View source for S fazno separacijo posredovano sestavljanje večencimskih kompleksov in vivo

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.4c09585 Phase Separation-Mediated Multienzyme Assembly In Vivo]

= Uvod =

Nedavni napredki so poudarili ključno vlogo večencimskega sestavljanja v sintezni biologiji. Takšno urejanje običajno vključuje uporabo samosestavljalnih proteinov, ki delujejo kot ogrodja. V nasprotju s konvencionalnimi strategijami, pri katerih imajo večencimski kompleksi določeno stehiometrijo in geometrijo, obetavna alternativa vključuje prostorsko ločitev encimov znotraj brezmembranskih organelov, ki se oblikujejo s pomočjo fazne separacije proteinov tekoče-tekoče (LLPS). Ti fazno ločeni kondenzati zagotavljajo ogrodje za vezavo metabolnih encimov, pri čemer nastajajo večencimski kondenzati tako ''in vivo'' kot ''in vitro''. Domena RGG, ki izhaja iz proteina LAF-1, je bila identificirana kot intrinzična neurejena domena, idealna za oblikovanje brezmembranskih kondenzatov s pomočjo LLPS. Zlasti domena RGGRGG, sestavljena iz dveh domen RGG, izkazuje večjo stabilnost pri povišanih temperaturah, kar bi lahko bilo bolje uporabno pri samosestavljanju v večencimske komplekse.

Poleg samosestavljalnih proteinov je nastanek teh kompleksov odvisen tudi od označevalnih sistemov (oznak in pripadajočih lovilcev), kot so SpyTag/SpyCatcher, SnoopTag/SnoopCatcher in NGTag/NGCatcher. Na podlagi teh sistemov so v študiji Young in sod. uspešno konstruirali domeno C1 proteina Cpe0147 iz ''Clostridium perfringen'' in jo razdelili med C-končno skrajšani protein Cpe0147(439-563) in protein Cpe0147(565-587), ki ''in vitro'' spontano tvorita estrsko vez. V izbranem članku so razvili izboljšan sistem označevanja proteinov, ReverseTag/ReverseCatcher, ki temelji na tvorbi estrske vezi z visoko učinkovitostjo kovalentne vezave. Sistem so nato ''in vivo'' združili s fazno ločenim proteinom RGGRGG. Cilj študije je bil potrditi zmožnost sistema ReverseTag/ReverseCatcher za usmerjanje sestavljanja večencimskih kompleksov. Za testiranje te zmožnosti so si izbrali produkcijo likopena.

= Razvoj in testiranje sistema ReverseTag/ReverseCatcher =

== Računalniška izdelava modela ReverseCatcher_RGGRGG ==

Model RGGRGG je bil sprva zgrajen lokalno z uporabo programa RosettaFold, pri čemer je bil izbran model z najboljšim rezultatom, ki so ga nato optimizirali s simulacijami molekulske dinamike (MD). Za izdelavo modela ReverseCatcher_RGGRGG je bila struktura ReverseCatcher-ja ustvarjena z uporabo programa PyMol na podlagi PDB strukture ponovitve prej omenjenega proteina Cpe0147 (PDB ID: 4ni6). ReverseCatcher in RGGRGG so povezali z (GGGGS)2-linkerjem in nato tudi končni ReverseCatcher_RGGRGG optimizirali s simulacijami MD.

== Sestavljalni mehanizem RGGRGG ==

Za optimizacijo uporabe RGGRGG so po simulacijah MD uporabili še simulacije  »coarse-grained« (CG), da ugotovili mehanizem sestavljanja. Za izvedbo 1 μs simulacije CG so uporabili 93 domen RGGRGG. Izračuni topilu dostopne površine (SASA) so nakazali, da je 93 domen RGGRGG agregiralo skupaj. Do 500 ns so se vse domene RGGRGG združile v mrežno strukturo z vidno praznino v središču agregata.

Da bi raziskali interakcije med domenami, so pregledali še več RGGRGG-polimerov. Domene RGGRGG so med seboj povezane preko koncev, pri čemer vsaka veriga medsebojno interagira z drugo in ohranja kohezijo s številnimi vodikovimi vezmi. Drug način interakcij vključuje poravnavo dveh monomerov RGGRGG v obliki »križa« ali »T«. Poleg vodikovih vezi je ključen dejavnik za te interakcije še tvorba solnih mostičkov med Asp (ali Glu) in Arg ostanki, saj zaporedje RGGRGG vsebuje 48 Arg ostankov (15,12 %), 34 Asp ostankov (10,00 %), in 7 Glu ostankov (2,06 %), ki so skoraj enakomerno razporejeni na površini RGGRGG.

== Karakteristike ReverseCatcher_RGGRGG kondenzatov ==

Na N-konec RGGRGG so nato dodali oznako ReverseCatcher, pri čemer je nastala različica ReverseCatcher_RGGRGG. Da bi ocenili, ali je fuzija spremenila lastnosti RGGRGG, so z analizo obnovitve fluorescence po beljenju (FRAP) ocenili pretočnost obeh različic, ki so jih sklopili z GFP (RGGRGG_GFP in ReverseCatcher_RGGRGG_GFP). Po fotobeljenju izbranih regij se je pri obeh različicah do neke pojavila obnovitev fluorescence v 30 s, kar pomeni, da fuzija ne spremeni inherentne 'fluidnosti'.

