View source for Reprogramiranje z doksiciklinom inducibilnega genskega stikala za bakterijsko posredovano terapijo


Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s11307-023-01879-6 Reprogramming a Doxycycline-Inducible Gene Switch System for Bacteria-Mediated Cancer Therapy]

== Uvod ==
Oslabljena Salmonella typhimurium lahko tvori kolonije znotraj tumorja in inhibira njegovo rast. V študiji, ki so jo izvedli Ngo in sodelavci so želeli razviti z doksiciklinom inducibilno gensko stikalov v oslabljeni S. typhimurium in raziskati njegovo terapevtsko učinkovitost na mišjih modelih. S. typhimurium je uporabna zaradi svoje nizke sistemske toksičnosti in selektivne kolonizacije v tumorjih, kar vodi do pomanjkanja kisika, hranil in protitumorskega imunskega odziva. Bakterije lahko genetsko spremenimo, da izražajo terapevtske gene, ki povečajo njihovo proti tumorsko delovanje. Pri tem je za maksimalno učinkovitost pomembno, da načrtujemo kdaj je najbolj optimalno, da se začne izražati terapevtski gen. Običajno to nastopi 1-3 dni po administraciji bakterij. Inducibilni promotorji, zlasti Ptet so uporabni za bakterijsko posredovano terapijo (BCT). Ptet izstopa zaradi njegove sposobnosti, da inducira ekspresijo genov že pri nizkih koncentracijah doksiciklina. Enostavno prehaja bakterijsko membrano in ima primeren razpolovni čas za in-vivo aplikacije (18 ur) [1]. 
Z razvojem sintezne biologije so se razvila tudi genetska vezja, katerih namen je imeti nadzor nad močjo in časom izražanja tarčnega gena, glede na vhodni signal [1, 2]. V študiji so za induciranje izražanja genov uporabili mestno specifično rekombinacijo, imenovano gensko stikalo. V študiji so ustvarili z doksiciklinom inducibilno gensko stikalo, iz dveh plazmidov. Prvi je nosil zapis za rekombinazo FimE pod nadzorom promotorja Ptet, drugi pa terapevtske gene navzdol od konstitutivnega promotorja z dvema inverznima ponovitvama. Tovorna gena sta bila bioluminiscenčni reporter Rluc8 in bakterijski toksin citolizin A (ClyA). Sistem so transformirali v S. typhimurium CNC018, ki ima prekinjene dve gruči genov imenovanih Salmonella patogeni otočki (SPI-1 in SPI-2). Učinkovitost genskega stikala so preverili v transformiranih CNC018, njegovo proti tumorsko učinkovitost pa v miškah, ki so nosile tumorje CT26 in MC28 (povzroča raka na črevesju [3])[1]. 

== Izvedba ==
Za analizo kooperacije med kooperatorskimi in goljufivimi celicami so uporabili optogenetiko. Metoda temelji na uporabi svetlobe za aktivacijo celic. Ta tehnika se uporablja v nevrologiji za identifikacijo funkcije nevronov v možganih ter za zdravljenje možganskih motenj. V tem primeru so uporabili genetsko modificirane kvasovke ki so sintetizirale SUC2p encim ob prisotnosti modre svetlobe. Za primerjavo kooperacije/kompeticije celic so izvedli več poskusov kjer so spreminjali osvetljeno območje ter intenziteto svetlobe [1,4,5].

