View source for Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju

Zdravljenje malignih obolenj predstavlja velik izziv, ki se mu raziskovalci po celem svetu intenzivno posvečajo že leta. V zadnjih letih se je razvila predvsem precizna onkologija, ki povečuje učinkovitost in zmanjšuje toksičnost preko molekularnega profiliranja tumorjev z identifikacijo unikatnih tarčnih antigenov, ki tumorske celice ločujejo od zdravih. Na drugem polu terapije raka je prominentna imunoterapija, ki učinkuje preko manipulacije imunskih celic, da le te ciljano delujejo na tumorske celice. Oba pristopa združuje pristop celične terapije CAR-T oziroma terapije s T celicami s himernim antigenskim receptorjem.
<p>Velika omejitev terapije CAR-T so neželeni učinki izmed katerih so še posebej problematični učinki na zdrave celice, ki izražajo tarčne antigene. V izogib te toksičnosti so raziskovalci v predstavljeni študiji razvili sintetični promotor sestavljen iz treh ločenih odzivnih elementov na citokinska faktorja IFNγ in TNFα ter hipoksijo v tumorskem mikrookolju. S kombiniranjem odzivnih elementov so sintetizirali promotor, ki omogoča inducirano izražanje CAR receptorja omejeno le na območje tumorja.</p>

<p>Povzeto po članku: Greenshpan, Y., Sharabi, O., Ottolenghi, A. ''idr.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun Biol'' 4, 143 ('''2021'''). https://www.nature.com/articles/s42003-021-01664-7
<br>Avtorica povzetka: Saša Slabe</p>

== Terapija z limfociti T s himernim antigenskimi receptorjem (CAR-T)==
Terapija CAR-T se večinoma izvaja avtologno in temelji na opremljanju pacientovih limfocitov T z receptorji CAR, ki prepoznajo specifične tumorske domene in sprožijo odziv limfocitov T. Fuzijski receptorji CAR so značilno sestavljeni iz vezavne domene, ekstracelularne povezovalne domene, transmembranske domene, signalizacijske in kostimulatorne domene, sestava pa se razlikuje glede na generacijo receptorja CAR. Priprava celične terapije se začne z levkoferezo, pri kateri pacientu odvzamejo limfocite T, jih aktivirajo in transformirajo s genom CAR. Po pomnoževanju celic le te vrnejo v pacienta v obliki infuzije [1, 2].
<p></p>
S terapijo CAR-T so povezani nekateri stranski učinki od nevrotoksičnosti, citokinskega sindroma in toksičnosti zaradi napada na zdrave celice, ki izražajo tarčni antigen. Problema slednjega so se ''Greenshpan in sod. (2021)'' v študiji lotili s pripravo sintetičnih promotorjev, vendar pa to ni edini način izogiba neželenim učinkom aktivacije izven tumorja, saj poznamo že vsaj štiri drugačne mehanizme: 
<br> a) <u> Vključitev samomorilnega gena za inducibilno kaspazo 9 ''iCasp9'' v limfocite T.</u> Pri tem po vnosu dimerizacijske učinkovine AP1903 v organizem pride v celicah, ki izražajo ''iCasp9'' gen, do dimerizacije iCasp9 in sledeče aktivacije apoptoze preko kaspaze 3 [1, 3].
<br> b) <u> Inhibicija delovanja celice CAR-T.</u>  Antigen prepoznavno domeno za antigene na zdravih celicah fuzijsko povežemo na inhibitorni receptor, kar vodi v zaviranje toksičnega delovanja na zdrave celice [1].
<br> c) <u>Razdelitev aktivacijskega signala med dva receptorja CAR.</u>  Aktivacijski signal razdelimo med dva receptorja, tako da vsak izmed receptorjev prepozna drug za tumorsko celico značilen antigen in vsak nosi samo deli signalizacijske/stimulacijske domene (npr. prvi CD3ζ in drugi CD28/4-1BB). Do aktivacije tako zasnovane celice CAR-T pride le ob prisotnosti obeh antigenov, ki sta načrtno izbrana, da je to statistično precej bolj verjetno na tumorski celici.
<br> d) <u>Fuzija od kisika odvisne poddomene HIF1α na ogrodje CAR.</u>  Preko tega pristopa je aktivnost limfocita T odvisna od hipoksične niše, ki je značilno prisotna v tumorskem mikrookolju [1].
 
