View source for Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida

Primarni vir: Schwander, T., Borzyskowski, L. S. von, Burgener, S., Cortina, N. S. & Erb, T. J. A synthetic pathway for the fixation of carbon dioxide in vitro. Science, 2016, 354, 900–904.

==Fiksacija ogljikovega dioksida==
Fiksacija ogljikovega dioksida je proces pretvorbe atmosferskega CO<sub>2</sub> v organske spojine. Avtotrofni organizmi pretvorijo 350 gigaton ogljikovega dioksida na leto preko ene izmed šestih naravnih poti fiksacije. Prva odkrita pot fiksacije CO<sub>2</sub> je bil Clavin-Benson-Basshamov (CBB) cikel, ki mu je sledijo odkritje reduktivnega cikla trikarboksilne kisline, Woof-Ljundghalove poti fiksacije, 3-hidroksipropionatnega (3HP) cikla, dikarboksilatnega/4-hidroksibutiratnega (di-4HB) cikla in 3-hidroksipropionat-4-hidroksibutirtnega (3HP-4HB) cikla. 
Izmed šestih poznanih poti je CBB cikel najbolj raziskan in tudi najbolj zastopan v naravi, saj omogoča 90 % fiksacije vsega CO<sub>2</sub> v rastlinah, algah in mikroorganizmih [1].

==Omejitve  naravnih poti fiksacije ogljikovega dioksida== 
Kljub temu da poznamo več načinov fiksacije ogljikovega dioksida, ki jo opravljajo različni encimi, pa je uporaba le-teh v laboratoriju in industriji omejena. Prva omejitev je nizek izkoristek metabolnih poti zaradi nizke učinkovitosti encimov. Primer takega encima je ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaza/oksidaza (Rubisco), ki katalizira pretvorbo riboze-1,5-bisfosfata v 3-fosfoglicerat. Encim je del cikla CBB in hkrati najbolj zastopana karboksilaza v procesu fiksacije CO<sub>2</sub>. Reakcija, ki jo Rubisco katalizira, je počasna, poleg tega encim katalizira še stransko reakcijo pretvorbe ribuloze-1,5-bisfosfat, pri čemer sodeluje kisik, kar zmanjša učinkovitost fiksacije CO<sub>2</sub> [2]. 
Druga glavna omejitev poti fiksacije pa je pretvorba ogljikovega dioksida v biomaso in ne v industrijo pomembne produkte, kot so biogoriva, kemikalije ali drugi materiali. 
Zaradi zgornjih omejitev so že večkrat poskušali povečati izkoristek metabolnih poti in jih spremeniti tako, da bi dobili za industrijo uporaben produkt. Najpogosteje so se lotili modifikacije encimov z namenom povečanja njihove aktivnosti. Poskušali so tudi z uvedbo naravnih poti fiksacije CO<sub>2</sub> v ne-avtotrofne organizme, kor je ''Escherichia coli''. S temi pristopi so bili le delno uspešni. 
Večji napredek na tem področju nam omogoča sintezna biologija, saj lahko s kombinacijo različnih encimskih reakcij, iz različnih bioloških virov nastane pot fiksacije ogljikovega dioksida, ki je kinetično in termodinamsko bolj ugodna od naravnih poti fiksacije. 

==Cikel CETCH==
Primer sintezne poti fiksacije CO<sub>2</sub> je cikel CETCH (krotonil-CoA/etilmalonil-CoA/hidroksibutiril-CoA), ki so ga pripravili po pristopu od spodaj navzgor. To pomeni, da so na začetku s pomočjo primerjave kinetičnih in biokemijskih lastnosti identificirali najbolj učinkovito karboksilazo, saj ta predstavlja ozko grlo metabolnih poti fiksacije CO<sub>2</sub>. Gre za enoil-CoA karboksilazo/reduktaco (ERC), ki deluje v metabolizmu ogljika alfa-proteobakterij in Streptomices. Glavna prednost ERC je širok spekter substratov, med katerimi ni molekularni kisik, ki bi omogočal potek neželene stranske reakcije. Hkrati je encim 2 do 4x bolj učinkovit kot karboksilaza Rubisco. 
Nato so sestavili teoretični cikel, ki se začne z reakcijo encima ERC in konča z intermediatom, ki ga kot substrat lahko sprejme ERC, kar omogoča potek cikla. Po poteku enega teoretično pirapvljenega cikla pride do fiksacije dveh molekul CO<sub>2</sub> in nastanka ene molekule glioksilata. Celokupna reakcija cikla CETCH je: 

<div style="text-align: center;"> 2 CO<sub>2</sub> + 3 NAD(P)H + 2 ATP + FAD --> glioksilat + 3 NAD(P)<sup>+</sup> + 2 ADP + 2 Pi + FADH<sub>2</sub> </div>

V nadaljevanju so z izračunom proste Gibbsove energije v bioloških pogojih in izračunom potrebne energije v obliki ATP in NADPH za potek enega cikla, ugotovili, da je cikel termodinamsko bolj ugoden in energijsko manj potraten od naravnih ciklov CBB, 3HP in 3HP/4HB. 
Nato so se z uporabo bioinformatskih orodij lotili iskanja encimov, ki bi lahko katalizirali zamišljene reakcije. Pri tem se niso omejili na posamezni organizem, ampak so iskali možne encime znotraj vseh treh domen življenja. Identificirali so 12 encimov z optimalnimi lastnostmi, ki so prikazani v tabeli 1.


