View source for Tarakate

=='''Uvod in teoretično ozadje'''==

Kavčuk je elastičen naravni polimer, ki se pridobiva iz lateksa drevesa kavčukovca (''Hevea brasiliensis''). Njegova glavna komponenta je poli(cis-1,4-izopren), ki kavčuku daje značilne lastnosti, kot so elastičnost, odpornost na vodo in razteznost. Zaradi teh lastnosti je kavčuk široko uporabljen v industriji, na primer za izdelavo avtomobilskih gum, zaščitnih rokavic, medicinske opreme in številnih drugih izdelkov.

Svetovna letna poraba kavčuka znaša približno 30 milijonov ton. Vendar pa obsežna pridelava kavčuka povzroča velike okoljske težave – zlasti zaradi krčenja tropskih gozdov, saj plantaže kavčukovca izpodrivajo naravne ekosisteme. To ustvarja potrebo po iskanju trajnostnih alternativnih virov naravnega kavčuka.

Čeprav več kot 2500 rastlinskih vrst proizvaja naravni kavčuk, jih le malo omogoča komercialno proizvodnjo v zadostnih količinah. Ena najbolj obetavnih je posebna vrsta regrata – ''Taraxacum kok-saghyz'' (TKS), znana kot ruski regrat.

Za razliko od kavčukovca, ki potrebuje več let do prvega pridelka, regrat raste hitro, omogoča večkratno letno žetev, uspeva v zmernem podnebju in tolerira neugodne rastne razmere, kot so sušna ali zbita tla. Čeprav regratov kavčuk verjetno ne bo popolnoma nadomestil tradicionalnega vira, vseeno predstavlja obetavno, trajnostno dopolnilo k svetovni oskrbi s kavčukom.

=='''Cilji projekta Tarakate'''==
Glavni cilj projekta iGEM ekipe iz Marburga je bil razvoj sintezno-bioloških orodij oziroma delov, ki bi omogočali natančen nadzor izražanja genov v regratu TKS. Ker takšnih orodij doslej skorajda ni bilo, so se odločili razviti lastno zbirko, ki vključuje endogene regulatorne elemente. Svoj projekt so okrepili še z oblikovanjem priročnika - '''"Dandelion Handbook"''', ki vključuje vse protokole, metode in znanje o biologiji regrata in genskem inženiringu. Njihov cilj je bil omogočiti drugim iGEM ekipam enostavno delo z regratom kot novim rastlinskim modelom (šasijo).

=='''Identifikacija in izbor regulatornih regij'''==
Delo so začeli z bioinformatsko analizo genoma regrata. Kot referenčni genom so uporabili javno dostopen genom regrata TKS, in sicer so analizirali transkriptom in za vsak gen določili povprečno raven izražanja in varianco izražanja med tkivi. Hoteli so namreč le tiste gene, za katere je povprečna raven izražanja v zgornjem 95.percentilu in katerih varianca je bila nižja od 30%. Tako so dobili več kot 750 genov, ki so jih analizirali naprej.

S pomočjo funkcijske genomike in analize izražanja genov so na koncu izbrali 20 takšnih, ki se konstitutivno izražajo in so povezani z osnovnimi funkcijami celice.

V naslednjem koraku so za vsak gen so sintetizirali ali pomnožili izbrane regulatorne regije. Uporabili so pomnoževanje z reakcijo PCR, s katero so pomnožili približno 2 kb dolg fragment, ki je vseboval zgornjo (''angl.'' upstream) regulatorno regijo. Ta je vsebovala ključne promotorje, 5‘UTR regije in cis-regulatorne elemente. 

Za 3'UTR regije in terminatorje pa so uporabili zaporedja iz referenčnega genoma in jih podaljšali za 150 bp, da so zajeli vse pomembne regulatorne regije.

Vse produkte PCR in sintetizirane fragmente so nato sestavili z uporabo modularnega kloniranja (''angl.'' Modular Cloning - MoClo), pri čemer so upoštevali Phytobrick standard. Kot rezultat so dobili knjižnico 37 endogenih regulatornih delov specifičnih za regrat TKS. 
 
=='''Metode transformacije regrata'''==
Karakterizacija sintezno-bioloških delov je ključen korak v sintezni biologiji, saj določa, kako se deli obnašajo znotraj organizma. Da bi lahko (na hitro) okarakterizirali novo-ustvarjene dele, so morali razviti sistem, ki bi jim to omogočal. Za ne-modelne rastline, kot je regrat, protokoli za prehodno izražanje niso precej optimizirani. Glavni poudarek ekipe je bil zato na razvoju hitrih, prehodnih metod, s katerimi bi lahko okarakterizirali ustvarjene dele. Za namene transformacije regrata so optimizirali so dve prehodni metodi, in sicer infiltracijo listov in transformacijo protoplastov.

Poleg dveh prehodnih metod so optimizirali še protokole dveh stabilnih metod transformacije, in sicer protokol sterilne transformacije in metode CDB (''angl.'' Cut-Dip-Budding). Gre za enostavno metodo za transformacijo rastlinskih celic, kjer odrezane dele rastline potopijo v raztopino z ''A. tumefaciens''. Za regrat so razvili "izjemno poenostavljeno metodo CDB", ki omogoča regeneracijo stabilno transformiranih poganjkov že v 14 dneh, brez sterilnih pogojev ali tkivne kulture.



