!MPACT - Revision history

Jure Povšin: /* Aktivacija receptorja preko protiteles */

2023-05-22T17:09:02Z

Aktivacija receptorja preko protiteles

← Older revision		Revision as of 17:09, 22 May 2023
Line 50:		Line 50:
	Nato je bilo treba afinitetno domeno PR3 oblikovati tako, da bi lahko vezala ANCA. Nukleotidno zaporedje za oblikovanje te domene je bilo pridobljeno na UniProtu (ID: P24158). Želeli so tudi odpraviti prvotno biološko funkcijo proteina PR3 (hidroliza proteinov), zato so odstranili peptidno zaporedje pred zapisom za sam protein, saj naj bi bilo to zaporedje odgovorno za aktivacijo encima. Nizka afiniteta ANCA do PR3 bi lahko ovirala korak dimerizacije obeh afinitetnih domen ter željenega prenosa signala. Zato so naredili tudi dva spremenjena receptorja, pri katerih so uvedli HA oznako zraven PR3 domene. HA je zelo pogosto uporabljena oznaka za detekcijo proteinov, zato so na voljo tudi znana protitelesa, ki bi zaradi znane visoke afinitete do HA lahko aktivirala GEMS receptor. Da bi ugotovili, če ANCA protitelesa lahko aktivirajo GEMS receptor so transfecirali HEK293T celice s sledečimi vektorji: 0_PR3 in 8_PR3 (vključujeta zapis za GEMS receptor, ki vsebuje afinitetno domeno PR3 poleg bodisi 0 ali 8 aminokislin dolgih povezovalcev), pLS13 (vključuje del, ki omogoča izražanje SEAP) in pLS15 (vključuje del za izražanje STAT3). Uspešnost aktivacije receptorjev so merili z aktivnostjo SEAP. V nobenem primeru niso zaznali povišanega SEAP signala, zato so sklepali, da aktivacija receptorja ni potekla [1].		Nato je bilo treba afinitetno domeno PR3 oblikovati tako, da bi lahko vezala ANCA. Nukleotidno zaporedje za oblikovanje te domene je bilo pridobljeno na UniProtu (ID: P24158). Želeli so tudi odpraviti prvotno biološko funkcijo proteina PR3 (hidroliza proteinov), zato so odstranili peptidno zaporedje pred zapisom za sam protein, saj naj bi bilo to zaporedje odgovorno za aktivacijo encima. Nizka afiniteta ANCA do PR3 bi lahko ovirala korak dimerizacije obeh afinitetnih domen ter željenega prenosa signala. Zato so naredili tudi dva spremenjena receptorja, pri katerih so uvedli HA oznako zraven PR3 domene. HA je zelo pogosto uporabljena oznaka za detekcijo proteinov, zato so na voljo tudi znana protitelesa, ki bi zaradi znane visoke afinitete do HA lahko aktivirala GEMS receptor. Da bi ugotovili, če ANCA protitelesa lahko aktivirajo GEMS receptor so transfecirali HEK293T celice s sledečimi vektorji: 0_PR3 in 8_PR3 (vključujeta zapis za GEMS receptor, ki vsebuje afinitetno domeno PR3 poleg bodisi 0 ali 8 aminokislin dolgih povezovalcev), pLS13 (vključuje del, ki omogoča izražanje SEAP) in pLS15 (vključuje del za izražanje STAT3). Uspešnost aktivacije receptorjev so merili z aktivnostjo SEAP. V nobenem primeru niso zaznali povišanega SEAP signala, zato so sklepali, da aktivacija receptorja ni potekla [1].

