Milena Todorovska at 20:34, 24 May 2026

2026-05-24T20:34:35Z

← Older revision		Revision as of 20:34, 24 May 2026
Line 1:		Line 1:
			AbsorBuddy je projekt ekipe Aalto-Helsinki, predstavljen na tekmovanju iGEM 2025. Projekt se osredotoča na razvoj oralnega sistema za dostavo vitamina B12 z uporabo rekombinantnih intrinzičnih faktorjev različnih vrst. Ekipa je za projekt prejela zlato medaljo ter nominaciji za Best Measurement in Best Therapeutics Project.


	==Uvod==		==Uvod==

Milena Todorovska at 20:33, 24 May 2026

2026-05-24T20:33:09Z

← Older revision		Revision as of 20:33, 24 May 2026
Line 25:		Line 25:
	V konstrukte so vključili več funkcionalnih elementov:		V konstrukte so vključili več funkcionalnih elementov:

	gen CBLIF za zapis intrinzičnega faktorja,		* gen CBLIF za zapis intrinzičnega faktorja,
	* α-faktor signalni peptid za sekrecijo proteina,		* α-faktor signalni peptid za sekrecijo proteina,
	* 6xHis oznako za purifikacijo,		* 6xHis oznako za purifikacijo,

Milena Todorovska at 20:32, 24 May 2026

2026-05-24T20:32:39Z

← Older revision		Revision as of 20:32, 24 May 2026
Line 25:		Line 25:
	V konstrukte so vključili več funkcionalnih elementov:		V konstrukte so vključili več funkcionalnih elementov:

	-gen CBLIF za zapis intrinzičnega faktorja,		gen CBLIF za zapis intrinzičnega faktorja,
	-α-faktor signalni peptid za sekrecijo proteina,		* α-faktor signalni peptid za sekrecijo proteina,
	-6xHis oznako za purifikacijo,		* 6xHis oznako za purifikacijo,
	-HA oznako za detekcijo proteinov,		* HA oznako za detekcijo proteinov,
	-TEV cepitveno mesto za odstranitev oznak po purifikaciji,		* TEV cepitveno mesto za odstranitev oznak po purifikaciji,
	-restrikcijski mesti XhoI in NotI za restrikcijsko kloniranje.		* restrikcijski mesti XhoI in NotI za restrikcijsko kloniranje.

	===Restrikcijsko kloniranje in priprava konstruktov===		===Restrikcijsko kloniranje in priprava konstruktov===
Line 40:		Line 40:
	Za preverjanje uspešnosti kloniranja so izvedli kolonijski PCR in gelsko elektroforezo. Pozitivne kolonije so nato uporabili za izolacijo plazmidne DNA (plasmid miniprep) in sekvenciranje. Sekvence so primerjali z načrtovanimi konstrukti v programu SnapGene. Kolonijski PCR in sekvenciranje sta potrdila uspešno restrikcijsko kloniranje ter pravilno vključitev IF insertov v ekspresijski vektor. Pri večini vrst so identificirali več pozitivnih kolonij, medtem ko je bil pri humanem IF pozitiven le manjši delež kolonij.		Za preverjanje uspešnosti kloniranja so izvedli kolonijski PCR in gelsko elektroforezo. Pozitivne kolonije so nato uporabili za izolacijo plazmidne DNA (plasmid miniprep) in sekvenciranje. Sekvence so primerjali z načrtovanimi konstrukti v programu SnapGene. Kolonijski PCR in sekvenciranje sta potrdila uspešno restrikcijsko kloniranje ter pravilno vključitev IF insertov v ekspresijski vektor. Pri večini vrst so identificirali več pozitivnih kolonij, medtem ko je bil pri humanem IF pozitiven le manjši delež kolonij.

	===Transformacija kvasovke Komagataella phaffii==		===Transformacija kvasovke Komagataella phaffii===
	Po potrditvi konstruktov so raziskovalci izvedli transformacijo kvasovke K. phaffii. Plazmide so najprej linearizirali z restrikcijskim encimom AvrII, saj linearna DNA omogoča učinkovitejšo integracijo konstrukta v genom kvasovke in so izvedli transformacijo z elektroporacijo.		Po potrditvi konstruktov so raziskovalci izvedli transformacijo kvasovke K. phaffii. Plazmide so najprej linearizirali z restrikcijskim encimom AvrII, saj linearna DNA omogoča učinkovitejšo integracijo konstrukta v genom kvasovke in so izvedli transformacijo z elektroporacijo.

