View source for Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije Klebsiella oxytoca

Povzeto po raziskovalnem članku: Refactoring the nitrogen fixation gene cluster from ''Klebsiella oxytoca'' [1]

== Težave pri uporabi naravnih genskih zapisov ==
 
Veliko funkcij, zanimivih za biotehnološko uporabo, je pogosto zapisanih v genskih skupkih. Velikost genskih skupkov je zelo različna, nekateri vsebujejo le nekaj genov, spet drugi nekaj sto genov. Pri prokariontih so lahko geni organizirani v obliki operonov, kar pomeni, da je več genov skupaj pod kontrolo enega promotorja. V primeru bakterije Klebsiella oxytoca je genski skupek za fiksacijo dušika sestavljen iz 20 genov, organiziranih v 7 operonov, s skupno dolžino 23,5 kb DNA. Pogosto želimo DNA zapis za določeno lastnost prenesti iz organizma, ki ga je težko gojiti pod laboratorijskimi pogoji, v drugega, vendar je lahko že sama dolžina zapisa omejujoč dejavnik. Precejšnjo težavo predstavlja tudi gostiteljeva regulacija, ki nadzoruje transkripcijsko aktivnost genov preko različnih povratnih zank, pogosto zelo zapletenih in vpetih v širšo mrežo interakcij. Lokusi ostanejo transkripcijsko neodzivni dokler določen kemijski ali fizični signal ne inducira njihovega prepisovanja. Pogosto je opazna presežnost, kar pomeni, da en regulatorni signal lahko kontrolira transkripcijo več operonov, in obratno, en operon je lahko posredno odziven na več različnih signalov. Dodatno se geni lahko med seboj prekrivajo, DNA zapisi imajo lahko več funkcij, pa tudi translacija je lahko regulirana preko malih RNA. Omenjene ovire imajo za posledico, da veliko genskih skupkov ostane kriptičnih, kar pomeni, da laboratorijski pogoji za njihovo aktivnost ostanejo neznanka  [1], [2], [3].

== Spreminjanje nativnega zapisa genskih skupkov ==
 
=== Pristop od zgoraj navzdol === 
 
Pri spreminjanju genskih skupkov od zgoraj navzdol je pogost pristop manipulacija naravno prisotne regulacije ali dodajanje sintetičnih regulacij v sicer naravni genski zapis. Izbijanje represorja ali povišana ekspresija aktivatorja privede do povečane količine produkta določene biosintetične poti. V kolikor genski skupek sestoji le iz enega operona, vstavitev sintetičnega promotorja pred skupek poveča ekspresijo. Analogno se poveča ekspresija, če vsak gen posebej postavimo pod kontrolo sintetičnega promotorja [1], [4].
 
=== Pristop od spodaj navzgor === 
 
Pri pristopu od spodaj navzgor gre za grajenje genskega skupka izključno z uporabo sintetičnih DNA regij, ki so načrtane tako, da eliminirajo vso naravno prisotno regulacijo. 

V prvem koraku se s pomočjo računalniških programov pregleda celoten naravni zapis genskega skupka. Sledi odstranitev vse nekodirajoče DNA, neesencialnih genov in zapisov za regulatorje. V naslednjem koraku se gene, ki jim je bila določena pomembna vloga pri končni lastnosti skupka, ponovno prepiše, in sicer uporabi se kodone, ki so čim bolj različni tistim v naravnem zapisu. S tem se ohrani aminokislinsko zaporedje, spremeni pa se zaporedje nukleotidov. Namen tega koraka je uvedba mutacij, ki odstranijo ves morebiten notranji nadzor, kot so spregledani oz. še ne okarakterizirani operatorji, promotorji, sekundarne mRNA strukture, metilacijska mesta, regulacije kodonov in pavzirajoča mesta. Pavzirajoča mesta ležijo za poli(A) repom in so terminatorski signal za RNA polimerazo (II), ki je sicer prisotna v sesalskih celicah, vendar je sorodna RNA polimerazi pri bakterijah [1], [5]. Rekodirana zaporedja se ponovno pregleda z računalniškim programom in v kolikor obstaja še kakšna regija, ki bi imelo regulatorno funkcijo, je le-ta odstranjena. Rekodirane gene se organizira v umetne operone. Posamezni geni v operonu so med seboj ločeni z vmesniki, vsakemu izmed njih pa je dodano tudi sintetično vezavno mesto za ribosom (RBS).  Na začetek vsakega operona pa je postavljen sintetični promotor, ki regulira njegovo prepisovanje. Končni rezultat je preoblikovan genski skupek, organiziran v serijo diskretnih, dobro okarakteriziranih genetskih delov z odstranjeno naravno prisotno regulacijo. Sintetična regulacija omogoča kontrolo nad dinamiko in pogoji pod katerimi se skupek izraža [1].