== Sistem CARTIV ==
V študiji sintetičnih promotorjev za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju so se ''Greenshpan in sod.'' težave nespecifičnega učinkovanja lotili z združevanjem gena CAR s sintetičnim inducibilnim promotorjem, ki je občutljiv na kombinirane stimuluse prisotne v tumorskem mikrookolju, ki predstavlja tumorju bližnje strukture vključno s krvnimi žilami, imunskimi celicami, fibroblasti, signalnimi molekulami in ekstracelularnim matriksom, ki je pogosto hipoksičen [1].
<p>
Zasnovali so sintetične promotorje, ki so sestavljeni iz kombinacije promotorskih odzivnih elementov za citokinska stimulusa interferona gama IFNγ in dejavnika tumorske nekroze alfa TNFα ter hipoksični stimulus. Metodologijo so poimenovali CARTIV (''chimeric-antigen-receptor-tumor-induced-vector'') in kombinacijo odzivnih elementov optimizirali za sinergistični odziv na kombinacijo stimulusov v koncentracijah pričakovanih za tumorsko mikrookolje [1]. </p>

== Testiranje sintetičnih promotorjev ==
Raziskovalci so izbrali promotorske odzivne elemente GCPRE za IFNγ, KCPRE za TNFα in HCPRE za hipoksijo ter jih v različnih kombinacijah in vrstnem redu kombinirali navzgor od minimalnega promotorja timidin kinaze herpes virusa [4]. Učinkovitost promotorja so preverjali preko izražanja fluorescenčnega reporterja RFP670 v lentivirusnem vektorju, ki je za identifikacijo transformiranih celic s pretočno citometrijo vseboval še gen za fluorescenčni reporter ZsGreen pod konstitutivnim promotorjem EF1α [1].

==== Preverjanje delovanja promotorja z odzivnima elementoma KCPRE in GPCRE ====
Sprva so preverili delovanje promotorja z odzivnima elementoma za IFNγ in TNFα v celicah HEK293T, ki izražajo receptorja za omenjena citokina in se odzivajo nanju v širokem koncentracijskem območju. Testirali so različna števila ponovitev GCPRE in KCPRE, kombinacije le teh in GCPRE v kombinaciji s skrajšano sekvenco KCPRE. Celice so inkubirali 48 ur z dodatkom citokinov in analizirali ekspresijo reporterjev s pretočno citometrijo FACS. Po pričakovanjih se je reaktivnost na posamezni faktor povečevala z višanjem števila ponovitev odzivnega elementa, kombinacije z več ponovitvami GCPRE in KCPRE so kazale značilno višji odziv, vendar pa je bila njihova značilna sinergistična aktivacija nižja zaradi visoke indukcije že ob dodatku TNFα. Najboljšo sinergistično aktivacijo so opazili pri kombinaciji G1K0.6,kar pomeni da so kombinirali en odzivni element GCPRE in en skrajšani element KCPRE [1].
==== Optimizacija lokacije odzivnega elementa HCPRE ==== 
Kombiniranje več signalov, ki bi vplivali na izražanje receptorja CAR, naj bi izboljšalo ekspresijo, zato so se odločili izbrati še tretji signal. V tumorskem mikrookolju je pogosto prisotna hipoksija zaradi zmanjšanje vaskualizacije in preskrbe s krvjo, ki ne zadostuje potrebam hitro delečih tumorskih celic. Raziskovalce je zanimalo ali lokacija HCPRE glede na minimalni promotor timidin kinaze vpliva na izražanje gena, zato so pripravili promotorje H2G2K2, G2H2K2 in G2K2H2. Odziv po 18-urni izpostavljenosti transformiranih HEK293T je bil največji pri promotorju, kjer je HCPRE lociran proksimalno minimalnemu promotorju timidin kinaze z 3,91× povečanjem. Rezultat je bil pričakovan, saj se odzivni elementi HRE navadno nahajajo 100-1000 baznih parov navzgor od start kodona ATG [1].
==== Odziv na fiziološke koncentracije stimulatornih signalov ==== 
Zasnovani promotor G1K0.6H1, ki se je v predhodnih eksperimentih izkazal za najbolj optimalnega, so preizkusili pri 500 U/mL koncentraciji IFNγ in TNFα v kombinaciji z normalno koncentracijo kisika ali 18 urno hipoksijo. Ugotovili so, da pri teh pogojih dodatek hipoksije ne vpliva značilno na aktivacijo promotorja. Delovanje so preverili še pri nižjih koncentracijah citokinskih faktorjev med 0 U/mL in 125 U/mL, ki so bolj podobne koncentracijam v tumorskem mikrookolju, in ugotovili, da je pri koncentracijah citokinov nižjih od 32 U/mL sinergističen učinek dodanih hipoksičnih pogojev bolj izrazit in je  zato vključitev HCPRE odzivnega elementa v sintetični promotor smiselna [1].
==== Preverjanje učinkovitosti v imunskih celicah NK92 in primarnih limfocitih T ==== 
Po preverjeni učinkovitosti v celični liniji HEK293T so raziskovalci preverili ali je promotor G1K0.6H1 aktiven tudi v imunskih efektorskih celicah, kjer bi bil dejansko relevanten v okviru terapije CAR-T. Primarne limfocite T in naravne celice ubijalke NK92 so stabilno transficirali z lentivirusnim vektorjem in zaznali signifikanten odziv na kombinirano stimulacijo z TNFα in hipoksijo. Učinka IFNγ niso opazili, kar je verjetno posledica endogene sekrecije IFNγ iz uporabljenih celic. Nadalje so reporterski protein RFP670 zamenjali s konstruktom CAR 3. generacije. Receptor je bil zasnovan iz transtuzumaba (humanizirano monoklonsko protitelo, ki se veže na receptor HER2), CD28 in 4-1BB kostimulatornih motivov in CD3ζ verige. ZsGreen pozitivne celice so po trojni stimulaciji pričakovano dobro izražale receptor, prišlo pa je tudi do signifikantne degranulacije v primerjavi s kontrolami ob stiku z HER2+ celicami [1].
==== Analiza učinkovitosti promotorja v tumorskem mikrookolju na modelu CDX ==== 
V namen tovrstne analize so pripravili ksenografski model z injiciranjem HER2+ JIMT-1 celice raka dojke v imunokomprimitirane NSG miši. Ko so tumorji dosegli velikost cca. 150 mm3 so v tumor in na drugo kontrolno mesto z matrigelom v istem mišjem modelu injicirali NK92 celice transformirane z lentivirusnim vektorjem z zapisom za reporter RFP670 pod promotorjem G1K0.6H1. Po 48-urni inkubaciji so miši žrtvovali in izmerili izražanje fluorescentnega reporterja v pridobljenem matriksu s pretočno citometrijo. Zaznali so značilno povečanje ekspresije RFP670 v NK92 celicah iz tumorskega mikrookolja v primerjavi z celicami iz matrigela. Podoben eksperiment so ponovili z injiciranjem transformiranih celic NK92 v tumor in krvni obtok CDX modela ter dobili primerljive signifikantne rezultate z 1,57× povečanjem izražanja reporterja v tumorskem mikrookolju [1].

