View source for Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39322757/ Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology] 

== Uvod ==
Določanje kinetičnih parametrov encimov najpogosteje temelji na merjenju reakcijske hitrosti ob spreminjanju koncentracije substrata. Pri tem razpon koncentracij substrata običajno obsega vsaj 2 velikostna reda. Na ta način je mogoče določiti afiniteto encima do substrata, ki jo opredeljuje Michaelis-Mentenina konstanta (''K<sub>M<sub>''), in aktivnost encima, ki jo določata  maksimalna reakcijska hitrost (''v<sub>max<sub>'') in pretvorbeno število (''k<sub>cat<sub>''). Klasičen pristop določanja kinetičnih parametrov vključuje izvedbo reakcije v ''in vitro'' pogojih, ki se močno razlikujejo od tistih v notranjosti celice. Namesto heterogene in nagnetene raztopine različnih makromolekul in organelov se reakcije običajno izvaja na (delno) čistih proteinskih vzorcih, ki so del razredčene puferske raztopine. Poleg tega v celicah razmejitve in kompartmentalizcija vplivajo na variacije v koncentraciji substrata, produkta in spremembe difuzijskih koeficientov. Problem predstavlja tudi ''in vitro'' študij membranskih in multimernih proteinov. Običajno jih je zahtevno očistiti, optimizacija testov aktivnosti pa je kompleksna, saj pogosto zahteva prisotnost umetnih membran. Pogoste so tudi razlike med rezultati pridobljenimi v sistemih, kjer se substrat dodaja v reakcijsko mešanico v primerjavi s tistimi pri katerih je substrat pridobljen iz metabolizma [1].

== Karotenoidna sintezna pot ==
Razumevanje encimske kinetike je pomembno za celostno razumevanje metabolnih poti. Velik pomen pa ima tudi za razumevanje encimskih poti, ki se uporabljajo v industrijskih procesih. Primer takšne poti je karotenoidna sintezna pot [1]. Karotenoidna pot nativno poteka v različnih organizmih – denimo v nekaterih rastlinah, bakterijah in glivah. Številni rastlinski apokarotenoidi, ki so produkt encimskih cepitev karotenoidov, obsegajo pigmente, arome in spojine z vonjem, ki se pogosto uporabljajo v prehranski industriji [2]. V kvasovki ''Saccharomyces cerevisiae'' nativno ne poteka je pa sintetična pot v tej industrijsko pomembni biotehnološki šasiji zanimiva na področjih vse od proizvodnje hrane do zdravil [1].
Številni encimi udeleženi v karotenoidno pot so povezani z membrano (ang. membrane-associated),  kar otežuje študij kinetike pripadajočih reakcij. Dva izmed encimov pri katerih je študij v ''in vitro'' pogojih otežen sta fitoen sintaza (CrtB; EC 2.5.1.32) in fitoen desaturaza (CrtI; EC 1.3.99.31). Fitoen sintaza je prvi encim sintetične poti in hkrati encim, ki  predstavlja ozko grlo v sintezi karotenoidov v rastlinah. Encim katalizira kondenzacijo 2 molekul geranilgeranil pirofosfata (GGPP), ki sta obrnjeni ena proti drugi (ang. head-to-head), pri čemer nastane fitoen. Sintezi fitoena sledijo tri nenasičenja, rezultat katerih je molekula likopena. Pri rastlinah in cianobakterijah so v pretvorbo udeleženi štirje encimi, pri nefotosintetskih bakterijah in glivah pa le en - fitoen deasturaza [1, 2].

== Zasnova in namen ==
Castaño-Cerezo ''et al'' so za razvoj novega sistema za ''in vivo'' encimatiko posegli po orodjih sintezne in sistemske biologije. Sintezno biologijo so uporabili za namen spreminjanja moči promotorjev in števila kopij zapisov za posamezne encime, kar jim je omogočilo variiranje koncentracije substrata direktno v celicah preko spreminjanja koncentracije encima udeleženega v njegovo sintezo. Sistemska biologija jim je preko integracije rezultatov genomike, proteomike in metabolomike omogočila vpogled v interakcije in celovitost procesov v bioloških sistemih [1].