	Zaradi neuspešnega eksperimenta, so uporabili prej omenjene receptorje, ki so vsebovali še HA oznako. Izvedba eksperimenta je bila enaka kot že prej opisano, le da so uporabili druge vektorje, ki so vsebovali zapis za HA oznako zraven PR3 domene pri receptorju. Za aktivacijo receptorja so tokrat uporabili protitelesa proti HA oznaki. Po merjenju aktivnosti SEAP ni prišlo do povišanega signala po dodatku protiteles, kar pomeni, da do aktivacije receptorja tudi v tem primeru ni prišlo. Ker jim ni uspelo aktivirati receptorja, so s pretočno citometrijo hoteli analizirati vezavo protiteles na GEMS receptor. Uporabili so receptorske vektorje s HA oznako ter z njimi transifecirali HEK293T celice ter jih ustrezno obarvali z označenimi protitelesi za FACS analizo. Iz rezultatov so ugotovili, da se je samo okoli 10 % ~~vseh protiteles vezalo~~ na ~~prej omenjene~~ receptorje [1].		Zaradi neuspešnega eksperimenta, so uporabili prej omenjene receptorje, ki so vsebovali še HA oznako. Izvedba eksperimenta je bila enaka kot že prej opisano, le da so uporabili druge vektorje, ki so vsebovali zapis za HA oznako zraven PR3 domene pri receptorju. Za aktivacijo receptorja so tokrat uporabili protitelesa proti HA oznaki. Po merjenju aktivnosti SEAP ni prišlo do povišanega signala po dodatku protiteles, kar pomeni, da do aktivacije receptorja tudi v tem primeru ni prišlo. Ker jim ni uspelo aktivirati receptorja, so s pretočno citometrijo hoteli analizirati vezavo protiteles na GEMS receptor. Uporabili so receptorske vektorje s HA oznako ter z njimi transifecirali HEK293T celice ter jih ustrezno obarvali z označenimi protitelesi za FACS analizo. Iz rezultatov so ugotovili, da je bilo samo okoli 10% celic, ki so imela vezana protitelesa na svoje receptorje [1].

	== Zaključek ==		== Zaključek ==

Jure Povšin at 14:21, 22 May 2023

2023-05-22T14:21:45Z

← Older revision		Revision as of 14:21, 22 May 2023
Line 6:		Line 6:
	== Problem ==		== Problem ==

	Trenutno trpi 3-5 % svetovnega prebivalstva za avtoimunskimi boleznimi in to število iz leta v leto narašča. Avtoimunske bolezni so posledica napak v delovanju imunskega sistema, ki povzroči imunski odziv proti molekulam lastnega telesa. Ekipa iGEM TU Eindhoven 2022 se je osredotočila na skupino redkih, a življenjsko nevarnih avtoimunskih bolezni, s skupnim imenom ~~z antinevtrofilnimi~~ citoplazemskimi protitelesi (ang. ANCA) povezan vaskulitis (ang. AAV). Gre za skupino hudih kroničnih motenj, za katere je značilno granulomatozno in nevtrofilno vnetje tkiva, ki povzroči nekrozo krvnih žil. To vodi do nezadostne oskrbe organov s kisikom, kar posledično privede do zmanjšanja delovanja tkiva ali njegovega odmiranja. Najbolj pogosta oblika AAV je granulomatoza s poliangiitisom (ang. GPA), zato je bila ta oblika tudi osrednja točka raziskovanja [1].		Trenutno trpi 3-5 % svetovnega prebivalstva za avtoimunskimi boleznimi in to število iz leta v leto narašča. Avtoimunske bolezni so posledica napak v delovanju imunskega sistema, ki povzroči imunski odziv proti molekulam lastnega telesa. Ekipa iGEM TU Eindhoven 2022 se je osredotočila na skupino redkih, a življenjsko nevarnih avtoimunskih bolezni, s skupnim imenom s citoplazemskimi protitelesi proti nevtrofilcem (ang. ANCA) povezan vaskulitis (ang. AAV). Gre za skupino hudih kroničnih motenj, za katere je značilno granulomatozno in nevtrofilno vnetje tkiva, ki povzroči nekrozo krvnih žil. To vodi do nezadostne oskrbe organov s kisikom, kar posledično privede do zmanjšanja delovanja tkiva ali njegovega odmiranja. Najbolj pogosta oblika AAV je granulomatoza s poliangiitisom (ang. GPA), zato je bila ta oblika tudi osrednja točka raziskovanja [1].

