo sintezo iz tirozina so potrebni trije encimi: (citokrom P450, DODAα in glikozil transferaza). Kodirani so v enem odprtem bralnem okviru in ločeni s peptidi 2A, kar omogoča samocepitev fuzijskega proteina [9].

=='''Vektorji signalne kaskade'''==

Za testiranje v ''Escherichia coli'' so uporabili vektor pSB1C3 z genom za odpornost na kloramfenikol ([http://parts.igem.org/Part:BBa_P1003 BBa_P1003]). Gena za Trz ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K216004 BBa_K216004]) in receptor TNT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K216003 BBa_K216003]) se končata z dvojnim terminatorjem ([http://parts.igem.org/Part:BBa_B0014 BBa_B0014]) in sta pod kontrolo inducibilnega arabinoznega promotorja odvisnega od araC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K808000 BBa_K808000]), katerega zapis se nahaja pred genom za Trz. S tem so zmanjšali stres v zgodnjih fazah rasti in verjetnost tvorbe inkluzijskih telesc. Gen za reporterski protein GFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_E0040 BBa_E0040]) s terminatorjem T1 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K731722 BBa_K731722]) je bil pod kontrolo inducibilnega promotorja OmpC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_R0082 BBa_R0082]), ki ga aktivira OmpR. OmpR se nativno pojavlja v ''E. coli'', zato zapis zanj ni bil vključen v vektor [1].

Signalno kaskado za testiranje v rastlinskem sistemu so razdelili na dva plazmida pMAP. Oba sta vsebovala gen za odpornost na kanamicin. 

'''Prvi plazmid:'''

Receptor za TNT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3900011 BBa_K3900011]) je pod kontrolo močnega promotorja 35S ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3900015 BBa_K3900015]). Fuzijski protein AtFLS-Trg-PhoR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3900008 BBa_K3900008]) je pod kontrolo promotorja NOS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K788001 BBa_K788001]). Oba gena vsebujeta terminator NOS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K788001 BBa_K788001]). AtFLS je membranski lokalizacijski signal. Trg je že prej omenjeni bakterijski transmembranski receptor, ki sodeluje v procesu kemotakse. PhoR je histidinska kinaza, ki deluje podobno kot EnvZ. Gre za modifikacijo sistema prilagojenega za delovanje v rastlinah [1, 7].

'''Drugi plazmid:'''

Gen za transkripcijski faktor PhoB-VP64 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3900013 BBa_K3900013]) s terminatorjem NOS je pod kontrolo virusnega promotorja FMV ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3900012 BBa_K3900012]), gen za reporter RUBY s terminatorjem G7 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_P10402 BBa_P10402]) je pod kontrolo inducibilnega promotorja PlantPho ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3900014 BBa_K3900014]) [1].

=='''Bakterijski testni sistem'''==
Za izvedbo začetnih testov signalne kaskade so uporabili bakterijo ''Escherichia coli''. Izhodni signal je predstavljala fluorescenca reporterja GFP. Bakterijske seve DH5α ''E. coli'' so transformirali z vektorjem signalne kaskade. Gen za receptor za TNT na vektorju ni imel zapisa za signalni periplazemski lokalizacijski peptid, zato so preizkusili, ali bi se signalna pot aktivirala z dodatkom riboze, ki bi se vezala na endogeni RBP. Peleti bakterijskih kultur, ki so jim dodali arabinozo (indukcija izražanja Trz) in ribozo (vezava na RBP), so se obarvali zelenkasto. Dodatek arabinoze in riboze je dal najvišje intentenzitete fluorescence. Vendar rezultati niso statistično signifikantni, saj je šlo za razmeroma nizke intentenzitete fluorescence, kar je lahko posledica nizke stopnje izražanja endogenega RBP [1].

Naslednji korak je bil prekomerno izražanje RBP za povečanje začetnega dražljaja, kar bi vodilo do višjega izhodnega signala. Izvedli so kotransformacijo seva ''E. coli'' BL21(DE3) s plazmidom s signalno kaskado in plazmidom pJOE z genom za RBP pod kontrolo promotorja T7. Pokazali so, da se izhodni signal poveča s prekomernim izražanjem RBP. Torej je endogeno izražen RBP ozko grlo v signalni kaskadi [1].

