View source for Uporaba sintezne virologije za hitro inženirstvo virusa vezikularnega stomatitisa VSV

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39459973/Leveraging Synthetic Virology for the Rapid Engineering of Vesicular Stomatitis Virus (VSV)] 

== Uvod == 
Virus vezikularnega stomatitisa (VSV) je negativno orientiran RNA virus iz družine Rhabdoviridae. Njegov genom je dolg približno 11,1 kb in vsebuje pet genov: N (nukleoprotein), P (fosfoprotein), M (matriks protein), G (glikoprotein) in L (RNA-odvisna RNA polimeraza), znan pa je kot živalski patogen in po svoji visoki infektivnosti ter hitri replikaciji. Zaradi teh lastnosti je postal pomemben modelni sistem za raziskave virusne biologije in razvoj cepiv, terapij proti raku ter protivirusnih sredstev. VSV je bil uspešno uporabljen pri razvoju cepiv proti eboli, HIV-u, SARS-CoV-2 in drugim boleznim, pogosto tudi v obliki t.i. psevdotipiziranih virusov, kjer se naravni glikoprotein nadomesti s tujim [1,2].
Kljub temu je klasično gensko inženirstvo VSV še vedno zamudno in kompleksno, saj temelji na restrikcijskih encimih, rekombinaciji in počasnem testiranju. Tudi naprednejše metode, kot je CRISPR, imajo svoje pomanjkljivosti, kot so nespecifični učinki in nizka učinkovitost pri večkratnih spremembah. Sintezna virologija predstavlja rešitev teh izzivov, saj omogoča načrtovanje in sintezo celotnih virusnih genomov de novo. Ta pristop, ki se je začel z umetno sintezo poliovirusa leta 2002, omogoča izdelavo novih ali prilagojenih virusov za raziskave, terapije in cepiva. V tej raziskavi avtorji predstavijo tehnični preboj – metodološki okvir, ki združuje računalniško podprto načrtovanje z učinkovito sintezo in sestavo genoma VSV. Rezultat je hitra, prilagodljiva in stroškovno učinkovita platforma za ustvarjanje funkcionalnih, replikacijsko sposobnih virusov, ki omogoča nove možnosti v biomedicinskih aplikacijah [1]. 
Inženirska platforma pa deluje tako, da se najprej sintetizirajo fragmenti, nato pa se DNA sestavi v celoten plazmid. Ta se transformira v bakterije, pomnoži in prečisti. Plazmidi z virusnim genomom se potrdijo s kolonijsko PCR in sekvenciranjem celotnega plazmida. Ti genomski plazmidi VSV se transficirajo v celice 293T, okužene s cepitvenim virusom T7, skupaj s podpornimi plazmidi, ki izražajo beljakovine VSV N, P in L. Virus se obnovi, validira in po potrebi razširi za povečanje titra [1].


== Sestava in validacija sintetičnega genoma VSV (synVSV)  ==
V raziskavi no najprej pridobili plazmide VSV (Indiana sev) in pomožne plazmide (pBS-N, -P, -G in -L), potrebne za virusno reševanje. Za proizvodnjo T7 polimeraze so uporabili vakcinijski virus. Sekvenco genoma VSV so potrdili s sekvenciranjem, nato pa z uporabo programske opreme BioCAD digitalno razdelili genom na štiri sintezne fragmente F1-F4, z vključenimi 30-baznimi prekritji za natančno sestavljanje brez stranskih produktov [1].
Ta modularni pristop omogoča tudi kasnejšo zamenjavo posameznih segmentov brez potrebe po celotni rekonstrukciji. Zasnovali so tudi različici virusa z vstavljenim glikoproteinom virusa Sindbis (VSV-SIN) in s preurejenim zaporedjem genov (VSV-M2P3) [1].
Sintezo DNA so izvedli preko podjetja Twist Bioscience. Fragmenti (dolžine 0,3–7 kb) so bili kvantificirani z Nanodropom in preverjeni z gelsko elektroforezo. Nato so jih sestavili z uporabo metode HiFi DNA Assembly. Po sestavi so transformirali E. coli bakterije, izbrali kolonije in izvedli colony PCR za preverjanje prisotnosti gena VSV-G (~1,5 kb). Vse kolonije so bile pozitivne, katere so nato uporabili za pripravo plazmidne DNA (miniprep), ki je bila ponovno sekvencirana za potrditev celovitosti. Rezultati sekvenciranja pa so pokazali 100% ujemanje z referenčnim genom, kar je potrdilo uspešno sintezo celotnega VSV genoma de novo [1].


