View source for Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u

Angiogeneza je proces rasti krvnih žil, kar celicam omogoča dostop do hrane in kisika. Je zelo pomemben proces pri rasti tkiv, igra pa tudi zelo pomembno vlogo pri tvorbi tumorjev. Sodeluje tako pri rasti tumorjev, kot pri njihovi metastazi, ki je velik problem pri zdravljenju raka. Pri procesu angiogeneze sodeluje veliko angiogenskih faktorjev. Med te sodi tudi rastni factor placente, PGLF (''angl. Placental Growth Factor''), ki se pri veliko vrstah raka močneje izraža [1].

== Rastni factor placente ==
 
PLGF se veže na vaskularni endotelijski rastni faktor 1, VEGRF-1 (''angl. Vascular Endothelial Growth Factor''), kar aktivira fosfatidil inositol-3 kinazno pot, ki promovira preživetje celic, proliferacijo, migracijo in angiogenezo. Poleg tega se lahko aktivira povezava med potjo aktivirano z VEGFR-1 in VEGFR-2, kar lahko privede do indirektne aktivacije še te poti. Ker se PLGF pri rakavih celicah močneje izraža in omogoča rast tumorjev ter metastaziranje, je ta primeren za tarčo proti-angiogenske terapije. Terapije, ki ciljajo PLGF in so se pokazale za učinkovite, že obstajajo, npr.: TB-403 (proti-PLGF monoklonsko protitelo), zdravila na osnovi iRNA in peptidni antagonisti [1], [2].

== Nanotelo ==

Nanotelesa so variabilne domene protiteles, sestavljenih samo iz težke verige, ki jih najdemo pri družini Camelidae. So zelo uporabni, saj jih lahko proizvajamo v bakterijah, so majhni (~15 kDa), imajo nizko imunogenost, visoko stabilnost in afiniteto in so dobro topni [3].

== Zasnova in izvedba eksperimenta ==
 
Vzeli so ovrednoteno nativno proti-PLGF nanotelo, naredili so bioinformatsko analizo in zasnovali štiri mutante z višjo afiniteto od nativnega nanotelesa. Izbrali so mutanto z najvišjo afiniteto. Ker se monomerno nanotelo hitro očisti iz krvi, so za povečan učinek zasnovali bivalentno nanotelo, sestavljeno iz dveh genetsko enakih nanoteles ter ju povezali s tečajem laminega IgA. Ta linker so uporabili zaradi njegove velike gibljivosti. Pripravili so ga v vektorju pHEN6c s histidinsko oznako in signalno sekvenco za transport v periplazmo (PelB). Ekspresijo so izvedli v ''Escherichia coli'' seva TG1. Periplazmo so analizirali z elektroforezo NaDS-PAGE in hibridizacijo odtisa western. Afiniteto so opredelili z encimskoimunskim testom, ELISA (''angl. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay''). Ključne značilnosti za angiogenezo so: celična delitev, tvorba 3D kapilaram podobnih tubularnih struktur in migracija celic. Vpliv na angiogenezo so opredelili z naslednjimi metodami: testom celične delitve sesalskih celic HUVEC, testom tvorbe 3D kapilaram podobnih tubularnih struktur na sesalskih celicah HUVEC in testom migracije pri MCF-7 celični liniji [1], [2], [4], [5].