Oslabljeno S. typhimurium so pripravili s prekinitvijo genov relA in spoT ter popolno delecijo gruče genov SPI-1 in SPI-2, ki so odgovorni za invazijo bakterije v gostiteljsko celico ter razmnoževanje v le-tej. Bakterijo so transformirali z elektroporacijo in gojili na LB agarnih ploščah z ampicilinom in/ali kloramfenikolom.
Plazmid NIA3, ki nosi gen za rekombinazo FimE so s PCR pomnožili z in brez oznake Flag. Očiščene fragmente so rezali z SpeI in StuI in ligirali v plazmid pJH18, ki nosi odpornost za ampicilin. Dobljena plazmida so imenovali pJHFimTag in pJHFimNoTag. Obe verziji sta bili pod nadzorom PtetA v Ptet dualnem promotorju. Kot tarčo za rekombinacijo so načrtali DNA zaporedje močnega konstitutivnega promotorja POXB20, z inverznimi ponovitavmi na levem in desnem koncu. Fragment so pomnožili s tremi PCR reakcijami in končni produkt poimenovali OXB20 stikalni blok. Rluc8 gen so pomnožili tako, da je nosil zapis za oznako His. OXB20 stikalni blok in Rluc8 so ligirali v plazmid pTU2S. Dobljen plazmid imenovan p15AOXBR je nosil zapis za odpornost na kloramfenikol. Zapis za clyA gen so pripravili z oznako Myc in ligirali v plazmid p15AOXBR, dobljeni plazmid pa poimenovali p15AOXBC. Zapisa za Rluc8 in ClyA sta bila pod obrnjenim promotorjem. Eden izmed plazmidov, ki nosi zapis za FimE (pJHFimTag ali pJHFimNoTag) in plazmid p15AOXBR so kotransformirali v bakterije CNC018. Kot kontrolo na Doxy – inducibilno stikalo so pripravili CNC018 bakterije, transformirane s pJH18-Rluc8(AP), pJH18-Rluc(RP) ali pJH19-ClyA(AP). V teh konstruktih je bil Rluc8 gen pod nadzorom promotorjev PtetA in Ptet, clyA gen pa pod promotorjem Ptet. Transformirane celice so preko noči gojili na 37 °C, jih razredčili v svežem LB mediju in nato gojili do srednje log faze, kjer so dodali različne koncentracije doksiciklina (0-500 ng/mL). 
Za preučevanje distribucije bakterij uporabili miške, ki so jim injicirali CT26 celice. Aplikacija je bila subkutana na desni bok. Ko je tumor dosegel velikost 80-120 mm3 so intravenozno injicirali CNC018 ali ΔppGpp bakterije. Ko je tumor dosegel 150 mm3 so intravenozno injicirali CNC018::pFimTagOXBR ali CNC018::pJH18-Rluc8(AP) bakterije. Prejele so oralno administracijo doksiciklina (1,7 mg/kg telesne teže) 1, 2 ali 3 dni po injiciranju z bakterijami. Za ugotavljanje proti tumorske aktivnosti Doxy – inducibilnega clyA stikala so uporabili CT26 in MC38 tumorske celice, ki so jih subkutano implementirali v ženske miške stare 6 tednov. Kot kontrolo si CNC018::pJH18-ClyA intravenozno injicirali v miške z mutacijo CT26.