	AAV je povezan s proizvodnjo patogenih ~~antinevtrofilnih citoplazemskih~~ protiteles ~~(ANCA)~~. Večja koncentracija ANCA v telesu je povezana z večjo aktivnostjo bolezni. Ta protitelesa se vežejo na dva glavna antigena: levkocitno proteinazo 3 (PR3) in mieloperoksidazo (MPO). Večina primerov GPA ima avtoprotitelesa, ki se vežejo na PR3. Ti bolniki, pozitivni na PR3-ANCA, so izpostavljeni velikemu tveganju za ponovitev bolezni. Zato se celoten projekt posebej osredotoča na primere GPA, ki so pozitivni na PR3-ANCA [1].		AAV je povezan s proizvodnjo patogenih ANCA protiteles. Večja koncentracija ANCA v telesu je povezana z večjo aktivnostjo bolezni. Ta protitelesa se vežejo na dva glavna antigena: levkocitno proteinazo 3 (PR3) in mieloperoksidazo (MPO). Večina primerov GPA ima avtoprotitelesa, ki se vežejo na PR3. Ti bolniki, pozitivni na PR3-ANCA, so izpostavljeni velikemu tveganju za ponovitev bolezni. Zato se celoten projekt posebej osredotoča na primere GPA, ki so pozitivni na PR3-ANCA [1].

	Trenutno zdravljenje AAV in avtoimunskih bolezni na splošno so pogosto imunosupresivna zdravila, na primer rituksimab, ciklofosfamid ali prednizon, ki zavirajo imunski sistem. Ta trenutna zdravljenja so na splošno učinkovita, vendar so zaradi nespecifičnega zaviranja imunskega sistema povezana z obremenjujočimi stranskimi učinki in bolniki postanejo bolj nagnjeni k nalezljivim boleznim [1].		Trenutno zdravljenje AAV in avtoimunskih bolezni na splošno so pogosto imunosupresivna zdravila, na primer rituksimab, ciklofosfamid ali prednizon, ki zavirajo imunski sistem. Ta trenutna zdravljenja so na splošno učinkovita, vendar so zaradi nespecifičnega zaviranja imunskega sistema povezana z obremenjujočimi stranskimi učinki in bolniki postanejo bolj nagnjeni k nalezljivim boleznim [1].

Jure Povšin: /* Zaključek */

2023-05-22T06:51:50Z

Zaključek

← Older revision		Revision as of 06:51, 22 May 2023
Line 54:		Line 54:
	== Zaključek ==		== Zaključek ==

	Z eksperimenti so potrdili, da se GEMS receptorji lahko uporabijo za izražanje terapevtskih proteinov (na primer IL-10). Poleg tega so tudi dokazali, da se lahko ~~protitelesa~~ vežejo na take receptorje, kar daje optimističen pogled za uporabo GEMS receptorjev pri zdravljenju raznih avtoimunskih bolezni v prihodnosti [1].		Z eksperimenti so potrdili, da se GEMS receptorji lahko uporabijo za izražanje terapevtskih proteinov (na primer IL-10). Poleg tega so tudi dokazali, da se protitelesa lahko vežejo na take receptorje, kar daje optimističen pogled za uporabo GEMS receptorjev pri zdravljenju raznih avtoimunskih bolezni v prihodnosti [1].

	== Viri ==		== Viri ==

Jure Povšin: /* Cilj */

2023-05-22T06:45:53Z

Cilj

← Older revision		Revision as of 06:45, 22 May 2023
Line 28:		Line 28:
	== Cilj ==		== Cilj ==

	Njihov cilj je bil pokazati, da se lahko sintezni receptor aktivira z vezavo protiteles in da lahko nato ~~proizvede~~ IL-10.		Njihov cilj je bil pokazati, da se lahko sintezni receptor aktivira z vezavo protiteles in da lahko nato celice proizvedejo IL-10.