== Genski skupek za fiksacijo dušika == 
 
Fiksacija dušika je pretvorba dvoatomarnega dušika (N<sub>2</sub>) iz atmosfere v amonijak (NH<sub>3</sub>). Mikroorganizmi fiksirajo dušik s pomočjo encima nitrogenaza. Slednji sestoji iz dveh podenot: iz heterotetramernega MoFe proteina (katalizira redukcijo dušika) in homodimernega Fe proteina (donor elektronov za redukcijo dušika). Naravno prisoten zapis za nitrogenazo v K. oxytoca zajema 23,5 kb DNA in kodira 20 proteinov (gradnike obeh podenot nitrogenaze, encime za biosintezo metaloskupkov, šaperone, elektronske transporterje in regulatorje) [6].

== Toleranca nativnega genskega skupka na spremebe v izražanju posameznih genov == 
 
Pred preoblikovanjem skupka je potrebno preveriti kako povečano izražanje posameznega gena ali več genov skupaj vpliva na končno funkcijo nitrogenaze. Vsak gen ima namreč svoj optimum izražanja, kar pomeni, da preveliko oz. premajhno izražanje negativno vpliva na biološko funkcijo celotnega genskega skupka. V ta namen se iz naravnega zapisa sistematično izbija posamezne gene, katere je nato potrebno zapisati na ločen plazmid, postaviti pod nadzor inducibilnega promotorja (npr. P<sub>tac</sub>) in izvesti komplementacijo. Optimum se določi z merjenjem nitrogenazne aktivnosti glede na aktivnost inducibilnega promotorja. Na primer, izmerjeno je bilo, da morajo biti geni, ki kontrolirajo transport elektronov (nifJ in nifF), dokaj nizko izraženi, saj povečano izražanje negativno vpliva na funkcijo nitrogenze. V nasprotju mora biti operon (nifBQ), ki zapisuje za proteine pomembne pri sintezi FeMo jedra in integraciji molibdena, izražen 10-krat močneje kot pa operon (nifUSVWZM), ki zapisuje za proteine pomembne pri tvorbi Fe-S jedra. Gene s podobno stopnjo izražanja se poveže v operon in postavi pod nadzor sintetičnega regulatorja. Pri procesu komplementacije se odkrije tudi negativne regulatorje izražanja in se jih nato izbriše (v dotičnem primeru: nifLA, nifX in nifT) [1], [7].

== Popolnoma preoblikovan genski skupek == 

Posamezen preoblikovan operon so postavili pod nadzor IPTG-inducibilnega promotorja P<sub>tac</sub> in izmerili stopnjo izražanja glede na nitrogenazno aktivnost. Preden so operone združili v genski skupek, so jim zamenjali P<sub>tac</sub> s T7 promotorji. Moč promotorja vsakega operona so prilagodili glede na prej izmerjeno optimalno stopnjo izražanja pod kontrolo P<sub>tac</sub>. Kot referenco so vzeli nfiHDK operon, ki je v K. oxytoca močno izražen (produkt gena nifHDK predstavlja 10% vseh celičnih proteinov). Postavili so ga pod močan T7 promotor divjega tipa. Ostale operone so postavili pod oslabljene T7 promotorje, glede na relativno izražanje proti nifHDK operonu. Manjši kot je optimum izražanja določenega operona, pod bolj oslabljen T7 promotor so ga postavili. Vsak posamezen operon pod kontrolo T7* RNAP je dosegel podobno vrednost izražanja kot pod kontrolo P<sub>tac</sub> [1].

Preoblikovan genski skupek za fiksacijo dušika so vgradili na en plazmid, na drug plazmid pa so vgradili krmilnik, ki nadzoruje transkripcijsko aktivnost opisanega genskega skupka. 
Krmilnik sestoji iz senzorja in vezja. Senzor je v dotičnem primeru promotor P<sub>tac</sub>, ki se inducibilno izraža glede na prisotnost IPTG-ja. Vezje pa predstavlja zapis za mutirano T7 RNA polimerazo (T7* RNAP). Torej ob prisotnosti IPTG-ja, promotor P<sub>tac</sub> sproži prepisovanje gena za T7* RNAP, T7 RNAP pa nato začne s prepisovanjem celotnega genskega skupka za fiksacijo dušika [1].

S plazmidom, ki je nosil zapis za preoblikovan genski skupek in  plazmidom z zapisom za krmilnik so transformirali sev K. oxytoca, kateremu je bil predhodno izbit naravni zapis za fiksacijo dušika (K. oxytoca nif KO). Sintetični genski skupek za fiksacijo dušika je dosegel 7,4% +/- 2,4% aktivnosti nitrogenaze v primerjavi z divjim tipom. Transformirani sevi so izrabljali N<sub>2</sub> iz ozračja kot vir dušika, vendar so rastli 3,5-krat počasneje kot divji tip sevov [1].

