View source for Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev

Izhodiščni članek: [https://www.pnas.org/content/117/52/33496 H. Todor, H. Osadnik, E. A. Campbell, K. S. Myers, H. Li, T. J. Donohue, C. A. Gross: Rewiring the specificity of extracytoplasmic function sigma factors, PNAS, December 2020, 117 (52) 33496-33506]
==UVOD==
Transkripcijski regulatorji vplivajo na ekspresijo bakterijskih genov. Za veliko genov pa še ni znano, kateri regulatorji vplivajo na njihovo izražanje. Ko govorimo o regulaciji transkripcije pri bakterijah, moramo omeniti sigma faktorje. Sigma faktorji so proteini, ki so potrebni za iniciacijo transkripcije pri bakterijah. Omogočajo specifično vezavo RNA polimeraze na promotorje. Tako ob združitvi sigma faktorja in RNA polimeraze nastane holoencim. Velika večina sigma faktorjev spada v družino σ70, znotraj katere najdemo 4 skupine. Skupina 1 zajema housekeeping sigma faktorje, slednji so zelo ohranjeni in esencialni za celico. Skupini 2 in 3 sta aktivni med specifičnimi okoljskimi in rastnimi pogoji.  Največja in najbolj raznolika pa je skupina 4, kjer najdemo izvencitoplazemske sigma faktorje oz. ECF sigma faktorji. Regulirajo gene, ki so udeleženi v diferenciaciji, kovinsko homeostazo, integriteto zunanje membrane in mnogih drugih procesih. ECF sigma faktorji so majhni proteini (okoli 200 AK) in vsebujejo dve dobro ohranjeni globularni domeni – sigma 4 in sigma 2, slednji se vežeta na -35 in -10 regijo promotorjev. ECF sigma faktorji potrebujejo zelo specifične sekvence promotorja, da se lahko nanj uspešno vežejo in velikokrat aktivirajo svoj lastni promotor.  Raziskava se je osredotočila na ECF sigma faktorje, saj je večina slednjih slabo okarakterizirana in ni bilo še razvitih nobenih metod za ugotavljanje genov in regulonov, ki so pod vplivom ECF sigma faktorjev. <sup>1</sup>

==PREDSTAVITEV PROBLEMA==
Bakterijski genomi so vse pogosteje sekvencirani, a uporabnost teh sekvenc je omejena zaradi naše nezmožnosti pri razreševanju bakterijskih transkripcijskih vezij. V biologiji se že dolgo ukvarjajo z možnostjo napovedi interakcije regulatornih genov na osnovi njihovega aminokislinskega zaporedja. Znati moramo torej napovedati specifičnosti sekvence nekega novega regulatorja in specifične interakcije, ki bodo pri tem nastale. V tej raziskavi so se znanstveniki osredotočili na de novo napoved bioloških tarč. Raziskava je rešila problem DNA-specifičnosti za ECF sigma faktorje in razvila postopek za konstrukcijo statistično signifikantnih domnevnih regulonov za 67% bakterijskih ECF sigma faktorjev. Torej s to metodo lahko na osnovi aminokislinskega zaporedja ECF sigma faktorjev napovemo, na katera zaporedja se bo sigma faktor vezal.  S tem lahko de novo napovedujemo interakcije.<sup>1</sup>

==POSTOPEK IN REZULTATI==
Iz baze podatkov so raziskovalci zbrali zaporedja ECF sigma faktorjev in določili njihov domneven avtoregulatorni promotor. Naredili so medsebojno analizo informacij oz. MI, s čimer so določili ali je prihajalo do sočasnih variacij specifičnih aminokislin s specifičnimi pozicijami nukleotidov skozi evolucijski čas. 
Na osnovi proteinskega zaporedja so vse ECF sigma faktorje razdelili v gruče in iskali pogoste motive, ki se pojavljajo v njihovih avtoregulatornih promotorjih. Ob koncu analize so dobili poravnavo vseh domnevnih avtoregulatornih promotorjev s ujemajočimi ECF sigma faktorji. Sledila je MI analiza dobljene kolekcije, s katero so identificirali interagirajoče aminokisline in nukleotidne. MI analiza predpostavlja, da mutacije v aminokislinah, ki determinirajo specifičnost, so nadomeščene z mutacijami na enakovrednem mestu v sorodnem promotorju in obratno. To vodi v visoko kovariacijo in posledično visoko vrednost MI. Iz rezultatov so ugotovili, da imajo samo nekatere AK na specifičnih mestih visoko vrednost MI in ravno ta mesta so najpomembnejša za specifičnost vezave. To se je ujemalo tudi z raziskavami, ki so bile že predhodno narejene, kjer so opazovali interakcijo kristalnih struktur treh divergentnih ECF sigma faktorjih; RpoE iz E. coli in SigL pa SigH iz M. tuberculosis. Prišli so do zaključka, da je mehanizem interakcije med ECF sigma faktorjem in promotorjem dobro ohranjen pri večini ECF sigma faktorjih. To pa pomeni, da vsebnosti ključnih aminokislin na specifičnih pozicijah odloča o specifičnosti promotorja. S tem znanjem so lahko napovedali, kako močno se bo določen sigma faktor vezal na promotor. Specifičnost ECF sigma faktorjev lahko precizno napovemo, v kolikor poznamo ostanke na ključnih mestih. 
Tako je MI analiza nakazala, da vsebnost aminokislin na ključnih pozicijah mora imeti napovedljiv efekt na specifičnostjo promotorja nekega ECF sigma faktorja. S tem lahko napovemo zaporedja promotorjev naravnih sigma faktorjev in nam daje tudi možnost načrtovanja novih ECF sigma faktorjev z določeno specifičnostjo.  
Glede na vrednost MI so bila najdena tri ključna mesta, ki determinirajo specifičnost. Za model so vzeli promotor za gen RpoE iz E. coli in na teh treh mestih naredili substitucijo z vsemi preostalimi 19 aminokislinami. Te substitucije so bile narejene na Ser172, Arg171 in Asn84. Pokazali so, da vsaka mutacija močno spremeni specifičnost vezave sigma faktorjev na njihov avtoregulatoren promotor. <sup>1</sup>
Vsi ti rezultati so nakazali, da obstaja možnost de novo predikcije specifičnosti promotorja, v kolikor poznamo primarno zaporedje ECF sigma faktorja. Za predikcijo te specifičnosti sigma faktorjev, so najprej izbrali eno ali dve aminokislinski poziciji, ki so najboljše korelirane z nukleotidi na pozicijah v promotorju z največjo vrednostjo MI. Sestavili so domneven -35 in -10 PWMs. PWM je kratica za position weight matrix in ga prikazujemo v posebnem diagramu. Predstavlja najverjetnejše nukleotide na neki poziciji. Te računalniško določene preferenčne nukleotide so primerjali s preferenčnimi nukleotidi naravnih sigma faktorjev. Tako so ustvarili sistem za napoved specifičnosti posameznega sigma faktorja na osnovi njegove primarne strukture. <sup>1</sup>
Sledilo je določanje domnevnih regulonov vseh ECF sigma faktorjev, ki so bili zajeti v raziskavo. Uporabili so pristop filogenetskega odtisa. Filogenetski odtis določi prava vezavna mesta za ECF sigma faktorje preko primerjale teh sigma faktorjev s sigma faktorji iz ortolognih sekvenc druge bakterijske vrste. <sup>1</sup>