	== Načrt in izvedba ==		== Načrt in izvedba ==

Jure Povšin: /* Rešitev */

2023-05-22T06:44:08Z

Rešitev

← Older revision		Revision as of 06:44, 22 May 2023
Line 16:		Line 16:
	Da bi odpravili pomanjkljivosti trenutnih terapij proti AAV, je nizozemska iGEM ekipa oblikovala !MPACT: modularno in prilagojeno avtoimunsko celično terapijo. Ta celična terapija zazna ANCA avtoprotitelesa, ki so povezana z vaskulitisom. V prisotnosti ANCA nastane interlevkin-10 (IL-10), naravni protivnetni citokin, kar povzroči specifično utišanje avtoimunskega odziva. Terapija bi potekala tako, da se bolniku najprej odvzamejo imunske celice, nato se te celice gensko spremeni in pomnoži, nato pa se jih vrne nazaj v bolnika (podobna je CAR-T celični terapiji) [1].		Da bi odpravili pomanjkljivosti trenutnih terapij proti AAV, je nizozemska iGEM ekipa oblikovala !MPACT: modularno in prilagojeno avtoimunsko celično terapijo. Ta celična terapija zazna ANCA avtoprotitelesa, ki so povezana z vaskulitisom. V prisotnosti ANCA nastane interlevkin-10 (IL-10), naravni protivnetni citokin, kar povzroči specifično utišanje avtoimunskega odziva. Terapija bi potekala tako, da se bolniku najprej odvzamejo imunske celice, nato se te celice gensko spremeni in pomnoži, nato pa se jih vrne nazaj v bolnika (podobna je CAR-T celični terapiji) [1].

	!MPACT temelji na principu GEMS (ang. Generalized Extracellular Molecule Sensor), ki ga je opisal Scheller s sodelavci. Gre za modularni sintezni receptor, ki omogoča prenos signala preko vezave zunajceličnega liganda na receptor, ki nato aktivira znotrajcelično signalno pot. V primeru !MPACT vezava patogenih ANCA avtoprotiteles na receptor vodi do dimerizacije in aktivacije receptorja, s čimer se začne signalna pot, ki povzroči proizvodnjo in lokalno sproščanje protivnetnega citokina IL-10. Lokalno sproščanje IL-10 naj bi imelo velik potencial pri zdravljenju avtoimunskih bolezni glede na literaturo [1].		!MPACT temelji na principu GEMS (ang. Generalized Extracellular Molecule Sensor), ki ga je opisal Scheller s sodelavci [2]. Gre za modularni sintezni receptor, ki omogoča prenos signala preko vezave zunajceličnega liganda na receptor, ki nato aktivira znotrajcelično signalno pot. V primeru !MPACT vezava patogenih ANCA avtoprotiteles na receptor vodi do dimerizacije in aktivacije receptorja, s čimer se začne signalna pot, ki povzroči proizvodnjo in lokalno sproščanje protivnetnega citokina IL-10. Lokalno sproščanje IL-10 naj bi imelo velik potencial pri zdravljenju avtoimunskih bolezni glede na literaturo [1].

	Delovanje !MPACT je odvisno od koncentracije prisotnih ANCA. Višje koncentracije ANCA, tj. višja aktivnost bolezni, bodo povzročile večjo proizvodnjo IL-10, kar bo povzročilo močnejšo supresijo vnetja. Poleg tega je prisotnost ANCA nujno potrebna za proizvodnjo IL-10. Če ni prisotnih ANCA, tj. ni aktivnosti bolezni, celice "spijo" in zato ne bodo sproščale IL-10. Tako lahko na kontroliran način zdravimo GPA in preprečimo ponovitve bolezni [1].		Delovanje !MPACT je odvisno od koncentracije prisotnih ANCA. Višje koncentracije ANCA, tj. višja aktivnost bolezni, bodo povzročile večjo proizvodnjo IL-10, kar bo povzročilo močnejšo supresijo vnetja. Poleg tega je prisotnost ANCA nujno potrebna za proizvodnjo IL-10. Če ni prisotnih ANCA, tj. ni aktivnosti bolezni, celice "spijo" in zato ne bodo sproščale IL-10. Tako lahko na kontroliran način zdravimo GPA in preprečimo ponovitve bolezni [1].