Sledilo je testiraje aktivacije signalne kaskade z uporabo računalniško zasnovanih receptorjev. Celice ''E. coli'' BL21(DE3) so kotransformirali s plazmidom signalne kaskade in plazmidom z zapisom za receptor za BTCA. Ob dodatku BTCA in arabinoze je prišlo do signifikantnega povečanja fluorescence v primerjavi s preostalimi vzorci. Rezultati primerjave endogenega in računalniško zasnovanega receptorja so pokazali specifično vezavo BTCA na računalniško zasnovan receptor. Signal je bil intenzivnejši v primerjavi z vzorcema, pri katerih so signalno kaskado aktivirali z vezavo riboze na receptor za BTCA oziroma BTCA na RBP [1].

=='''Rastlinski testni sistem'''==

Za modelni organizem so si izbrali rastlino tobaka (''Nicotiana benthamiana''), ki je zaradi tankih in razmeroma velikih listov primerna za transformacijo rastlin z agroinfiltracijo, ki je enostavna metoda za hitro testiranje konstruktov. Agrobakterije se z brizgo brez igle vbrizga v spodnjo stran listov 4–6 tednov starih rastlin. Prehodno izražanje vnesenih genov je predvidoma vidno po dveh dneh [10, 11].

Za testiranje funkcionalnosti reporterja RUBY [8] so liste tobaka transformirali s plazmidom pHDE z genom za reporter RUBY pod kontrolo konstitutivnega promotorja 35S ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3900049 BBa_K3900049]). Dva dneva po prehodni transformaciji se je barva listov jasno spremenila v rdečo, vidno obarvani so ostali 9 tednov, kar potrjuje, da pigmenti v rastlini ostanejo dolgo stabilni. Reporter RUBY se je izražal tudi pod kontrolo inducibilnega promotorja LexA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3900048 BBa_K3900048]), ki ga aktivira estradiol, torej je primeren kot inducibilni reporterski sistem v rastlinah [1].

Ker so signalno kaskado porazdelili na dva plazmida so liste tobaka kotransformirali s plazmidom pK7FWG2 z zapisom za EGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1875003 BBa_K1875003]) in reporterskim plazmidom RUBY. Dokazali so izražanje tako RUBY kot tudi EGFP v infiltriranih mestih in s tem potrdili uspešnost kotransformacije z agroinfiltracijo. Za preverjanje funkcionalnosti signalne kaskade so z agroinfiltracijo transformirali liste tobaka z zgoraj opisanima vektorjema pMAP. Na enem izmed teh vektorjev je sicer zapis za receptor za TNT. Ker je delo s TNT prenevarno so uporabili njegov nadomestek BTCA. Računalniške analize so pokazale, da bi se tudi BTCA lahko vezal v receptor za TNT. Poskusi s hidrokulturami so pokazali, da rastline tobaka absorbirajo BTCA, kar so dokazali z GC/MS [1].

Po več dneh inkubacije se listi niso obarvali rdeče, torej signalna kaskada in indukcija izražanja RUBY nista bila aktivirana. Razlogov za to je lahko več: neuspešna kontransformacija, prešibka interakcija ligand-receptor, težave pri prenosu signala ali nezadostna aktivacija reporterja. Zaradi pomanjkanja časa teh domnev niso uspeli preveriti [1].

=='''Prihodnost in izboljšave'''==
V prihodnje bi lahko v rastlinah preizkusili računalniško zasnovan receptor, katerega delovanje so potrdili v bakterijskem testnem sistemu. Če bi jim rastline uspelo razviti za zaznavanje kemičnih orožij, bi se kasneje lahko sistem modificiral za detektiranje drugih snovi, ki onesnažujejo okolje. Zavedati se moramo, da je trenutno uporaba takih rastlin za lokaliziranje preostalih vojnih strupov v tleh še prepovedana z zakonom, saj gre za gensko spremenjene organizme, ki jih v EU še ni dovoljeno gojiti [1]. 

