View source for Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za in vivo dostavo terapevtikov

Primarni vir:  M. Omar Din, Tal Danino, Arthur Prindle, Matt Skalak, Jangir Selimkhanov, Kaitlin Allen, Ellixis Julio, Eta Atolia, Lev S. Tsimring, Sangeeta N. Bhatia and Jeff Hasty, ''Synchronized cycles of bacterial lysis for in vivo delivery'', Nature, Aug 2016; 536(7614); 81-85; doi: 10.1038/nature18930 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5048415/#SD1


'''UVOD'''


Skozi sintezno biologijo so znanstveniki uvedli inženirske pristope v biologijo s namenom, da spremenijo delovanje celic tako, da novonastale celice opravljajo novo, za človeka koristno funkcijo. V nešteto prejšnjih raziskav je uporaba bakterij za zdravljenje raka dobro znana tema, vendar članek objavljen v reviji Nature leta 2016 prikazuje zelo inovativno in perspektivno strategijo, ki uporablja sintezno vezje za oboroževanje bakterij [1]. 
Gre za sintezno vezje, ki omogoča sinhronizirano lizo bakterijskih celic (SLC) v večkratnih ciklih, pri čemer se toksini (bakterijski tovor) sprostijo neposredno v tumor. S takšnim pristopom se zdravilo izloča na mesto bolezni in se hkrati omejuje bakterijska populacija v telesu. 


'''SINTEZNO VEZJE ZA SINHRONIZIRANO LIZO BAKTERIJSKIH CELIC'''


Skupina raziskovalcev je izdelala vezje za sinhronizirano lizo celic z uporabo pozitivnih in negativnih povratnih zank, ki vsebuje aktivator in plazmid za lizo celic. Skupni promotor (luxl) poganja izražanje avtoinduktorja AHL (acil-homoserin laktona) ter gena za lizo celic, ki jo sproži bakterifagni gen  (ϕ X174 E). Ko pride do aktivacije genov, ki so pod kontrolo promotorja, pride tudi do povečane sinteze AHL. V prisotnosti AHL se ta veže na LuxR in simulira transkripcijo AHL sintaze, ki pretvarja S-adenozilmetionin v AHL. To predstavlja pozitivno povratno zanko. Ker gre za majhno molekulo, se ta lahko razprši do sosednjih celic, kjer vklopi njihove promotorje kar dovede do kopičenja genov, ki so pod kontrolo tega promotorja ter sinteze AHL. Velika koncentracija AHL pa privede do pojava znanega kot zaznavanje celične gostote (quorum sensing), ki predstavlja sposobnost zaznavanja in odziva na gostoto prisotnih celic z gensko regulacijo. Bakterije, ki so sposobne prepoznati signalno molekulo, zaznati spremembo v njeni koncentraciji ter regulirati transkripcijo genov, lahko uporabljajo zaznavanje kvoruma za komunikacijo med celicami [2,3].

V vezju sta tudi prisotna gena za izražanje reporterskega proteina (sfGFP) in hemolizina E (hlyE). Hemolizin E pa predstavlja citotoksični tovor, ki naredi pore v fosfolipidnem dvosloju in tako ima antitumorsko vlogo [4]. 
Kot gostiteljsko bakterijo so uporabili Salmonella typhimurium, ki je bila že v prejšnjih in vivo poskusih obsežno raziskana in se je pokazalo da je varna pri kliničnih testiranjih na ljudeh. Uporabili so oslabljeni sev, v katerem so bile ustvarjene mutacije lipida A, ki povzročijo slabši imunski odziv kot sev divjega tipa. Omenjeni bakterijski sev pa ohrani sposobnosti ciljanja in selektivnega razmoževanja znotraj tumorjev [5].
S pomočjo sinteznega vezja, ki so ga vstavili v gostitelja S. typhimurium so spremljali dinamiko bakterijske populacije oziroma kopičenje signalne molekule AHL (veliko število bakterij), čemur je sledila liza bakterijskih celic, ki je populacijo hitro zmanjšala. Po množičnem samouničenju celic je manjše število bakterij ostalo prisotno ter je na novo začelo sintetizirati molekule AHL. Uporabljeno sintezno vezje omogoča celicam, da gredo skozi več ciklov zaznavanja GFP fluorescence oziroma več ciklov sinhronizirane lize bakterijskih celic, ko dosežejo mejno celično gostoto in sprostijo citotoksični tovor (vrh fluorescenčne emisije kaže na lizo bakterijskih celic) [1].