== Priprava sevov ==
Pristop so uporabili za študij sintetične karotenoidne poti v ''Saccharomyces cerevisiae''. Za namen študija encimov udeleženih v karotenoidno pot so vzpostavili seve kvasovk, ki omogočajo variacijo v količini substrata GGPP. Seve so pripravili s spreminjanjem seva CEN.PK2-1C. Pred pripravo tovrstnih sevov so sintezo GGPP povečali z upravljanjem nativne terpenske poti. Na ta način so pripravili sev yENZ15 v katerem sta zapis za farnezil pirofosfat (FPP) sintazo (''ERG20'') in skrajšana oblika zapisa za 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A reduktazo 1 (''tHMG1'') močno konstitutivno izražena. Poleg tega pa vsebuje delecijo zapisa za glavno fosfatazo, ki odstranjuje pirofosfatne skupine iz GGPP in FPP. Sledila je vzpostavitev treh različnih integracijskih kaset, ki so vsebovale različne mikrobne GGPP sintaze pod različnimi konstitutivnimi promotorji, ki so jih integrirali v genom yENZ15. Tako so proizvedli set sevov ustvarjenih za sintezo razpona koncentracij GGPP. Koncentracija GGPP je v pripravljenih sevih variirala za faktor 38, njihove hitrosti rasti so bile primerljive (0,40±0,03 h<sup>-1</sup>), kar kaže na odsotnost sprememb v fiziologiji sevov [1].

Vsaka merjena koncentracija substrata je izvirala iz specifično pripravljenega seva, kjer je zapis za encim udeležen v sintezo substrata izražen na določeni ravni. Seve so nato gojili v pogojih dinamičnega ravnotežja (eksponentna rast), kjer pretok (ang. flux; analog hitrosti reakcije) in koncentracije metabolitov ostajajo konstantni. Stabilnost zaradi vzpostavljenega dinamičnega ravnotežja tako omogoča natančno meritev pretoka reakcije [1].  

== ''In vivo'' določanje parametrov za fitoen sintazo iz bakterije ''Pantoea ananas'' (PaCrtB) ==
Za določitev optimalne koncentracije encima za izvedbo kinetičnih testov so izvedli simulacije, pri katerih so upoštevali tri različne koncentracije encima (nizko, srednjo in visoko) pri širokem razponu v pretoku nastajanja substrata (ang. substrate-producing flux). Nato so analogen pristop uporabili tudi za določanje nasičenosti encima s substratom. Izbrali so tri različne konstitutivne promotorje – TEFmut2 za nizko, PGI1 za srednje in PDC1 za močno izražanje ''crtB''. Skladno z rezultati simulacij je koncentracija GGPP padala z višanjem aktivnosti PaCrtB, ob močnejšem izražanju PaCrtB pa je naraščal pretok nastajanja fitoena. Previsoka koncentracija PaCrtB je ovirala nasičenje encima s substratom in s tem onemogočila določitev kinetičnih parametrov. Nizka koncentracija pa je zaradi počasnega nastajanja fitoena otežila natančnost  meritev, saj je bila koncentracija nastalega fitoena prenizka za natančno kvantifikacijo. Natančno meritev so dosegli le pri srednjem izražanju encima, zato so za nadaljnje meritve uporabili promotor PGI1 [1]. 

V vzpostavljenih sevih so dosegli 167× variacijo v koncentraciji GGPP. Dosegli so tudi delno nasičenje, kar je vodilo v nelinearen odnos med pretokom nastajanja fitoena in koncentracijo GGPP, ki je značilen tudi za klasične ''in vitro'' eksperimente. S prileganjem rezultatov na ireverzibilen Michaelis-Mentenin model so določilo natančne ocene kinetičnih parametrov ''K<sub>1/2</sub><sup>cell</sup>'' (19±3 µM),''v<sub>max</sub><sup>cell</sup>'' (849±71 µM/h). Afiniteta PaCrtB do GGPP je bila višja od ''in vitro'' določene (''K<sub>M</sub>'' = 41 µM), kar kaže na pomen določanja parametrov direktno v celicah [1, 3]. Pretvorbeno število 6±1 s<sup>−1</sup>, ki so ga pridobili na osnovi meritev koncentracije encima s pomočjo kvantitativne proteomike (42 nM) v sevih, kjer je PaCrtB pod kontrolo promotorja PGI1, pa je primerljiva ''in vitro'' vrednostim za encim ''Pantoea agglomerans'' [1].