{| border=1 align="center"
|+'' Tabela 1: Seznam izbranih encimov, ki so katalizirali reakcije v teoretično zamišljenem ciklu CETCH. Pripisan je organizem iz katerega izvira encim in reakcija, ki jo katalizira v ciklu.'' 
|-
! scope="col" style="width: 150px;"|  ENCIM
! scope="col" style="width: 150px;"|  ORGANIZEM
! scope="col" style="width: 150px;"|  REKACIJA
|-
|Propionil-CoA karboksilaza (Pcc)
|''Methylobacterium extorquens 	''
|Pretvorba propionil-CoA v metilmalonil-CoA. V reakciji pride do fiksacije ene molekule CO<sub>2</sub> in hidrolize ene molekule ATP. 
|-
|emC/mmC epimeraza (Epi)	
|''Methylobacterium extorquens''	
|Skupaj z encimom Mcm sodeluje pri pretvorbi metilmalonil-CoA v sukcinil-CoA. 
|-
|Metilmalonil-CoA mutaza (Mcm)	
|''Rhodobacter sphaeroides''	
|Pretvorba metilmalonil-CoA v skukcinil-CoA.
|-
|Sukcinil-CoA reduktaza (Scr)
|''Clostridium kluyveri	''
|Prtevorba sukcinil-CoA v sukcin semialdehid. Kot donor elektronov v reakciji sodeluje NADPH. 
|-
|Sukcinska semialdehid reduktaza (Ssr)
|''Homo sapiens	''
|Pretvorba sukcin semialdehida v 4-hidroksibutirat. Kot donor elektronov v reakciji sodeluje NADPH.
|-
|4-hidroksibutiril-CoA sintetaza (Hbs)	
|''Nitrosopumilus maritimus''	
|Pretvorba 4-hidroksibutirata v 4-hidroksibutiril-CoA. Poteče hidroliza ene molekule ATP.  
|-
|4-hidroksibutiril-CoA dehidrogenaza (Hbd)
|''Nitrosopumilus maritimus''	
|Pretvroba 4-hidroksibutiril-CoA v krotonil-CoA. 
|-
|Krotonil-CoA karboksilaza/reduktaza (Ccr)
|''Methylobacterium extorquens''	
|Pretvroba krotonil-CoA v etilmalonil-CoA. V reakciji pride do fiksacije ene molekule CO<sub>2</sub>, kot donor elektronov sodeluje NADPH. 
|-
|Etilmalonil-CoA mutaza (Ecm)	
|''Rhodobacter sphaeroides''	
|Skupaj z encimom Epi katalizirata pretvorbo etilmalonil-CoA v metilsukcinil-CoA. 
|-
|Metilsukcinil-CoA dehidrogenaza (Mcd)
|''Rhodobacter sphaeroides''	
|Pretvorba metilsukcinil-CoA v mezakonil-CoA. Prejemnik elektronov v reakciji je ferocenij. 
|-
|Mezakonoil-CoA hidrataza (Mch)
|''Rhodobacter sphaeroides''	
|Pretvorba mezakonil-CoA v metilmalil-CoA. 
|-
|β-metilmalil-CoA liaza (Mcl)	
|''Rhodobacter sphaeroides''	
|Pretvorba metilmalil-CoA v propinol-CoA. Kot stranski produkt reakcije nastane glioksilat. 
|}