Za opazovanje bakterijske lize in sproščanja citotoksičnega tovora za uničevanje tumorskih celic in vitro so uporabljali mikrofluidne naprave, ki omogočajo gojenje so-kulture bakterijskih in rakavih celic. Znotraj kanala vzdolž mikrofluidne naprave so gojene rakave celice (suspendirana kultura celic HeLa), kanal pa obdajajo rastne komore, v katerih je posejana bakterijska kultura (oslabljen sev S. typhimurium, ki vsebuje vezje za sinhronizirano lizo celic (SLC)). Na ta način so lahko spremljali lizo bakterijskih celic in hkratno uničevanje rakavih celic [1]. 
Na začetku bakterijske lize so opazili uničevanje rakavih celic, kar je potrdilo učinkovito sproščanje antitumorskega bakterijskega tovora (hlyE). Primerjali so preživetje rakavih HeLa celic, ki so bile izpostavljene trem različnim suparnatantom iz S.typhimurium, in sicer supernatantom, ki vsebuje vezje SLC in hlyE gen, supernatantom, ki vsebuje samo SLC vezje in ne transformiranim celicam S.typhimurium, torej brez plazmida. Ugotovili so, da so celice HeLa, ki so bile izpostavljenje supernatantu bakterij s SLC vezjem in genom za hlyE popolnoma izgubile sposobnost preživetja. Preživetje celic HeLa v ostalima primeroma pa ni bilo bistveno spremenjeno. Tako so ugotovili, da naravno prisotne bakterije v medceličnem prostoru ne vplivajo na preživetje rakavih HeLa celic. S pomočjo in vitro poskusih so dokazali, da bakterije, ki vsebujejo SLC-hlyE vezje sprostijo dovolj citotoksičnih proteinov, da ubijejo rakave celice. 
Po narejenih in vitro poskusih so ugotovili, da ima SLC zmožnost ustvarjanja močne dinamike lize bakterijskih celic v prej omenjenih mikrofluidnih napravah pri različnih testiranih pogojih. Nihanja pogojev pa so nedvomno prisotna v zelo dinamičnem človeškem organizmu. Zaradi dinamičnosti in vivo sistema so tudi raziskali prilagodljivost obdobja lize bakterijskih celic. Ugotovili so, da SLC omogoča tudi prilagoditev obdobja lize in obseg sproščanja bakterijskega tovora. Pred testiranjem v in vivo pogojih so znanstveniki razvili tudi računalniški model z namenom določanja optimalne strategije za in vivo testiranja [1]. 
Učinkovitost sistema sinteznega vezja za sinhronizirano lizo celic v okviru in vivo tumorjev, so preverili v kolorektalnih tumorjih pri miših. Da bi se izognili izgubi plazmida v odsotnosti selekcijskega markerja v in vivo pogojih, so uporabili stabilizacijske elemente za zadrževanje plazmida v SLC sevu, kateri so opisani v prejšnjih raziskavah. Poleg tega so postavili luxCDABE (reporter v in vivo sistemih) in antitumorske gene pod kontrolo Luxl promotorja. Bakterije so najprej vbrizgali v tumorsko tkivo imunokompetentnih miših, ki so bile model za opazovanje dinamike bakterijske populacije znotraj tumorja. Slednjo so opazovali s tehnologijo In Vivo Imaging (IVIS). Bakterije so, poleg opisanega sinteznega vezja z hemolizinom E, vsebovale še podobna vezja, kjer so hemolizin E nadomestili z genom za aktiviranje imunskega odgovora gostitelja ter za sprožitev apoptoze tumorja. Opazili so, da mešanica treh omenjenih sevov (SLC-3) povzroči močnejši odziv kot kateri koli posamezni sev. Ugotovili so znatno znižanje števila bakterij prisotnih v tumorskem tkivu, kot tudi zmanjšanje velikosti tumorja.
Nato so uporabili model miške z metastazami v jetrih, katerim so dajali kombinacijo bakterij (SLC-3) in kemoterapevtikov. V številnih prejšnjih študijah je dokazano, da se anaerobne bakterije kopičijo na neprokrvavljenih tumorjih oziroma mestih brez dostopa kisika, kjer kemoterapija nima vpliva. Ta kombinacija zdravljenja, kjer bi bakterije sproščale antitumorske toksine v neožiljeno jezgro tumorja in bi se kemoterapija uporabljala za ožiljene cone tumorja, bi predstavljala idealno sinergijo v boju proti tumorjem. Z uporabo omenjene kombinacije so dosegli 50-odstotno podaljšanje življenske dobre miši, kar je največ v primerjavi s katero koli drugo terapijo za miši, ki so imele neozdravljive kolorektalne metastaze. 