Pri slikanju kondenzatov ReverseCatcher_RGGRGG, ki so nastali pri pH 7, s TEM, so opazili delce velikosti približno 500 nm, medtem ko RGGRGG v nevtralnih pogojih tvori večje kondenzate s premeri 1-10 μm. Za boljše razumevanje so izvedli simulacije MD na računalniškem modelu. V modelu je bil ReverseCatcher priklopljen na RGGRGG v konfiguraciji v obliki črke T. Na površini RGGRGG je bila razvidna izrazita porazdelitev naboja, medtem ko je imel ReverseCatcher na svoji površini negativen naboj. Negativno nabita območja ReverseCatcher-ja interagirajo s pozitivno nabitimi območji RGGRGG, kar torej spremeni dinamiko med domenami RGGRGG in povzročil manjšo velikost kondenzatov ReverseCatcher_RGGRGG. 

Opazovali so tudi vpliv temperature na formacijo kondenzatov ReverseCatcher_RGGRGG in ugotovili, da so ti občutljivi na temperaturo, saj se je velikost kondenzatov pri zvišanju temperature iz 4 na 16 °C velikost zmanjšala iz 513,4 na 283,1 nm, pri temperaturi 37 °C pa se je velikost povečala na 1235,1 nm.

== Potrditev samosestavljanja glede na kondenzate ReverseCatcher-RGGRGG ==

Da bi potrdili sposobnost proteinov z oznako ReverseTag, da se kopičijo v kondenzatih ReverseCatcher_RGGRGG zaradi nastanka estrske vezi, so uporabili sklopitvi ReverseTag z GFP in mCherry (ReverseTag_GFP in ReverseTag_mCherry) za ''in vitro'' preverjanje interakcije z ReverseCatcher_RGGRGG. Analiza NaDS-PAGE je potrdila, da sta ReverseTag_GFP in ReverseTag_mCherry uspešno tvorila estrske vezi z Reverse-Catcher_RGGRGG. Ko so hkrati inkubirali Reverse-Tag_GFP, ReverseTag_mCherry in ReverseCatcher_RGGRGG, se je intenzivnost fluorescence pri valovni dolžini 510 nm zmanjšala in povečala intenzivnosti fluorescence pri 610 nm v primerjavi s samo mešanico ReverseTag_GFP/ReverseTag_mCherry. To opažanje kaže, da je prostorska razdalja med ReverseTag_GFP in ReverseTag_mCherry manjša kot 10 nm. Poleg tega je skeniranje s konfokalnim mikroskopom (CLSM) pokazalo, da sta se ReverseTag_GFP in ReverseTag_mCherry sočasno »samosestavila« znotraj kondenzatov ReverseCatcher_RGGRGG, kar zagotavlja neposreden vizualni dokaz za njuno kolokalizacijo.

== ReverseCatcher_RGGRGG omogoča sestavo večencimskih kompleksov ''in vivo'' ==

ReverseCatcher_RGGRGG so prekomerno izražali v ''E. coli'' BL21 (DE3), nato pa so s transmisijskim elektronskim mikroskopom (TEM) potrdili uspešno tvorbo ReverseCatcher_RGGRGG z enakomerno porazdelitvijo na obeh koncih in v sredini celice. Poleg tega so v ''E. coli'' BL21 (DE3) prekomerno koizražali še ReverseCatcher_RGGRGG, ReverseTag_GFP in ReverseTag_mCherry. Z metodo CLSM so opazili postopno kopičenje ReverseCatcher_RGGRGGG na obeh koncih celice, kar je sčasoma privedlo do nastanka kondenzatov na celičnih polih in v sredini celice. Poleg tega sta se ReverseTag_GFP in ReverseTag_mCherry učinkovito kolokalizirala z ReverseCatcher_RGGRGG.

== Povečana produkcija likopena s samosestavljanjem večencimskih kompleksov ==

Za oceno možnosti uporabe sistema ReverseTag/ReverseCatcher/RGGRGGG ''in vivo'' so kot model izbrali biosintezno pot likopena v ''E. coli'' BL21 (DE3). Sinteza likopena v mikroorganizmih poteka po dveh poteh: po poti MEP (2-C-meti-D-eritritol-4-fosfatni poti) in MVA (mevalonatni poti). V ''E. coli'' je proizvodnja likopena po poti MEP olajšana s prekomernim izražanjem ključnih encimov, kot so kot so geranilgeranil difosfat sintaza (CrtE), fitoen sintaza (CrtB) in fitoen desaturaza (CrtI). Sinteza likopena iz farnezil pirofosfata (FPP) je odvisna od delovanja farnezil difosfat sintaze (IspA), pri čemer FPP nastane iz izopentenil difosfata (IPP) in dimetilalil pirofosfatov (DMAPP). V celičnem kontekstu sta Idi in IspA lokalizirana v citoplazmi, CrtE, CrtB in CrtI pa se nahajajo v membrani. Poleg tega sta v citoplazmi prisotna še dva encima, 1-deoksi-D-ksiluloza-5-fosfat sintaza (Dxs) in 1-deoksi-D-ksiluloza-5-fosfat reduktaza (Dxr). Dxs katalizira pretvorbo piruvata in gliceraldehida-3-fosfata (G3P) v 1-deoksi-Dksiluloza-5-fosfat (DXP), ki se nato s katalitičnim delovanjem Dxr pretvori v MEP.