Končni preoblikovan genski skupek za fiksacijo dušika, vključno s krmilnikom, je vseboval 89 genetskih delov. Funkcija vsakega dela je natančno definirana in okarakterizirana. Kot pričakovano je nitrogenazna aktivnost sintetičnega skupka nižja od naravno prisotnega, saj gre za spreminjanje evolucijsko zelo ohranjenega sistema [1].

== Menjava krmilnikov za spremembo regulacije == 

Ločba krmilnika in preoblikovanega genskega skupka omogoča enostavno spremembo reguliranja sistema. V kolikor zamenjamo senzor na krmilniku, je le ta odziven na drug signal. Senzor odziven na IPTG (v dotičnem primeru je to promotor P<sub>tac</sub>) so zamenjali  s Tc-inducibilnim promotorjem P<sub>tet</sub>. Ob prisotnosti ustreznega signala je ne glede na izbiro senzorja nastala enka količina NH<sub>3</sub> relativno glede na WT sistem (7,2 % +/- 1,7 %). Ustvarili so tudi senzor, ki je bil občutljiv na IPTG in Tc hkrati, kar v praksi pomeni, da so pred zapis za T7* RNAP vstavili tako P<sub>tac</sub> kot tudi P<sub>tet</sub>. V tem primeru je bila ob prisotnosti le IPTG-ja količina proizvedenega NH<sub>3</sub> nekoliko nižja glede na naravno prisoten zapis, in sicer 6,6 % +/- 1,7 %. Načrtovanje krmilnikov tako predstavlja enostaven način regulacije celotnega sistema [1].

Pri naravnem zapisu za fiksacijo dušika v K. oxytoca je amonijak negativni regulator delovaja nitrogenaze. V prisotnosti 17,5 mM amoniaka v gojišču, je aktivnost fiksacije dušika inhibirana. V nasprotju je bila pri preoblikovanem genskem skupku aktivnost nitrogenaze  1,1 % +/- 0,5 %. Aktivnost je nekoliko nižja, vendar ne zaradi inhibicije encima, temveč zaradi znižanja aktivnosti krmilnika za 4,5-krat. V kolikor bi bil krmilnik bolj robusten, naj bi bila aktivnost nitrogenaze nespremenjena [1].

== Prednosti preoblikovanja genskih skupkov == 

Namen preoblikovanja naravnega zapisa je olajšati nadaljnje delo z večgenskimi sistemi, ki imajo po navadi zelo kompleksno genetiko. Ti sistemi so se razvili skozi evolucijo in so pogosto močno regulirani. Regulacija je presežna in vpeta v širšo mrežo interakcij, kar pomeni, da en signal lahko regulira več biokemijskih mehanizmov. Z modeliranjem genskih skupkov, fizičnim ločevanjem in izolacijo posameznih regij poenostavimo sistem. Takšni sistemi lahko služijo kot platforma za raziskave v bazični biologiji. Izolirane regije okarakteriziramo in jim pripišemo funkcijo. Prav tako poenostavljeni genski skupki omogočajo kvantifikacijo vpliva regulatornih interakcij v izolaciji. Izoliranemu sistemu sistematično in po korakih dodajamo nazaj regulacije in spremljamo njihov vpliv, kar privede do odkrivanja novih genetskih in regulatornih modelov [1].

== Viri == 

[1]	K. Temme, D. Zhao, and C. A. Voigt, “Refactoring the nitrogen fi xation gene cluster from Klebsiella oxytoca,” vol. 109, no. 18, pp. 2–7, 2012.

[2]	E. Zazopoulos et al., “A genomics-guided approach for discovering and expressing cryptic metabolic pathways,” Nat. Biotechnol., vol. 21, no. 2, pp. 187–190, 2003.

[3]	A. Ishihama, “Prokaryotic genome regulation: Multifactor promoters, multitarget regulators and hierarchic networks,” FEMS Microbiol. Rev., vol. 34, no. 5, pp. 628–645, 2010.

[4]	L. B. Pickens, Y. Tang, and Y.-H. Chooi, “Metabolic Engineering for the Production of Natural Products,” Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng., vol. 2, no. 1, pp. 211–236, 2011.

[5]	N. Gorkman, S. West, N. J. Proudfoot, "Pouse sites promote transcriptional termination of mammalian RNA polymerase II," Mol Cell Biol., vol. 26, no. 20, pp. 3986-3996, 2006

[6]	L. M. Rubio, P. W. Ludden, "Maturation of Nitrogenase: a Biochemical Puzzle," J Bacteriol., vol. 187, no. 2, pp. 405-414, 2005

[7]	R. Dixon and D. Kahn, “Genetic regulation of biological nitrogen fixation,” Nat. Rev. Microbiol., vol. 2, no. 8, pp. 621–631, 2004.