Jure Povšin at 20:34, 21 May 2023

2023-05-21T20:34:15Z

← Older revision		Revision as of 20:34, 21 May 2023
Line 1:		Line 1:
	Nizozemska dodiplomska ekipa iz TU Eindhoven je leta 2022 na iGEM tekmovanju s projektom ~~IMPACT~~ zasedla prvo mesto v svoji skupini. Njihov projekt je dostopen na povezavi: https://2022.igem.wiki/tu-eindhoven/		Nizozemska dodiplomska ekipa iz TU Eindhoven je leta 2022 na iGEM tekmovanju s projektom !MPACT zasedla prvo mesto v svoji skupini. Njihov projekt je dostopen na povezavi: https://2022.igem.wiki/tu-eindhoven/

	Avtor povzetka: Jure Povšin		Avtor povzetka: Jure Povšin

Jure Povšin: /* Rešitev */

2023-05-21T20:28:49Z

Rešitev

← Older revision		Revision as of 20:28, 21 May 2023
Line 16:		Line 16:
	Da bi odpravili pomanjkljivosti trenutnih terapij proti AAV, je nizozemska iGEM ekipa oblikovala !MPACT: modularno in prilagojeno avtoimunsko celično terapijo. Ta celična terapija zazna ANCA avtoprotitelesa, ki so povezana z vaskulitisom. V prisotnosti ANCA nastane interlevkin-10 (IL-10), naravni protivnetni citokin, kar povzroči specifično utišanje avtoimunskega odziva. Terapija bi potekala tako, da se bolniku najprej odvzamejo imunske celice, nato se te celice gensko spremeni in pomnoži, nato pa se jih vrne nazaj v bolnika (podobna je CAR-T celični terapiji) [1].		Da bi odpravili pomanjkljivosti trenutnih terapij proti AAV, je nizozemska iGEM ekipa oblikovala !MPACT: modularno in prilagojeno avtoimunsko celično terapijo. Ta celična terapija zazna ANCA avtoprotitelesa, ki so povezana z vaskulitisom. V prisotnosti ANCA nastane interlevkin-10 (IL-10), naravni protivnetni citokin, kar povzroči specifično utišanje avtoimunskega odziva. Terapija bi potekala tako, da se bolniku najprej odvzamejo imunske celice, nato se te celice gensko spremeni in pomnoži, nato pa se jih vrne nazaj v bolnika (podobna je CAR-T celični terapiji) [1].

	!MPACT temelji na principu GEMS (ang. Generalized Extracellular Molecule Sensor), ki ga je opisal Scheller s sodelavci. Gre za modularni sintezni receptor, ki omogoča prenos signala preko vezave zunajceličnega liganda na receptor, ki nato aktivira znotrajcelično signalno pot. V primeru !MPACT vezava patogenih ANCA avtoprotiteles na receptor vodi do dimerizacije in aktivacije receptorja, s čimer se začne signalna pot, ki povzroči proizvodnjo in lokalno sproščanje protivnetnega citokina IL-10. Lokalno sproščanje IL-10 naj bi imelo velik potencial pri zdravljenju avtoimunskih bolezni glede na literaturo.		!MPACT temelji na principu GEMS (ang. Generalized Extracellular Molecule Sensor), ki ga je opisal Scheller s sodelavci. Gre za modularni sintezni receptor, ki omogoča prenos signala preko vezave zunajceličnega liganda na receptor, ki nato aktivira znotrajcelično signalno pot. V primeru !MPACT vezava patogenih ANCA avtoprotiteles na receptor vodi do dimerizacije in aktivacije receptorja, s čimer se začne signalna pot, ki povzroči proizvodnjo in lokalno sproščanje protivnetnega citokina IL-10. Lokalno sproščanje IL-10 naj bi imelo velik potencial pri zdravljenju avtoimunskih bolezni glede na literaturo [1].