V študiji so načrtovali prekomerno izražanje CrtE, CrtB, CrtI, Dxr, Dxs in Idi za proizvodnjo likopena. Da bi ocenili, ali lahko združitev v večencimski kompleks, ki ga posreduje sistem ReverseTag/ReverseCatcher/RGGRGG, izboljša proizvodnjo likopena, so ustvarili dva seva ''E. coli'' BL21 (DE3): W3 in R3. Sev W3 nosi plazmide pET-22b-CrtI-CrtE-CrtB in pCDF-Duet-1-ReverseCatcher_RGGRGG-Dxr-Dxs-Idi, sev R3 pa vsebuje plazmida pET-22b-CrtI-CrtE-CrtB in pCDF-Duet-1-ReverseCatcher_RGGRGG-ReverseTag_Dxr-Reverse-Tag_Dxs-ReverseTag_Idi. 

Da bi potrdili nastanek fazno ločenih proteinov med fermentacijo likopena in preverili nadaljnjo sposobnost vezave encimov z oznako ReverseTag na ReverseCatcher_RGGRGG, so ReverseTag_Dxr_GFP, ReverseTag_Dxs_YFP in ReverseTag_Idi_mCherry koizrazili z ReverseCatcher_RGGRG v ''E. coli'' BL21 (DE3). Rezultati analize CLSM so pokazali, da so se ReverseTag_Dxr_GFP, ReverseTag_Dxs_YFP in ReverseTag_Idi_mCherry uspešno vezali na kondenzate ReverseCatcher_RGGRGG s tvorbo estrske vezi med ReverseTag in ReverseCatcher. Na koncu so izvedli fermentacijo likopena v sevih W3 in R3. Po 72 urah fermentacije je sev R3 proizvedel približno 108 mg/L, kar pomeni izjemno 5,4-kratno povečanje v primerjavi s sevom W3 . Opaziti je bilo, da je bil OD600 seva R3 nižji kot pri sevu W3. Da bi zagotovili, da povečana proizvodnja likopena ni posledica povečanega izražanja samih encimov, so znotrajcelične proteine sevov W3 in R3 pregledali z NaDS-PAGE. Analiza je pokazala, da so splošne ravni izražanja proteinov pri W3 in R3 ostale enake.

== Metabolomska analiza sevov W3 in R3 ==

Da bi raziskali vzroke za povečano proizvodnjo likopena, ki jo omogoča sestavljanje večencimskih kompleksov, so opravili metabolomsko analizo sevov W3 in R3. Analiza metabolnih poti v zbirki KEGG je pokazala 20 obogatenih poti, pri čemer je bil največji vpliv na citratni cikel (cikel TCA), metabolno pot piruvata, oksidativno fosforilacijo in številne metabolne poti aminokislin. V celičnih sistemih so izvedli obširno analizo, ki je zajemala cikel TCA, biosintezo likopena, glikolizo, pot pentoza fosfata in oksidativno fosforilacijo. Ugotovili so, da ima več metabolitov na teh poteh povečano izražanje. Analize so pokazale tudi povišane ravni ATP. Te ugotovitve kažejo, da ima ATP ključno vlogo pri povečani proizvodnji likopena, pri čemer regulacija cikla TCA vodi do povišane ravni ATP in posledično do povečanega izkoristka likopena.

= Zaključek =

V študiji so integrirali fazno ločeni protein RGGRGG s sistemom označevanja ReverseTag/ReverseCatcher, da bi raziskali njegov potencial za tvorbo večencimskih kompleksov. Proteini z oznako ReverseTag so se učinkovito sestavili znotraj kondenzatov ReverseCatcher_RGGRGG. V celičnih sistemih so prekomerno izrazili šest encimov, vključenih v biosintezo likopena, in imobilizirali ReverseTag_Dxr, ReverseTag_Dxs ter ReverseTag_Idi s tvorbo estrskih vezi z ReverseCatcher_RGGRGG. To je privedlo do kar 5,4-kratnega povečanja proizvodnje likopena v primerjavi s kontrolnimi skupinami. Opisana strategija sestavljanja predstavlja velik napredek na področju katalize z večencimskimi kompleksi.

= Literatura =

[1]	Y. Chen, Y. Shi, M. Li, D. Ming, W. Liu, X. Xu, L. Jiang: Phase Separation-Mediated Multienzyme Assembly In Vivo. ''J. Agric. Food Chem.'' '''2025''', 73, 7867–7876.