View source for Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli

==Uvod==

V zadnjem desetletju se je kot alternativa kemijski sintezi snovi razvijalo inženirstvo biosinteznih poti v mikroorganizmih. Mikroorganizmi imajo velik potencial za biosintezo goriv, kemikalij, farmacevtikov, nutracevtikov in drugih materialov. Da se tak način pridelave ekonomsko splača je pomembno, da imajo celice čim večjo produktivnost in izkoristek. To dosežemo s prekomernim izražanjem ključnih encimov, z izogibanjem nativne regulacije, z blokiranjem kompetentnih poti, z optimizacijo genoma, kar ni vedno enostavno, saj so procesi v celicah natančno regulirani. Vnos heterolognih encimov v umetne poti pogosto vodi do prekinitve ali izgube regulatornih procesov v celici, kar povzroči kopičenje intermediatov do toksične ravni, to pa zavira celično rast in zniža sintezo produktov. V številnih projektih so problem rešili z uporabo v naravi že obstoječih senzorjev [1]. Tak primer je senzor za malonil-CoA. Malonil-CoA je osnovna molekula za biosintezo maščobnih kislin, 3-hidroksipropionske kisline, poliketidov, flavonoidov in drugih snovi, katere lahko pretvorimo v biogoriva, masovne in fine kemikalije ter zdravila [2]. Malonil-CoA nastane s karboksilacijo acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo. Ta korak je prvi in ključen pri sintezi maščobnih kislin in ga z mehanizmom negativne povratne zanke nadzoruje senzor za malonil-CoA. Pri nizki koncentraciji senzor za malonil-CoA zviša izražanje acetil-CoA karboksilaze in ga zniža pri kopičenju malonil-CoA. Tak mehanizem uspešno znižuje toksičnost, ki je povezana s prekomernim izražanjem acetil-CoA karboksilaze in poveča titer ter produktivnost celic za 34 % in 33 % [3]. Poleg dinamične regulacije lahko senzor uporabimo za rešetanje knjižnic različnih sevov pri usmerjenem inženiringu encimov in sinteznih poti. In vivo meritve nam omogočijo neškodljivo, cenovno ugodno in visokozmogljivo alternativo klasičnemu spremljanju nastanka produktov z metodo LC/MS. Identifikacijo visokozmogljivih sevov nam omogoča vnos reporterskega gena v senzor, rešetanje pa poteka v kolonijah v mikrotitrskih ploščah ali pa preko metode FACS (fluorescence-activated cell sorting) [1]. Tak pristop je ubrala skupina Fehér ''et al''. pri razvoju sinteze rastlinskih flavonoidov v ''E. coli''. Želeli so razviti visokozmogljivo metodo za testiranje novih sinteznih poti in encimov ter optimizirati predpostavljen algoritem za računalniški program RetroPath, ki identificira in razvrsti poti v katerih se v ''E.coli'' sintetizira največ iskane molekule. 
 
==Senzor za malonil-CoA==

V raziskavah opisanega članka so uporabili senzor, ki ga je ustvarila skupina Dr. Fuzhong Zhang (Liu ''et a''l., 2015). Ustvarili so senzor za senzor za malonil-CoA z naravno prisotnim transkripcijskim faktorjem FapR iz gram pozitivnih bakterij ''Bacillus subtili''s [3]. ''E. coli'' takega sistema uravnavanja nima, zato so gen fapR iz B''. subtillis'' v ''E.coli'' klonirali preko plazmida pA8c-FapR z nizkim številom kopij pod kontrolo PBAD promotorja. Med tem so naredili še plazmid pBFR1k-rfp, ki je vseboval 17-bp dolgo zaporedje za vezavo FapR (s FapR reguliran promotor PFR1; aktivator) ter zapis za rdeči fluorescentni protein RFP.  Senzor deluje tako, da se v odsotnosti malonil-CoA FapR specifično veže na 17-bp dolgo zaporedje na DNA, kar predstavlja sterično oviro RNA polimerazi in zavira nastajanje RFP, v ''B. subtili''s pa zavira metabolizem maščobnih kislin in fosfolipidov. Ob prisotnosti malonil-CoA se ta veže na FapR, povzroči konformacijske spremembe FapR in ga sprosti z promotorja PFR1 ter omogoči prepisovanje RFP oziroma genov navzdol po DNA. 
 