	Delovanje !MPACT je odvisno od koncentracije prisotnih ANCA. Višje koncentracije ANCA, tj. višja aktivnost bolezni, bodo povzročile večjo proizvodnjo IL-10, kar bo povzročilo močnejšo supresijo vnetja. Poleg tega je prisotnost ANCA nujno potrebna za proizvodnjo IL-10. Če ni prisotnih ANCA, tj. ni aktivnosti bolezni, celice "spijo" in zato ne bodo sproščale IL-10. Tako lahko na kontroliran način zdravimo GPA in preprečimo ponovitve bolezni [1].		Delovanje !MPACT je odvisno od koncentracije prisotnih ANCA. Višje koncentracije ANCA, tj. višja aktivnost bolezni, bodo povzročile večjo proizvodnjo IL-10, kar bo povzročilo močnejšo supresijo vnetja. Poleg tega je prisotnost ANCA nujno potrebna za proizvodnjo IL-10. Če ni prisotnih ANCA, tj. ni aktivnosti bolezni, celice "spijo" in zato ne bodo sproščale IL-10. Tako lahko na kontroliran način zdravimo GPA in preprečimo ponovitve bolezni [1].

	== Mehanizem delovanja ==		== Mehanizem delovanja ==

Jure Povšin: /* Viri */

2023-05-21T20:27:59Z

Viri

← Older revision		Revision as of 20:27, 21 May 2023
Line 60:		Line 60:
	[1] Home \| TU-Eindhoven - iGEM 2022 https://2022.igem.wiki/tu-eindhoven/ (pridobljeno 19. 5. 2023)		[1] Home \| TU-Eindhoven - iGEM 2022 https://2022.igem.wiki/tu-eindhoven/ (pridobljeno 19. 5. 2023)

	[2] L. Scheller, T. Strittmatter, D. Fuchs, D. Bojar, M. Fussenegger: Generalized extracellular molecule sensor platform for programming cellular behavior. ''Nat. Chem. Biol.'' 2018 ~~147 2018~~,'' 14(7)'', str. 723–729.		[2] L. Scheller, T. Strittmatter, D. Fuchs, D. Bojar, M. Fussenegger: Generalized extracellular molecule sensor platform for programming cellular behavior. ''Nat. Chem. Biol.'' '''2018''','' 14(7)'', str. 723–729.

Jure Povšin: /* Viri */

2023-05-21T20:27:32Z

Viri

← Older revision		Revision as of 20:27, 21 May 2023
Line 60:		Line 60:
	[1] Home \| TU-Eindhoven - iGEM 2022 https://2022.igem.wiki/tu-eindhoven/ (pridobljeno 19. 5. 2023)		[1] Home \| TU-Eindhoven - iGEM 2022 https://2022.igem.wiki/tu-eindhoven/ (pridobljeno 19. 5. 2023)

	[2] L. Scheller, T. Strittmatter, D. Fuchs, D. Bojar, M. Fussenegger: Generalized extracellular molecule sensor platform for programming cellular behavior. Nat. Chem. Biol. 2018 147 2018, 14(7), str. 723–729.		[2] L. Scheller, T. Strittmatter, D. Fuchs, D. Bojar, M. Fussenegger: Generalized extracellular molecule sensor platform for programming cellular behavior. ''Nat. Chem. Biol.'' 2018 147 2018,'' 14(7)'', str. 723–729.

Jure Povšin: /* Viri */

2023-05-21T20:26:09Z

Viri

← Older revision		Revision as of 20:26, 21 May 2023
Line 59:		Line 59:

	[1] Home \| TU-Eindhoven - iGEM 2022 https://2022.igem.wiki/tu-eindhoven/ (pridobljeno 19. 5. 2023)		[1] Home \| TU-Eindhoven - iGEM 2022 https://2022.igem.wiki/tu-eindhoven/ (pridobljeno 19. 5. 2023)

	[2] L. Scheller, T. Strittmatter, D. Fuchs, D. Bojar, M. Fussenegger: Generalized extracellular molecule sensor platform for programming cellular behavior. Nat. Chem. Biol. 2018 147 2018, 14(7), str. 723–729.		[2] L. Scheller, T. Strittmatter, D. Fuchs, D. Bojar, M. Fussenegger: Generalized extracellular molecule sensor platform for programming cellular behavior. Nat. Chem. Biol. 2018 147 2018, 14(7), str. 723–729.