== Rezultati in načrti za prihodnost ==
Rezultat raziskave je torej funkcionalen promotor s tremi odzivnimi elementi G1K0.6H1, ki je značilno bolj induciran v tumorskem mikrookolju, kjer pride do hipoksije in izražanja IFNγ, mediatorja maligne transformacije in progresije, ter TNFα, ki je povezan z vnetno karcinogenezo. S tovrstnim pristopom lahko zmanjšamo ali preprečimo neželene učinke povezane z tarčno aktivacijo CAR-T celic v zdravih tkivih in le to omejimo na območje tumorja.
<p>
Raziskava kaže, da je razporeditev odzivnih elementov pri pripravi sintetičnih promotorjev pomembna, a je ne moremo vnaprej napovedati, zato moramo vse konstrukte eksperimentalno preveriti. Pri predvidevanju pa se lahko opremo na podatke o lokaciji odzivnih elementov v naravi. Predstavljena izvedba sintetičnih promotorjev s kombiniranimi odzivnimi elementi odpira priložnost za nadaljnje raziskave in pripravo promotorjev odzivnih na dodatne faktorje, optimizacijo kombinacije obstoječih odzivnih elementov in alternativnih lokacij le teh. Vse izboljšave se lahko uporabijo za dosego robustne aktivacije promotorja in ekspresije CAR receptorja, ki ga lahko uporabimo za klinične aplikacije. Mehanizem odpira terapevtsko okno za več tumorskih antigenov, ki so izraženi tudi na zdravih celicah, hkrati pa lahko ta pristop uporabimo tudi pri drugih adoptivnih imunskih celičnih terapijah. </p>

== Literatura ==
[1] Greenshpan, Y. ''idr.'' Synthetic promoters to induce immune-effectors into the tumor microenvironment. ''Commun. Biol.'' 4, 1–11 ('''2021''').
<br>[2] Stoiber, S. ''idr.'' Limitations in the Design of Chimeric Antigen Receptors for Cancer Therapy. ''Cells'' 8, 472 ('''2019''').
<br>[3] Gargett, T. & Brown, M. P. The inducible caspase-9 suicide gene system as a „safety switch“ to limit on-target, off-tumor toxicities of chimeric antigen receptor T-cells. ''Front. Pharmacol.'' 5 ('''2014''').
<br>[4] Arcot, S. S., Flemingtons, E. K. & Deiningerj, P. L. The Human Thymidine Kinase Gene Promoter. ''Journal of Biological Chemistry'' 264 ('''1989''').