==Rezultati==
V dosedanjih raziskavah so predpostavili in testirali različne poti za sintezo malonil-CoA pri katerih bi lahko povečali sintezo pinocembrina v ''E.coli.'' Izbrali so en gen za malonil-CoA sintazo (matB), enega za malonat-CoA transferazo (atoDA), dva za malonil-CoA reduktazo (mmsA in cag1256) in enega za acetil-CoA karboksilazo (accABCD) in vse gene hkrati izrazili v sintezni poti pinocembrina. 

•	'''Preverjanje funkcije senzorja za malonil-CoA'''

V raziskavi so za primerjavo produktivnosti malonil-CoA konstruktov so zgoraj opisani senzor vnesli v plazmid pCFR (odpornost na kloramfenikol). Delovanje pBFR1k_RFP_8FapR in pCFR so testirali s pomočjo cerulenina. To je inhibitor 3-ketoacil-ACP sintaze I in II, ki sodeluje v sintezi maščobnih kislin, inhibicija sintaze pa povzroči akumulacijo malonil-CoA ter zvišanje RFP fluorescence. Celice ''E. coli'' bodisi s plazmidom pBFR1k_RFP_8FapR ali pCFR so se na cerulenin odzvale z močnim zvišanjem v fluorescence. 

•	'''Optimizacija občutljivosti za boljšo detekcijo malonil-CoA'''

V prvotni raziskavi sta bili komponenti FapR (pA8c-fapR) in RFP (pBFR1k-rfp) senzorja za malonil-CoA karakterizirani ločeno na dveh plazmidih. V novi raziskavi pa so karakterizacijo ponovili na enem samem plazmidu pBFR1k_RFP_8FapR, ki je vseboval PBAD, fapR, PFR1, rfp ter zapis za odpornost na kanamicin. Izražanje nivoja FapR so uravnavali z dodatkom arabinoze, izražanje malonatnega transporterja (matC) in malonil-CoA sintaze (matB) iz plazmida pACYCmatCmatB pa z IPTG. Ker je prepisovanje FapR pod nadzorom promotorja PBAD je z višanjem koncentracije L-arabinoze promotor PFR1 vedno bolj inhibiran in se izraža manj RFP, fluorescenca pada. Izkazalo se je, da je optimalna koncentracija arabinoze 0,1 %, saj le ta zagotavlja specifičnost in občutljivost. Pri nižji koncentraciji arabinoze se specifičnost zniža, saj zaznamo fluorescenco ob dodatku IPTG tudi v odsotnosti malonil-CoA plazmida. Povišanje koncentracije arabinoze na 0,1 % močno zmanjša fluorescenco vzorca in zniža občutljivost ter razmerje signal/šum. 
 
•	'''Analiza konstruktov z nižjim številom kopij plazmidov'''

Dokazano je bilo, da ima prekomerno izražanje določenih komponent accABCD kompleksa (acetil-CoA karboksilaza) toksičen vpliv na celice, kar pa se lahko reši z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celico. Za accABCD kompleks so uporabili plazmid pMSD8 z ultra nizkim številom kopij ter plazmid pETM6-PaccABCD in pETM6-MaccABCD s srednjim številom kopij. Vsi trije plazmidi kazali odvisnost fluorescence od količine dodanega IPTG,  merjen signal je bil veliko višji od kontrolnega. Odločili so se tudi za kloniranje nabora raziskovanih genov v pACYC z znižanim številom kopij na ~15. Po izražanju vseh petih konstruktov (matCatoDA,  MaccABCD, mmsA, cagg1256, matCmatB) so celice še vedno normalno rastle in proizvajale merljivo, od IPTG odvisno fluorescenco. 
 