== Reševanje in karakterizacija sintetične VSV ==
Za testiranje funkcionalnosti so uporabili celične linije 293T, BHK-21, Vero, HepG2 in HepaRG. Po transfekciji 293T celic z genomom VSV in podporno ekspresijo potrebnih proteinov, je sledilo reševanje virusa, to je proces, s katerim iz umetno vnesenega virusnega genoma v celici nastane funkcionalen  in infektiven virus. Po pojavu citopatskih efektov (CPE) so virusni supernatant filtrirali, shranili in uporabili za nadaljnje teste. Citopatske učinke in popolno lizo celic so po 48 urah opazili le pri 75 % primerov [1]. 
Za potrditev prisotnosti in kvantifikacijo virusa so izvedli kvantitativni real-time reverzno transkripcijski PCR (RT-qPCR) z uporabo specifičnih primerjev za gen VSV-M. Ekstrahirano RNA iz supernatanta so reverzno transkribirali in analizirali z metodo SYBR Green qPCR [1].
Za določitev infektivnosti virusa so izvedli Tissue culture infectious does 50 (TCID₅₀) test na 293T celicah. Titri virusa so bili visoki tako v 293T kot tudi v HepG2 celičnih linijah, kar kaže na visoko učinkovitost replikacije. Serijske razredčitve virusa so inkubirali 72 ur, opazovali pojav CPE in jih dodatno potrdili z imunocitokemijo (ICC) z uporabo protiteles proti VSV in fluorescenčno označenega sekundarnega protitelesa. Za spremljanje kinetike infekcije in celične konfluence v realnem času so uporabili Incucyte sistem za živo-celično slikanje. Merili so delež pokritosti površine z živimi celicami in analizirali spremembe skozi čas [1].
Primerjava z naravnim VSV (wildtype) na Hep3B celicah z uporabo sistema IncuCyte je pokazala, da ima synVSV hitrejši pojav citopatskih učinkov in upad konfluence celic. Možni vzroki vključujejo višjo homogenost začetne virusne populacije in večjo genomsko stabilnost sintetičnega virusa. To kaže, da sintezni pristopi lahko vodijo do virusov z izboljšanimi kinetičnimi lastnostmi [1].

== Inženirstvo tujih glikoproteinov: VSV-Sindbis (VSV-ΔG SIN-E3/E2/6K/E1)  ==
Ko so dokazali koncept s synVSV, so želeli platformo dodatno potrditi in ugotoviti kako jo je mogoče uporabiti za hitro konstrukcijo novih VSV. Zato so razvili rekombinantni VSV z glikoproteinom virusa Sindbis. Virus je bil uspešno sestavljen, potrjen in rešen [1].
Infektivnost so testirali na HepaRG (zdrave) in HepG2 (rakave) jetrne celice. Rezultati so pokazali zelo nizko infekcijo v HepRG tudi pri visokem razmerju med številom virusnih delcev in številom tarčnih celic (angl. multiplicity of infection - MOI), ter zelo visoko infekcijo v HepG2 in sicer kar 80 % celic je bilo inficiranih že pri MOI 0,1 [1].
To potrjuje specifično afiniteto virusa za rakave celice (zaradi izražanja lamininskega receptorja – LAMR), kar nakazuje potencial za onkolitično terapijo jeter. Uspešna konstrukcija potrjuje fleksibilnost platforme za raziskovanje tujih glikoproteinov [1].

== Ocena virusa VSV s spremembo genov z uporabo platforme za sintetično virologijo  ==
Raziskali so tudi vpliv spremembe vrstnega reda genov na virusno učinkovitost. Tipičen vrstni red genov pri VSV je 3′-N-P-M-G-L-5′. V tej študiji pa so zamenjali gena M in P [1]. 
Po zasnovi in sintezi zamenjanega fragmenta je bil virus uspešno rešen. Testi na celicah 293T (produkcijske celice) in Hep3B (rakave jetrne celice) so pokazali Primerljivo delovanje pri visokih MOI ter zmanjšano učinkovitost pri nizkih MOI, kar kaže na upočasnjeno replikacijo preurejenega virusa. S tem so dokazali, da spremembe v zaporedju genov lahko oslabijo virus [1].

==  Zaključek  ==
V tej študiji so avtorji predstavili de novo pristop za sestavo virusa VSV, ki pomeni pomemben tehnični napredek glede hitrosti, prilagodljivosti in učinkovitosti pri ustvarjanju VSV-vektorjev. Medtem ko so modularna sestava DNA in reverzna genetika dobro uveljavljene pri pozitivno orientiranih RNA virusih (npr. SARS-CoV-2), so tovrstne metode redko uporabljene pri negativno orientiranih virusih, kot je VSV. V raziskavi so izpostavili tudi ključne prednosti sintezne virologije in sicer, da ni potrebe po obstoječem plazmidu, saj se virusi lahko načrtujejo in sestavijo zgolj na podlagi digitalne sekvence. Pri sintezni virologiji imamo tudi popoln nadzor nad genetsko zasnovo, ki omogoča natančne mutacije, bolj čisto sestavo in daljše sekvence brez PCR napak, ter manj napak v splošnem kontekstu v primerjavi s tradicionalnimi metodami, saj je manj možnosti za kontaminacijo ali delne produkte. Kljub vsem prednostim pa ima ta sintezni pristop tudi razne omejitve kot je predvsem odvisnost od točne referenčne sekvence, saj se tudi v javnih bazah podatkov lahko pojavijo določene napake, enako kot se jim je v tem poskusu, saj so ugotovili 14 nukleotidnih razlik, ki so vplivale na več virusnih genov. Vendar kljub tem izzivom pa ta platforma omogoča hitro spreminjanje genomov in tako imajo raziskovalci orodje za razvoj novih cepiv, terapevtskih vektorjev ter onkolitičnih virusov in tako predstavlja sintezna virologija izjemen potencial za pospešitev razvoja novih biomedicinskih rešitev. 

== Literatura ==
[1] Moles CM, Basu R, Weijmarshausen P, Ho B, Farhat M, Flaat T, Smith BF. Leveraging Synthetic Virology for the Rapid Engineering of Vesicular Stomatitis Virus (VSV). Viruses 2024;16(10):1641. https://doi.org/10.3390/v16101641
 
[2] Liu G, Cao W, Salawudeen A, Zhu W, Emeterio K, Safronetz D, Banadyga L. Vesicular Stomatitis Virus: From Agricultural Pathogen to Vaccine Vector. Pathogens. 2021;10(9):1092. https://doi.org/10.3390/pathogens10091092