== Rezultati ==
Doxy - inducibilno stikalo je bilo sestavljeno iz dveh plazmidov. pJHFimTag, ki nosi ColE1 ori in odpornost na ampicillin. Kodira za represor TetR pod nadzorom šibkega konstitutivnega promotorja POXB1 in FimE z oznako Flag pod promotorjem PtetA. Za inverzijo je zadostna že nizka količina FimE, zato so odstranili RBS pred ORF. Drugi plazmid, ki je imel tarčo za rekombinacijo (p15AOXBR z Rluc8 ali p15AOXBR z clyA) je prisoten v nizkem številu kopij, nosi p15A ori, odpornost na kloramfenikol in OXB20 stikalni blok, ki ima močan konstitutivni promotor POXB20 s tarčnimi zaporedji za rekombinazo na obeh koncih. Preiskovana gena (GOI) sta bila na nasprotni strani POXB20. Ekspresijo so inducirali z dodatkom doksiciklina. Ob odsotnosti le-tega se je konstitutivno izražal TetR, kar je inhibiralo ekspresijo fimE gena. Ob prisotnosti le tega pa se doksiciklin veže na TetR in se sprosti s Ptet, kar inducira izražanje fimE, to pa inducira rekombinacijo OXB20 stikalnega bloka z POXB20 tako, da se usmeri proti GOI.
Funkcionalnost genetskega stikalo so ocenili z merjenjem bioluminescence, ki jo je generiral Rluc8. Bioluminiscenca se je povečala v odvisnosti od dodanega doksiciklina v prvih 18 urah nato pa se malo zmanjšala. Signal je bil precej višji v kolonijah, ki so bile transformirane s pGimTagOXBR v primerjavi s pFimNoTagOXBR, kar so pripisali temu, da se fimE gen z oznako bolje izraža. Da so izmerili v kolikšni meri je potekla rekombinacija so izvedli analizo z PCR. Uporabili so specifične primerje, ki bi morali delovati samo v primeru, ko je potekla rekombinacija (ON stanje). Pričakovanih fragmentov niso zaznali v bakteriji, kjer je bila koncentracija dodanega doksiciklina manj kot 5 ng/mL, kar pomeni da je bilo puščanje promotorja zanemarljivo majhno. Signifikantna meja detekcije je bila pri 20 ng/mL za CNC::pFimTagOXBR in 100 ng/mL pri CNC:pFimNoTagOXBR. Rezultati prenosa Western so bili konsistenti s tistimi dobljenimi pri bioluminiscenci in PCR.
===Genetska stabilnost rekombinacije===
FimE inducira enosmerno inverzijo gena, ki ima na robu inverzne ponovitve, rekombinaza namreč prepozna IRR bolj učinkovito kot IRL. Rekombinacija gena se zato ohranja in je dedna. Prenos Doxy – inducibilnega stikala so preverili z uporabo CNC018:pFimTaxOXBR bakterij, ki so jih inducirali z različnimi koncentracijah doksiciklina, jih gojili v prisotnosti le-tega 18 ur nato pa 3 dni gojili brez prisotnosti doksiciklina. Ekspresijo Rluc8 so ocenili s prenosom Western. Šibka lisa se je pojavila pri bakterijah, ki so prvotno rastle z doksiciklinom s koncentracijo 100 ng/mL in je naraščala s koncentracijo do 500 ng/mL. Pri koncentracijah pod 300 ng/mL je bila raven ekspresije Rluc8 po 18 urah inkubacije z doksiciklinom višja kot v kulturah odvzetih po treh dneh, kar so pripisali nepopolni rekombinaciji pri nižjih koncentracijah doksiciklina. Pri koncentraciji 500 ng/mL pa je bila rekombinacija stabilno ohranjena vsaj 3 dni. 
===Biodistribucija CNC018 bakterij v CT26 miškah===
Prisotnost bakterij CNC018 in ΔppGpp so preverjali v tumorju, jetrih, vranici in krvi s kvantificiranjem viabilnih bakterijskih populacij 1, 2, 3 in 5 dni po administraciji. Oba seva sta pokazala močno prisotnost znotraj tumorja od prvega dne. Signifikantni delež ΔppGpp je bil zaznan v jetrih in vranici 1 in 2 dan, CNC018 pa niso bile prisotne v teh tkivih nad mejo detekcije (1x103 CFU). 1 dan po injiciranju v krvi niso zaznali niti CNC018, niti ΔppGpp. Prav tako so pokazali, da se lahko Doxy – inducibilni sistem v sevu CNC018 inducira že prvi dan aplikacije.
Za tarčenje tumorja transformiranih bakterijskih celic so CNC018:pFimTagOXBR intravenozno injicirali v CT26 miške. Bioluminiscence niso zaznali 3 dni v miškah, ki niso dobile doksiciklina. Miši, ki so dobile doksiciklin 1, 2 ali 3 dni po administraciji so imele merljiv signal znotraj tumorja in so dosegle maksimum 2-3 dni po indukciji z doksiciklinom. Maksimalni signal je bil višji pri miših, ki so dobile doksiciklin 1 ali 2 dan. Glede na kontrolo so zaključili, da se bakterije z Doxy – inducibilnim stikalom lokalizirajo v tumorsko tkivo znotraj dveh dni po intravenozni aplikaciji in da je indukcija z doksiciklinom 1 ali 2 dni po injekciji optimalna za rekombinacijo.
===Proti tumorski učinek transformiranih bakterij===
In vivo protitumorski efekt CNC::pFimTagOXBC so okarakterizirali z uporabo konstrukta, ki je nosil pJHFimTag za izražanje FimE in p15AOXBC za izražanje ClyA. ClyA niso zaznali v odsotnosti doksiciklina, nizke koncentracije proteina pa so zaznali pri koncentraciji 5 ng/mL doksiciklina. Hemolitično aktivnost bakterije so ocenili z gojenjem na krvnem agarju v prisotnosti različnih koncentracij doksiciklina. Kolonije s hemolitičnimi conami so se pojavili na ploščah s koncentracijo 5 ng/mL, število pa je naraščalo z naraščajočo koncentracijo. ClyA se torej funkcionalno izraža po rekombinaciji. 
Protitumorski efekt so ocenjevali v BALB/c miškah z CT26 tumorji. Doksiciklin so oralno administrirali 1, 2 ali 3 dni po injiciranju bakterij. Miši, ki so tretirali z bakterijami v odsotnosti doksiciklina (brez indukcije) so imele signifikantno supresijo tumorja v primerjavi z netretiranimi mišmi. Supresivni efekt pa se je povečal v vseh skupinah, kjer je potekla indukcija, najopaznejša pa je bila v prvi skupini (indukcija 1 dan po aplikaciji bakterij). 51 dan so opazili popolno uničenje tumorja v skupinah, ki so bile inducirane z doksiciklinom (83%, 75% in 58% v vsaki skupini). Podobne protitumorske efekte so opazili tudi pri miših s tumorji MC38.

== Zaključek ==
Sistem je omogočal nadzor nad ekspresijo tarčnega gena po enkratni administraciji doksiciklina. Učinkovitost je bila ocenjena in vitro in in vivo, kjer so potrdili, da je uspešen pri supresiji rasti tumorja v miših.

== Literatura ==

[1]	H. T.-T. Ngo, D.-H. Nguyen, S.-H. You, K. Van Nguyen, S.-Y. Kim, Y. Hong, J.-J. Min: Reprogramming a Doxycycline-Inducible Gene Switch System for Bacteria-Mediated Cancer Therapy. Mol Imaging Biol 2024, 26, 148–161.

[2]	J. A. N. Brophy, C. A. Voigt: Principles of genetic circuit design. Nat Methods 2014, 11, 508–520.

[3]	T. Taniura, Y. Iida, H. Kotani, K. Ishitobi, Y. Tajima, M. Harada: Immunogenic chemotherapy in two mouse colon cancer models. Cancer Science 2020, 111, 3527–3539.