==GLOBALNI IN LOKALNI REGULATORJI==
Različne študije so pokazale, da lahko sigma faktorji delujejo kot globalni ali lokalni regulatorji. Razlikujejo se med sabo v številu reguliranih genov, ohranjenosti zaporedij in diverziteti pogojev, kjer delujejo regulatorno. Da bi izvedeli, ali ECF sigma faktorji delujejo kot globalni regulatorji, so najprej kvantificirali število promotorjev, ki jih regulirajo in potem raziskali ali vsebujejo značilnosti globalnih in lokalnih regulatorjev. Skoraj polovica ECF sigma faktorjev regulira tri ali manj promotorjev. Skušali so povezati tudi informacijo, da ECF sigma faktorji, ki nadzirajo več kot tri domnevne promotorje, vplivajo na več procesov v celici. Torej več regulonov kot ima en sigma faktor, na več procesov se odziva in regulira. Dodatna pomembna karakteristika globalnih regulatorjev je njihova ohranjenost znotraj kladov – to je taksonomska skupina, ki obsega skupnega prednika in vse njegove potomce, to so torej monofiletske skupine. Cilj je bil dokazati, da ECF sigma faktorji, katerim so napovedali velike regulone, so bolj ohranjeni kot tisti, s majhnimi napovedanimi reguloni. Tako so ECF sigma faktorje dali v skupine glede na njihovo eggNOG ortologijo in prišli do rezultata, da so sigma faktorji z domnevnimi velikimi reguloni bolj ohranjeni znotraj kladov kot tisti sigma faktorji, ki nadzorujejo majhne regulone. Sigma faktorji z velikimi reguloni so bili prisotni v 28% vseh genomov, sigma faktorji z majhnimi reguloni pa so bili najdeni v 16,9% vseh genomov. Ugotovili so, da je razporeditev ECF sigma faktorji z majhnimi reguloni med različnimi vrstami bakterij znotraj klada bolj neenakomerna kot razporeditev ECF sigma faktorjev z velikim regulonom.  Domnevali so, da je to posledica horizontalnega prenosa sigma faktorjev z majhnim regulonom. <sup>1</sup>
==ZAKLJUČEK==
Vse informacije napovedanih regulonov ECF sigma faktorjev  med kladi so zbrali in ustvarili podatkovno bazo. Znotraj baze si je mogoče ogledati potencialne povezave in druge najdene korelacije. Rezultati tega članka so tako dostopni na tej strani in se lahko uporabijo pri različnih raziskavah. Študija naj bi tako pomagala bodočim raziskovalcev pri svojem delu, saj lahko slednji uporabijo metode, ki jih je raziskava sestavila in s tem dalje raziskujejo ECF sigma faktorje, njihovo delovanje in vpliv na celico. <sup>1</sup>
==VIRI==
1. H. Todor, H. Osadnik, E. A. Campbell, K. S. Myers, H. Li, T. J. Donohue, C. A. Gross: Rewiring the specificity of extracytoplasmic function sigma factors, PNAS, December 2020, 117 (52) 33496-33506
2. T. Wecke P. Halang, A. Staron, Extracytoplasmic function σ factors of the widely distributed group ECF41 contain a fused regulatory domain, MicrobiologyOpen 1, 194–213, 2012.
3. J. D. Sharp, A. K. Singh, S. T. Park, Comprehensive definition of the SigH regulon of Mycobacterium tuberculosis reveals transcriptional control of diverse stress responses. PLoS One 11, 2016
4. Feklístov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., & Gross, C. A., Bacterial Sigma Factors: A Historical, Structural, and Genomic Perspective. Annual Review of Microbiology, 68(1), 2013