== Rezultati ==

Z analizo NaDS-PAGE so dokazali, da je produkt periplazme približno 2x večji od monomernega anti-PLGF nanotelesa in njegovo prisotnost potrdili s protitelesi pri hibridizaciji odtisa western. Tako so dokazali izražanje bivalentnega nanotelesa velikega ~30 kDa. Afiniteto vezave bivalentnega nanotelesa so določili s pomočjo encimskoimunskega testa po Beattyjevi metodi. Merili so optično gostoto pri 450 nm, pri vedno višjih koncentracijah bivalentnega nanotelesa. Vezavo so detektirali z protitelesom, sklopljenim s hrenovo peroksidazo. OD450 so merili pri dveh koncentracijah PLGF. Pri logaritemski skali koncentracije nenotelesa so dobili sigmoidno krivuljo. Za izračun so uporabili naslednji enačbi: kaff = (n-1)/2(n[Ab´]t - [Ab]t); n = [Ag]/[Ag´], pri čemer Ab označuje bivalentno nanotelo, Ag pa antigen, torej PLGF. Apostrof (´) označuje totalno koncentracijo pri OD-50, torej pri polovični vrednosti OD platoja. Izračunali so, da je afiniteta vezave 2x10-3 nM [1], [2], [6].
Za analizo učinkovitosti bivalentnega nanotelesa so izvedli tri teste: test celične delitve, test tvorbe 3D kapilaram podobnih tubularnih struktur in test migracije. Test proliferacije so izvedli tako, da so celicam celične linije HUVEC dodali različne koncentracije bivalentnega nanotelesa. Po 72 urah so izvedli test viabilnosti z MTT reagentom. Po 4-urni inkubaciji so dodali DMSO in izmerili absorbanco pri 570 nm. Ugotovili so, da je EC50 za proliferacijo 100 do 110 ng/mL. Pri testu tvorbe 3D kapilaram podobnih tubularnih struktur so naredili suspenzijo celic in citodeks-3 kroglic. Nato so jih čez noč inkubirali. Kroglice s celicami so nato resuspendirali in jim dodali kolagen tipa 1, ki je tvoril gel. Temu so dodali gojišče z različnimi koncetracijami bivalentnega nanotelesa, ter čez 3 dni pogledali rezultat. Ugotovili so, da je v tem primeru EC50 65-80 ng/mL. Test migracije so izvedli na plošči z vdolbinicami z dvemi nivoji, pri čemer lahko med nivoji prehajajo celice (''angl. Transwell''). V spodnji nivo so odpipetirali gojišče z 800 ng/mL bivalentnega protitelesa, na zgornji nivo so pa nacepili celice in gojišče. Za kontrolo so uporabili PBS. Zaznali so 65% inhibicijo migracije glede na kontrolo [1], [4], [6], [5].

== Zaključek ==

Razvoj tumorjev in njihova metastaza je zelo odvisna od angiogeneze, PLGF pa se je že v preteklosti izkazal kot uporabna tarča. Tudi to bivalentno nanotelo se je izkazalo za relativno učinkovito v ''in vitro'' testih. Izračunali so tudi afiniteto vezave bivalentnega nanotelesa na PLGF. Zaradi dobrih lastnosti nanoteles bi lahko bili zelo uporabni za zdravljenje raka [1].

== Viri ==

[1]	A. Nikooharf, R. Arezumand, K. Mansouri, A. H. Khoshi, and H. Namdar Ahmadabad, “Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation,” Mol. Biotechnol., vol. 62, no. 11–12, pp. 580–588, Dec. 2020, doi: 10.1007/s12033-020-00275-7.

[2]	R. Arezumand et al., “Identification and characterization of a novel nanobody against human placental growth factor to modulate angiogenesis,” Mol. Immunol., vol. 78, pp. 183–192, Oct. 2016, doi: 10.1016/j.molimm.2016.09.012.

[3]	S. Muyldermans, “Nanobodies: Natural Single-Domain Antibodies,” Annu. Rev. Biochem., vol. 82, no. 1, pp. 775–797, Jun. 2013, doi: 10.1146/annurev-biochem-063011-092449.

[4]	V, M, C, W, and D, “Turning the World Upside-Down in Cellulose for Improved Culturing and Imaging of Respiratory Challenges within a Human 3D Model,” Cells, vol. 8, no. 10, p. 1292, Oct. 2019, doi: 10.3390/cells8101292.

[5]	L. Di Blasio, F. Bussolino, and L. Primo, “Three-dimensional in vitro assay of endothelial cell invasion and capillary tube morphogenesis,” Methods Mol. Biol., vol. 1214, pp. 41–47, 2015, doi: 10.1007/978-1-4939-1462-3_4.

[6]	J. D. Beatty, B. G. Beatty, and W. G. Vlahos, “Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay,” J. Immunol. Methods, vol. 100, no. 1–2, pp. 173–179, Jun. 1987, doi: 10.1016/0022-1759(87)90187-6.