•	'''Testiranje vpliva substrata v gojišču'''

Testirali so tudi ali ima dodatek substratov za sintezo malonil-CoA v gojišče merljiv vpliv na nivo produktov. Eksperiment so ponovili s plazmidom pACYCmatCmatB in pACYCmatCatoDA z in brez dodatka Na-malonata in s plazmidom pRSFmmsA z in brez dodatka β-alanina. Pri pACYCmatCmatB so pri dodatku Na-malonata in koncentraciji 0,3 in 0,6 mM IPTG opazili občutno zvišanje fluorescence (tvorba produkta). Pri pACYCmatCatoDA pa je prisotnost Na-malonata močno znižala učinek fluorescenco pri koncentraciji nad 0,3 mM IPTG. Dodatek β-alanina k pRSFmmsA je imel negativen učinek pri kombinaciji z 0,6 mM IPTG. 

==Zaključek==

V raziskavah so v sevu BL21DE3 E. coli uspešno optimizirali senzor za malonil-CoA. Po testiranju različnih pogojev so ugotovili, da se najbolj optimalen ujema z že opisanimi v članku skupine Dr. Fuzhong Zhanga.  Genetsko stabilnost so povečali z uporabo vektorjev z nizkim številom kopij na celic (npr. pACYC).

Za primerjavo zbirke konstruktov štirih različnih sinteznih poti malonil-CoA, ki jih je predvidel RetroPath, so načrtali plazmid z odpornostjo na kloramfenikol. Med njimi tudi izbrali najboljši konstrukt – pACYCmatCmatDA, ki vsebuje zapis za malonat-CoA transferazo. Ugotovili so, da lahko delovanje pACYCmatCmatDA povežejo z izražanjem acetil-CoA karboksilaznega kompleksa, medtem ko je bilo izražanje genov mmsA in cagg1256 za malonil-CoA reduktazo veliko slabše. Tako so odkrili, da, sta poleg karboksilaze za povišanje biosinteze malonil-CoA pomembna tudi reduktaza in transferaza.

Za opis dinamike odzivnosti senzorja so predlagali model drugega reda, ki opisuje odvisnost fluorescence od biomase. Za vsak konstrukt so določili specifične parametre, ki so neodvisni od sprememb v sintezi malonil-CoA, kar kaže primerno robustnost senzorja za uporabo v regulaciji sinteznih poti. Poznavanje parametrov za izbrano pot je ključnega pomena za pravilno delovanje senzorja.

Kot najbolj nepričakovano ugotovitev so izpostavili vpliv substratov za malonil-CoA sintezo na nivo fluorescence senzorja. Za razlago takih rezultatov so predpostavili mehanizem v katerem ne pride do direktnega vpliva na senzor in s tem zmanjšane sinteze malonil-CoA, vendar atoDA in matB porabljata celični acetil-CoA in tako povzročita primanjkljaj energije. To pride še bolj do izraza ko k visoki koncentraciji encima dodamo manjkajoč substrat (malonat) in tako pomaknemo ravnotežje reakcije proti produktom. Primanjkljaj energije zavira sintezo RFP bolj kot jo lahko proizvede novonastali malonil-CoA. 

==Viri==

1.	Fehér, T., Vincent Libis, V., Carbonell, P. in Faulon, J.-L. A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2015, letn. 3, št. 46.

2.	Fowler, Z. L., Gikandi, W. W. in Koffas, M. A. Increased malonyl coenzyme A biosynthesis by tuning the Escherichia coli metabolic network and its application to flavanone production. Applied and Environmental Microbiology, 2009 letn. 75, št. 18, str. 5831 − 5839.

3.	Liu, D., Xiao, Y., Evans, B. in Zhang, F. Negative Feedback Regulation of Fatty Acid Production Based on a Malonyl-CoA Sensor−Actuator. ACS Synthetic Biology, 2015, letn. 4, št. 2, str. 132 – 140.