=='''Viri'''==
[1]    “Team:Bielefeld - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:Bielefeld-CeBiTec. [Accessed: 09-Apr-2022].

[2]    M. J. Borrok, Y. Zhu, K. T. Forest, and L. L. Kiessling, “Structure-based design of a periplasmic binding protein antagonist that prevents domain closure,” ACS Chem. Biol., 
vol. 4, no. 6, pp. 447–456, Jun. 2009, doi: [https://doi.org/10.1021/CB900021Q doi.org/10.1021/CB900021Q].

[3]    J. J. Falke, R. B. Bass, S. L. Butler, S. A. Chervitz, and M. A. Danielson, “The two-component signaling pathway of bacterial chemotaxis: a molecular view of signal transduction by receptors, kinases, and adaptation enzymes,” Annu. Rev. Cell Dev. Biol., vol. 13, pp. 457–512, 1997, doi: [https://doi.org/10.1146/ANNUREV.CELLBIO.13.1.457 10.1146/ANNUREV.CELLBIO.13.1.457].

[4]    J. W. Baumgartner, C. Kim, R. E. Brissette, M. Inouye, C. Park, and G. L. Hazelbauer, “Transmembrane signalling by a hybrid protein: Communication from the domain of chemoreceptor Trg that recognizes sugar-binding proteins to the kinase/phosphatase domain of osmosensor EnvZ,” J. Bacteriol., vol. 176, no. 4, pp. 1157–1163, 1994, doi: [https://doi.org/10.1128/jb.176.4.1157-1163.1994 10.1128/jb.176.4.1157-1163.1994].

[5]    M. Hulko et al., “The HAMP Domain Structure Implies Helix Rotation in Transmembrane Signaling,” Cell, vol. 126, no. 5, pp. 929–940, Sep. 2006, doi: [https://doi.org/10.1016/J.CELL.2006.06.058 10.1016/J.CELL.2006.06.058].

[6]    D. Tavares, A. Reimer, S. Roy, A. Joublin, V. Sentchilo, and J. R. van der Meer, “Computational redesign of the ''Escherichia coli'' ribose-binding protein ligand binding pocket for 1,3-cyclohexanediol and cyclohexanol,” Sci. Rep., vol. 9, no. 1, Dec. 2019, doi: [https://doi.org/10.1038/S41598-019-53507-5 10.1038/S41598-019-53507-5].

[7]    M. S. Antunes et al., “Programmable Ligand Detection System in Plants through a Synthetic Signal Transduction Pathway,” PLoS One, vol. 6, no. 1, 2011, doi: [https://doi.org/10.1371/JOURNAL.PONE.0016292 10.1371/JOURNAL.PONE.0016292].

[8]    Y. Tanaka, N. Sasaki, and A. Ohmiya, “Biosynthesis of plant pigments: anthocyanins, betalains and carotenoids,” Plant J., vol. 54, no. 4, pp. 733–749, May 2008, doi: [https://doi.org/10.1111/J.1365-313X.2008.03447.X 10.1111/J.1365-313X.2008.03447.X].

[9]    Y. He, T. Zhang, H. Sun, H. Zhan, and Y. Zhao, “A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation,” Hortic. Res., vol. 7, no. 1, Dec. 2020, doi: [https://doi.org/10.1038/S41438-020-00390-1 10.1038/S41438-020-00390-1].

[10]    H.-H. Hwang, M. Yu, and E.-M. Lai, “Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications,” Arab. B., vol. 15, p. e0186, Jan. 2017, doi: [https://doi.org/10.1199/TAB.0186 10.1199/TAB.0186].

[11]    J. Bally et al., “The rise and rise of ''Nicotiana benthamiana'': A plant for all reasons,” Annu. Rev. Phytopathol., vol. 56, pp. 405–426, 2018, doi: [https://doi.org/10.1146/annurev-phyto-080417-050141 10.1146/annurev-phyto-080417-050141].