=='''Testni sistemi'''==
===Testni sistem RUBY===
Da bi preverili učinkovitost transformacije rastlin so zasnovali testni konstrukt RUBY (''angl.'' Tarakate test construct RUBY). Ta vsebuje reporterski sistem RUBY, ki omogoča enostavno vizualizacijo izražanja genov preko sinteze rdečega pigmenta betalaina. Sistem namreč zapisuje za tri encime, ki pretvarjajo aminokislino tirozin v betalain – rdeč pigment. Ker pa regrat naravno proizvaja tudi druge rdeče pigmente, so za natančno potrditev izražanja betalain ekstrahirali in izmerili njegovo absorpcijo pri 535 nm. 

Konstrukt so najprej testirali v modelni rastlini, in sicer tobaku (''N. benthamiana'') z metodo infiltracije spodnje strani listov z ''A. rhizogenes''. Po inkubaciji so iz listov ekstrahirali betalaine in posneli absorpcijski spekter, na katerem so opazili značilne absorpcijske vrhove za betalain, kar je potrdilo uspešno izražanje. Ker so dobili pričakovane rezultate – to je rdečo obarvanje listov, so sistem preizkusili še v regratu, tako da so uporabili prej omenjen prilagojen protokol infiltracije listov.

===Testni sistem GFP===
Da bi preverili učinkovitost transformacije protoplastov so razvili nov testni sistem, saj testni sistem RUBY za to metodo transformacije ni bil primeren. Pripravili so nov testni konstrukt z avGFP reporterjem (BBa_K5088675), ki je omogočil zaznavo izražanja preko merjenja intenzitete fluorescence. 

Delovanje konstrukta so preizkusili s transformacijo protoplastov tobaka in regrata. Intenziteta fluorescence je bila kljub optimizaciji protokola nizka, zato so avGFP zamenjali z močnejšim eGFP (''angl.'' enhanced GFP).
  
===Ratiometrični pristop===
Pri uporabi metod, kot sta infiltracija listov in transformacija protoplastov, je učinkovitost transformacije precej variabilna. To je predstavljalo problem, ko so hoteli izvesti kvantitativne meritve za posamezen regulatorni element oziroma primerjati elemente med sabo. Da bi rešili to težavo, so razvili ratiometrični konstrukt (BBa_K5088677), ki omogoča sočasno merjenje aktivnosti dveh reporterskih genov. 

Konstrukt je izgledal tako, da so v testni konstrukt z eGFP dodali še zapis za reporter mCherry pod nadzorom ubikvitinskega promotorja iz ''A. thaliane'', ki omogoča konstitutivno izražanje reporterja. Signal mCherry v tem sistemu predstavlja referenco za normalizacijo. Razmerje fluorescence eGFP in mCherry je dalo informacijo o relativni aktivnosti testiranega elementa in jim omogočilo zanesljivo primerjavo aktivnosti različnih promotorjev in UTR regij. 

Ratiometrični konstrukt so najprej testirali s prehodno transformacijo tobaka. Ko so delovanje sistema uspešno potrdili v tobaku, so nadaljevali z delom v regratu (TKS). Nadaljevali so s testiranjem 35 različnih regulatornih elementov. Pri večini delih z 3‘UTR zaporedji so zaznali signal obeh reporterskih proteinov, pri delih, ki so vsebovali promotor in 5‘UTR pa so signal za GFP zaznali samo v enem primeru. Da bi odkrili, ali je problem v testnem sistemu ali samih regulatornih regijah, so iste regulatorne elemente testirali še z infiltracijo tobačnih listov. Dobili so pozitivne rezultate (rdeča in zelena fluorescenca) in s tem dokazali, da je potrebna nadaljnja optimizacija testnega sistema za regrat.

=='''Plazmid pViRi'''==
Eden izmed ciljev ekipe je bil razviti sistem za transformacijo regrata brez uporabe ''A. rhizogenes/tumefaciens''. Zamislili so si virulenčni plazmid, ki bi bil neodvisen od bakterijskega gostitelja in bi vseboval le bistvene gene, ki so potrebni za transformacijo. Vseboval bi še regijo T-DNA z geni, ki so potrebni za nastanek t.i. 'hairy root' pojava, ki je značilen za okužbo z ''A. rhizogenes''. 

Ekipa se je lotila zasnove plazmida, ki so ga poimenovali pViRi. Ključni poudarki pri zasnovi pViRi so bili:
*visoka učinkovitost transformacije,
*enostavna indukcija vir genov,
*neodvisnost od bakterijskega kromosoma in
*vsebnost genov, ki so potrebni za pojav hairy root fenotipa

V sklopu projekta so uspešno sklonirali vse potrebne dele za sestavo plazmida, vendar jim zaradi časovne omejitve ni uspelo sestaviti končnega plazmida.

=='''Zaključek'''==
Projekt iGEM Marburg 2024 je pomembno prispeval k razvoju orodij za sintezno biologijo rastlin, zlasti regrata kot alternativnega vira naravnega kavčuka. Razvili so zbirko endogenih regulatornih elementov za regrat, optimizirali prehodne in stabilne metode transformacije, razvili vizualne in kvantitativne reporterske sisteme za izražanje genov v regratu in postavili osnovo za bakterijsko neodvisen transformacijski sistem. Čeprav niso uspeli dokončati vseh ciljev, so postavili pomembne temelje za prihodnje raziskave in omogočili drugim skupinam nadaljnje delo s TKS kot rastlinskim modelom v sintezni biologiji.

=='''Viri in literatura'''==
[1] Tarakate - From Rainforest Deforestation to Sustainable Rubber: Using Plant SynBio to Facilitate Dandelion Engineering https://2024.igem.wiki/marburg/#