Da bi dokazali funkcionalnost cikla, so kemijsko sintetiziran intermediat propinol-CoA dodali v reakcijsko mešanico z vsemi encimi, kofaktorjem in akceptorjem elektronov ferocenijem. Za sledenje poteku cikla so v reakcijski mešanici kot vir CO<sub>2</sub> uporabili NaH<sup>13</sup>CO<sub>3</sub>. Zaradi konstantne vgradnje ogljika v ciklu, so z opazovanjem obogatitve intermediatov s <sup>13</sup>C sledili poteku reakcij. 
Po prvem eksperimentu so ugotovili, da se je v reakcijski mešanici kopičil intermediat metilsukcinil-CoA, kar je kazalo na neučinkovitost encima Mcd. Z nadaljnjimi analizami so ugotovili, da je omejujoč dejavnik regeneracija akceptorja elektronov ferocerija, ki ga Mcd potrebuje za delovanje. Encim so zato skušali modificirati tako, da bi kot končni prejemnik elektronov lahko sprejel molekularni kisik. Z uvedbo treh točkovnih mutacij so ga spremenili v metilsukcinil-CoA oksidazo (Mco), ki katalizira od kisika odvisno oksidacijo metilsukcinil-CoA. Ob uvedbi Mco v cikel, je ta kontinuirano potekal. 
Ker encimi v ciklu kot donor elektronov potrebujejo NADPH, so morali za njegovo regeneracijo dodati še encim format dehidrogenazo. Dodali so še encim pirofosfat kinazo za regeneracijo ATP in katalazo, za zaščito pred oksidativnim stresom, saj je stranski produkt nekaterih reakcij vodikov peroksid. 
V nadaljevanju so ugotovili, da se v reakcijski mešanici kopiči malonil-CoA. Ker ne gre za neposredni intermediat cikla, so sumili, da nastaja kot produkt stranske reakcije, ki jo katalizira encim Pcc. Zato so pripravili alternativno reakcijsko zaporedje, ki iz cikla izloči encim Pcc in omogoči nastanek metilmalonil-CoA iz propionil-CoA preko reduktivne karboksilacije akrilil-CoA. Za pretvorbo propinol-CoA v akrilil-CoA so izbrali acil-CoA oksidazo ACX4 iz Arabidopsis thaliana. Ker pa encim, kot substrat sprejme tudi 4-hidroksibutiril-CoA, ki je prav tako intermediat cikla, so ga morali modificirati. Z uvedbo ene točkovne mutacije so zmanjšali afiniteto encima do 4-hidroksibutiril-CoA in hkrati ne bistveno vplivali na vezavo glavnega substrata propionil-CoA. Mutirano obliko encima so poimenovali Pco. 
Ciklu so dodali še malat sintazo, β-metilmalil-CoA liazo in malil-CoA tioesterazo, ki so sodelovali pri pretvorbi glioksilata v malat, preko katerega so spremljali koncentracijo fiksiranega CO<sub>2</sub>. 
Po več stopnjah zgoraj opisane optimizacije je nastala verzija cikla CETCH 5.4. Cikel je sestavljen iz 17 encimov iz 9 različnih organizmov vseh treh domen življenja. Omogoča fiksacijo ogljikovega dioksida s hitrostjo 5 nmol/min na mg proteinov v ciklu, kar je več od naravnega cikla CBB, ki fiksira 1-3 nmol/min na mg proteinov v ciklu. Poleg tega, CETCH 5.4 za to potrebuje 20 % manj energije kot cikel CBBl [3].

==Zaključek==
Cikel CETCH predstavlja novo sintezno pot fiksacije ogljikovega dioksida, ki poteka v in-vitro pogojih in omogoča postopno pretovrbo atmosferskega CO<sub>2</sub> v glioksilat. S tem so dokazali, da je mogoče pripraviti sintezno pot, ki je termodinamsko in energijsko bolj ugodna od naravnih poti fiksacije CO<sub>2</sub> [3], hkrati pa vodi do sinteze industrijsko pomembnega produkta, saj lahko glioksilat z eno encimsko reakcijo pretvorimo v glikolno kislino, ki jo uporabljamo v farmacevtski, tekstilni in prehrambni industriji ter za pripravo biorazgradljivega polimera PGA [4]. 
Končni cilj raziskovanja sinteznih poti fiksacije CO<sub>2</sub> je vključitev cikla v celice in združitev s procesom fotosinteze. Na tak način bi lahko pripravili rastline, ki bi zaradi večje učinkovitosti fiksacije ogljikovega dioksida hitreje sintetizirale biomaso in rasle [5]. Podobno bi lahko pripravili gensko spremenjene organizme, ki bi iz CO<sub>2</sub>, katerega koncentracija se zaradi uporabe fosilnih goriv povečuje, sintetizirali biogoriva [6].

==Viri==
[1] Gong, F., Zhu, H., Zhang, Y. & Li, Y. Biological carbon fixation: From natural to synthetic. Journal of CO<sub>2</sub> Utilization, 2018, 28, 221–227.<br />
[2] Pottier, M., Gilis, D., Boutry, M. The Hidden Face of Rubisco. Trends Plant Sci., 2018 23, 382-392.<br />
[3] Schwander, T., Borzyskowski, L. S. von, Burgener, S., Cortina, N. S. & Erb, T. J. A synthetic pathway for the fixation of carbon dioxide in vitro. Science, 2016,  354, 900–904.<br />
[4] Salusjärvi, L., Havukainen, S., Koivistoinen, O. & Toivari, M. Biotechnological production of glycolic acid and ethylene glycol: current state and perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol, 2019, 103, 2525.<br />
[5] Naseem, M., Osmanoglu, Ö. & Dandekar, T. Synthetic Rewiring of Plant CO2 Sequestration Galvanizes Plant Biomass Production. Trends Biotechnol, 2020, 38, 354–359.<br />
[6] Liu, Z., Wang, K., Chen, Y., Tan, T. & Nielsen, J. Third-generation biorefineries as the means to produce fuels and chemicals from CO<sub>2</sub>. Nat. Catal., 2020, 3, 274–288.<br />