Milena Todorovska: Created page with " ==Uvod== Vitamin B12 oziroma kobalamin je esencialen vodotopen vitamin, ki ima pomembno vlogo pri sintezi DNA, nastajanju rdečih krvnih celic ter pravilnem delovanju živčnega sistema. Pomanjkanje vitamina B12 lahko povzroči številne zdravstvene težave, kot so utrujenost, anemija, nevrološke motnje, motnje koncentracije in trajne poškodbe živčevja. Eden izmed najpomembnejših dejavnikov za učinkovito absorpcijo vitamina B12 v človeškem telesu je intrinzični..."

2026-05-24T20:28:49Z

Created page with " ==Uvod== Vitamin B12 oziroma kobalamin je esencialen vodotopen vitamin, ki ima pomembno vlogo pri sintezi DNA, nastajanju rdečih krvnih celic ter pravilnem delovanju živčnega sistema. Pomanjkanje vitamina B12 lahko povzroči številne zdravstvene težave, kot so utrujenost, anemija, nevrološke motnje, motnje koncentracije in trajne poškodbe živčevja. Eden izmed najpomembnejših dejavnikov za učinkovito absorpcijo vitamina B12 v človeškem telesu je intrinzični..."

New page

==Uvod==
Vitamin B12 oziroma kobalamin je esencialen vodotopen vitamin, ki ima pomembno vlogo pri sintezi DNA, nastajanju rdečih krvnih celic ter pravilnem delovanju živčnega sistema. Pomanjkanje vitamina B12 lahko povzroči številne zdravstvene težave, kot so utrujenost, anemija, nevrološke motnje, motnje koncentracije in trajne poškodbe živčevja. Eden izmed najpomembnejših dejavnikov za učinkovito absorpcijo vitamina B12 v človeškem telesu je intrinzični faktor (IF), glikoprotein, ki ga izločajo parietalne celice želodca. IF omogoča vezavo vitamina B12 in njegov transport do receptorja cubilin v tankem črevesu, kjer pride do absorpcije kompleksa IF–B12.

Pri bolnikih s perniciozno anemijo ali drugimi oblikami IF-deficience pride do motene absorpcije vitamina B12. Perniciozna anemija je avtoimunska bolezen, pri kateri organizem proizvaja protitelesa proti intrinzičnemu faktorju ali želodčnim parietalnim celicam, zaradi česar se absorpcija vitamina B12 močno zmanjša. Trenutno zdravljenje temelji predvsem na intramuskularnih injekcijah vitamina B12, saj običajni oralni dodatki pri bolnikih z moteno absorpcijo pogosto niso dovolj učinkoviti.

Čeprav so injekcije učinkovite, predstavljajo številne težave za bolnike in zdravstveni sistem. Terapija je pogosto vseživljenjska, zahteva redne obiske zdravstvenih ustanov, povzroča nelagodje ter povečuje količino medicinskih odpadkov. Zaradi teh razlogov je ekipa Aalto-Helsinki iGEM 2025 želela raziskati možnost razvoja alternativnega oralnega sistema za dostavo vitamina B12 z uporabo rekombinantnih intrinzičnih faktorjev.

Projekt AbsorBuddy temelji na hipotezi, da bi lahko nekateri nečloveški intrinzični faktorji ohranili učinkovito vezavo vitamina B12, hkrati pa bi bili manj imunološko reaktivni pri bolnikih s perniciozno anemijo. Raziskovalci so zato primerjali intrinzične faktorje petih različnih vrst: človeka, prašiča, goveda, podgane in kljunaša. Namen projekta ni bil razvoj končnega zdravila ali prehranskega dopolnila, temveč vzpostavitev eksperimentalne platforme za primerjavo funkcionalnih in imunoloških lastnosti različnih IF proteinov.

Projekt je bil zasnovan po principu Design-Build-Test-Learn (DBTL), ki se pogosto uporablja v sintezni biologiji. V fazi načrtovanja so raziskovalci analizirali literaturo, izbrali ustrezne vrste in načrtovali genske konstrukte ter eksperimentalne metode. V fazi gradnje so pripravili ekspresijske konstrukte, izvedli kloniranje in ekspresijo proteinov v kvasovki Komagataella phaffii. Sledile so funkcionalne, strukturne in imunološke analize proteinov, rezultati pa so omogočili nadaljnjo optimizacijo eksperimentalnega sistema.