== ''In vivo'' karakterizacija fitoen desaturaz ==
Najbolj zamuden del predstavljenega pristopa zajema molekulsko kloniranje in inženiring velikega števila različnih sevov. Zato so si sistem zamislili na način, ki omogoča enostavno recikliranje in uporabo sevov za analizo encimov, ki v metabolni poti nastopijo kasneje. Pripravljene seve so spremenili z integracijo ''crtB'' pod nadzorom promotorja PDC1, ki omogoča močno izražanje. Tako so dosegli 430× razpon v koncentraciji fitoena, kar jim je omogočilo ''in vivo'' študij naslednjega encima v metabolni poti. Želeli so določiti kinetične parametre treh pogosto uporabljenih fitoen desaturaz – CrtI iz bakterije ''P. ananas'' (PaCrtI), za katero so objavljeni ''in vitro'' encimski parametri, in CrtI iz gliv ''Phaffia rhodozyma'' (starejše ''Xanthophyllomyces dendrorhous'', XdCrtI) in ''Blakeslea trispora'' (BtCrtI), ki se pogosto uporabljata za sintezo karotenoidov, vendar kinetični parametri zanju še niso bili določeni. Za izražanje vsake izmed njih so uporabili drugačen promotor, v povezavi s z relativnimi zmožnostmi sinteze likopena v ''Saccharomyces cerevisiae''. Uporaba primernega promotorja je bila še posebej pomembna ob uporabi encima BtCrtI. Visoke koncentracije te fitoen desaturaze so v eksponentni fazi vodile v celično smrt zaradi tvorbe kristalov likopena. Prav tako je bil BtCrtI edini encim, koncentracija katerega je bila odvisna od koncentracije fitoena (koncentracija encima je bila višja v prisotnosti nižje koncentracije substrata). Kljub višji koncentraciji PaCrtI (uporaba promotorja TDH3), v primerjavi z obema fitoen desaturazama gliv, je bila hitrost nastajanja likopena ob uporabi tega encima približno 10× nižja kot pri ostalih dveh. Koncentracija fitoena je bila v tem primeru prenizka za nasičenje, kljub večjem razponu koncentracij substrata kot v ''in vitro'' raziskavah. Rezultate si lahko interpretiramo kot razliko v afiniteti encimov, ki so znotraj celice vezani na membrane in tistih udeleženih v ''in vitro'' encimskih reakcijah. Razlike pa so lahko tudi posledica dostopnosti substrata, vpliva drugih metabolnih poti, ki se v celici odvijajo hkrati itn. Tudi v tem primeru so rezultate prilegali na ireverzibilen Michaelis-Mentenin model, določili pa so le vrednosti ''K<sub>1/2</sub><sup>cell</sup>'' in ''v<sub>max</sub><sup>cell</sup>'' za fitoen desaturazi iz gliv (pri PaCrtI so eksperimentalni podatki omogočali le določitev spodnje meje). Maksimalna hitrost reakcije je bila pri BtCrtI (309±22 µM·h<sup>−1</sup>) približno 2× višja kot pri XdCrtI. Prav tako je imel ta encim približno 9× višjo afiniteto do substrata (41±12 µM) [1]. 

== Zaključek ==
V sklopu raziskave so Castaño-Cerezo ''et al'' uspešno določili ''in vivo'' analoge Michaelis-Menteninih parametrov za fitoen sintazo PaCrtB in osvetlili razlike med ''in vivo'' ter ''in vitro'' parametri. S pomočjo istega nabora sevov so uspešno določili še encimske parametre dveh izmed treh analiziranih fitoen desaturaz. Uporabljena metoda torej ponuja možnost za optimizacijo naravnih in sintetičnih sinteznih poti ''in vivo''. Vseeno je potrebno pridobljene parametre (tako kot v ''in vitro'' testih), bolj kot konstanto, obravnavati kot funkcijo mikrookolja v katerem se encimi nahajajo [1]. 

== Literatura == 
[1]	S. Castaño-Cerezo, A. Chamas, H. Kulyk, C. Treitz, F. Bellvert, A. Tholey, V. Galéote, C. Camarasa, S. Heux, L. F. Garcia-Alles, idr.: Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology. EMBO J. 2024, 43, 5169–5185.

[2]	J. López, D. Bustos, C. Camilo, N. Arenas, P. A. Saa, E. Agosin: Engineering Saccharomyces cerevisiae for the Overproduction of β-Ionone and Its Precursor β-Carotene. Front. Bioeng. Biotechnol. 2020, 8.

[3]	U. Neudert, I. M. Martı́nez-Férez, P. D. Fraser, G. Sandmann: Expression of an active phytoene synthase from Erwinia uredovora and biochemical properties of the enzyme. Biochim. Biophys. Acta BBA - Lipids Lipid Metab. 1998, 1392, 51–58.