View source for Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran

''Povzeto po članku:'' [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.9b00340 Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.]


Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je predvsem posledica številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].

Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano obliko listeriolizina O, ki  je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].

==Sestavni deli sistema==
===Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)===
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik ''Listerie monocytogenes'', ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi porotvornimi toksini drugih grampozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].

===DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)===
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev je bilo določeno, kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].

Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomih. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].

Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja  GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP-9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].

===Fosfolipidni vezikel===
Poleg proteinskih komponent je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot podlaga za izvajanje sinteznobioloških logičnih vrat. V raziskavi so v ta namen pripravili vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-''sn''-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-''sn''-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2).  Pri pripenjanju DARPina  nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].

==Delovanje sistema==
Sistem je oblikovan tako, da je njegov izhodni signal nastanek pore v membrani vezikla, kar povzroči sprostitev vsebine vezikla v okolico. Za nastanek pore sta potrebni ustrezna vrednost pH ter odsotnost DARPina D22, ki bi ta proces sicer inhibiral. Tako lahko glede na tip vezave DARPina D22 na površino membrane zasnujemo logična vrata IN ali kombinirana logična vrata ALI-IN.

V primeru vrat IN (tabela 1) je DARPin D22 pripet na vezikel preko ireverzibilne tioetrske vezi. Do nastanka pore bo prišlo v kislem okolju ob hkratni prisotnosti MMP-9, ki bo cepila prepoznavno zaporedje v C-končnem peptidu DARPina D22 in ga s tem odstranila s površine vezikla.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Pravilnostna tabela vrat IN.'''
! style="width: 72px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP-9 
! style="width: 72px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 72px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|- 
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |<span style="color:red">'''0'''</span>
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |<span style="color:red">'''0'''</span>
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |<span style="color:red">'''0'''</span>
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |<span style="color:green">'''1'''</span>
|}


V primeru vrat ALI-IN (tabela 2), ki so nadgradnja prvih vrat, pa je DARPin D22 na površino membrane pripet preko reverzibilne disulfidne vezi, zaradi česar se lahko odcepi z nje bodisi ob prisotnosti MMP-9 ali ob prisotnosti reducenta, ki bo povzročil cepitev disulfidne vezi. Za nastanek pore pa je seveda hkrati potrebno znižanje vrednosti pH, ki aktivira Y406A.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 2: Pravilnostna tabela vrat ALI-IN.'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|MMP-9
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|reducent 
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|pH < 6,5
! style="width: 70px; background: #A2D890;border: 1px solid darkgray"|pora
|- 
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |<span style="color:red">'''0'''</span>
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |<span style="color:red">'''0'''</span>
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |<span style="color:red">'''0'''</span>
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |<span style="color:red">'''0'''</span>
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |<span style="color:red">'''0'''</span>
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |<span style="color:green">'''1'''</span>
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |0
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |<span style="color:green">'''1'''</span>
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |<span style="color:green">'''1'''</span>
|}


Delovanje sistema so preizkusili tako, da so pripravili vezikle, ki so vsebovali fluorofor kalcein, ki se je ob nastanku por sprostil iz veziklov. Z merjenjem fluorescence okolice so lahko tako primerjali delež sproščenega kalceina pri različnih pogojih. Sistem se je izkazal za učinkovitega, saj je fluorescenca signifikantno narasla ob pravilni kombinaciji vhodnih signalov, pri čemer pa se je sistem močneje odzval na prisotnost reducenta kot na prisotnost MMP-9 [2].

==Možne praktične uporabe sistema==
Zgoraj opisan sistem ima potencial za uporabo v terapevtske namene kot sistem za tarčno dostavo protitumorskih učinkovin, ki bi jih zapakirali v vezikle z na površino pritrjenima Y406A in DARPinom D22. Tako bi prišlo do sprostitve učinkovin iz veziklov šele, ko bi te prispeli do rakavih tkiv, za katere so značilni bolj kislo okolje [8], višja raven glutationa [9], ki deluje kot reducent,  ter povečano izražanje številnih proteaz, med drugim tudi MMP-9 [10]. Relativno velika velikost nastalih por (d ≈ 20 nm) pa omogoča dostavo ne le majhnih molekul temveč tudi bioloških zdravil.

Ob tem pa velja izpostaviti morebitno pomanjkljivost tega sistema, ki je v članku sicer niso navajali, in to je nestabilnost monomernih podenot listeriolizina O pri temperaturah nad 30 °C in nevtralni vrednosti pH, zaradi česar bi lahko prišlo ob vnosu veziklov v krvni obtok do agregacije Y406A, preden bi vezikli dospeli do svojega cilja, kjer veljajo bolj kisli pogoji. Ker so bili vsi dosedanji eksperimenti izvedeni pri temperaturah nižjih od 30 °C, kjer agregacija listeriolizina O ni problem, bi bilo tako potrebno preveriti delovanje sistema tudi pri višjih temperaturah ter optimizirati termično stabilnost Y406A, če bi se ta izkazala za problematično.

==Viri==
1.	Van Meer, G., Voelker, D.R. & Feigenson, G.W. (2008). Membrane lipids: Where they are and how they behave. ''Nature Reviews Molecular Cell Biology'' '''9''', 112–124.

2.	Omersa, N., Aden, S., Kisovec, M., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2020). Design of Protein Logic Gate System Operating on Lipid Membranes. ''ACS Synthetic Biology'' '''9''', 316–328.

3.	Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F. & Cossart, P. (2012). Listeriolysin O: The Swiss army knife of Listeria. ''Trends in Microbiology'' '''20''', 360–368.

4.	Peraro, M.D. & Van Der Goot, F.G. (2016). Pore-forming toxins: Ancient, but never really out of fashion. ''Nature Reviews Microbiology'' '''14''', 77–92.

5.	Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C. & Anderluh, G. (2012). pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. ''FEBS Journal'' '''279''', 126–141.

6.	Kisovec, M., Rezelj, S., Knap, P., Cajnko, M.M., Caserman, S., Flašker, A., Žnidaršič, N., Repǐ, M., Mavri, J., Ruan, Y., Scheuring, S., Podobnik, M. & Anderluh, G. (2017). Engineering a pH responsive pore forming protein. ''Scientific Reports'' '''7''', 1–13.

7.	Plückthun, A. (2015). Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): Binding Proteins for Research, Diagnostics, and Therapy. ''Annual Review of Pharmacology and Toxicology'' '''55''', 489–511.

8.	Kato, Y., Ozawa, S., Miyamoto, C., Maehata, Y., Suzuki, A., Maeda, T. & Baba, Y. (2013). Acidic extracellular microenvironment and cancer. ''Cancer Cell International'' '''13''', 89.

9.	Estrela, J.M., Ortega, A. & Obrador, E. (2006). Glutathione in Cancer Biology and Therapy. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 43, 143–181.

10.	Bergers, G., Brekken, R., McMahon, G., Vu, T.H., Itoh, T., Tamaki, K., Tanzawa, K., Thorpe, P., Itohara, S., Werb, Z. & Hanahan, D. (2000). Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. ''Nature Cell Biology'' '''2''', 737–744.