'''ZAKLJUČEK'''


Skupina raziskovalcev je ugotovila, da omenjena metoda še ni ozdravila nobene miši in je vprašljivo, kako bi se ta pristop prenesel na ljudi. Predstavljeni sistem sinhroniziranega cikla lize bakterijski celic in sproščanja citotoksičnega tovora v in vivo pogojih bi lahko izboljšali s povečanjem stabilnosti vezja, zmanjšanjem njegove dovzetnosti za mutacije ali z uporabo dodatnega bakterijskega tovora, za uničevanje tumorskih celic. Prednost sinhronizirane lize bakterijskih celic in sproščanja terapevtskega tovora je v tem, da se z relativno enostavnim pristopom, lahko doseže veliko. Ob enem pa se tudi zmanjša število bakterij v gostitelju, kar zmanjša verjetnost vnetnega odziva [1]. 
Vsi skupaj izvedeni poskusi, tako v in vitro kot v in vivo pogojih, dokazujejo funkcionalnost orodij sintezne biologije oziroma sinteznega vezja za uspešno spreminjanje bakterij za tarčno uničevanje tumorskih celic z dovajanjem citotoksičnih terapevtikov.


'''LITERATURA'''

[1] M. Omar Din, Tal Danino, Arthur Prindle, Matt Skalak, Jangir Selimkhanov, Kaitlin Allen, Ellixis Julio, Eta Atolia, Lev S. Tsimring, Sangeeta N. Bhatia and Jeff Hasty, Synchronized cycles of bacterial lysis for in vivo delivery, Nature, Aug 2016; 536(7614); 81-85; doi: 10.1038/nature18930.

[2] Jiachuan Pan, Dacheng Ren, Quorum sensing inhibitors: a patent overwiew, Expert Opinion on Therapeutic Patents, 2009; 19 (11): 1581-1601, doi: 10.1517/13543770903222293. 

[3] Wai-Leung Ng, Bonnie L. Bassler, Bacterial quorum-sensing network architectures, Annual Review of Genetics, 2009; 43; 197-222, doi: 10.1146/annurev-genet-102108-134304.

[4] Chalmeau J., Monina N., Shin J., Vieu C., Noireaux V. α-Hemolysin pore formation into a supported phospholipid bilayer using cell-free expression, Biochimica Biophysica Acta, 2011, 1808 (1): 271–278, doi: 10.1016/j.bbamem.2010.07.027.

[5] Arthur Prindle, Jangir Selimkhanov, Tal Danino, Phillip Samayoa, Anna Goldberg Sangeeta N. Bhatia, Jeff Hasty, Genetic circuits in Salmonella typhimurium, ACS Synthetic Biology, 2012, 1(10); 458-464, doi: 10.1021/sb300060e