==Izvedba projekta==

===Načrtovanje ekspresijskega sistema===
Prvi korak projekta je bil načrtovanje sistema za produkcijo rekombinantnih intrinzičnih faktorjev (IF) različnih vrst. Raziskovalci so želeli primerjati funkcionalnost in imunološke lastnosti IF proteinov človeka, goveda, prašiča, podgane in kljunaša ter ugotoviti, ali bi lahko nečloveški IF predstavljali primernejše kandidate za oralno dostavo vitamina B12 pri bolnikih s perniciozno anemijo.

Na podlagi pregleda literature so ugotovili, da IF proteinov različnih vrst še niso sistematično primerjali glede vezave vitamina B12 in imunološke reaktivnosti. Poleg tega je literatura pokazala, da je kvasovka Komagataella phaffii primeren ekspresijski sistem za produkcijo rekombinantnih glikoproteinov, saj omogoča pravilno zvijanje proteinov in posttranslacijske modifikacije, predvsem glikozilacijo.

Pri kvasovki Komagataella phaffii se za induciranje ekspresije proteinov pogosto uporablja metanol. Ker pa je bil cilj projekta razvoj oralnega terapevtskega sistema, uporaba metanola ni bila primerna zaradi možnih ostankov v končnem produktu. Zato so raziskovalci izbrali glukozno induciran vektor pGAPZα A, ki omogoča varnejšo produkcijo rekombinantnih IF proteinov.

V konstrukte so vključili več funkcionalnih elementov:

-gen CBLIF za zapis intrinzičnega faktorja,
-α-faktor signalni peptid za sekrecijo proteina,
-6xHis oznako za purifikacijo,
-HA oznako za detekcijo proteinov,
-TEV cepitveno mesto za odstranitev oznak po purifikaciji,
-restrikcijski mesti XhoI in NotI za restrikcijsko kloniranje.

===Restrikcijsko kloniranje in priprava konstruktov===

Po načrtovanju konstruktov so raziskovalci pripravili inserte za posamezne IF proteine. Genske sekvence so pridobili iz baze NCBI ter jih kodonsko optimizirali za izražanje v kvasovki K. phaffii. Nato so izvedli PCR amplifikacijo insertov in uspešnost reakcije preverili z gelsko elektroforezo, kjer so opazili DNA pasove pričakovane velikosti približno 1300 baznih parov.

Sledila je restrikcijska cepitev insertov in vektorja pGAPZα A z encimoma XhoI in NotI. Inserte so nato s pomočjo T4 DNA ligaze vključili v plazmidni vektor. Rekombinantne plazmide so transformirali v kompetentne celice Escherichia coli ter izvedli selekcijo na LB agarju z antibiotikom Zeocin.

Za preverjanje uspešnosti kloniranja so izvedli kolonijski PCR in gelsko elektroforezo. Pozitivne kolonije so nato uporabili za izolacijo plazmidne DNA (plasmid miniprep) in sekvenciranje. Sekvence so primerjali z načrtovanimi konstrukti v programu SnapGene. Kolonijski PCR in sekvenciranje sta potrdila uspešno restrikcijsko kloniranje ter pravilno vključitev IF insertov v ekspresijski vektor. Pri večini vrst so identificirali več pozitivnih kolonij, medtem ko je bil pri humanem IF pozitiven le manjši delež kolonij.

===Transformacija kvasovke Komagataella phaffii==
Po potrditvi konstruktov so raziskovalci izvedli transformacijo kvasovke K. phaffii. Plazmide so najprej linearizirali z restrikcijskim encimom AvrII, saj linearna DNA omogoča učinkovitejšo integracijo konstrukta v genom kvasovke in so izvedli transformacijo z elektroporacijo.

Transformirane celice so nato gojili na YPDS agarske plošče z antibiotikom Zeocin. Po nekaj dneh inkubacije so opazili rast kolonij, kar je potrdilo uspešno transformacijo ekspresijskega sistema. Po treh dneh inkubacije so na selekcijskih ploščah opazili rast kolonij pri vseh IF konstruktih, kar je potrdilo uspešno transformacijo kvasovke in vzpostavitev ekspresijskega sistema.

===Ekspresija rekombinantnih intrinzičnih faktorjev===

Za proteinsko ekspresijo so raziskovalci izbrali po tri kolonije za vsako vrsto IF ter pripravili začetne kulture v YPD mediju. Po inkubaciji so kulture prenesli v večje erlenmajerice in nadaljevali gojenje v stresalnem inkubatorju pri kontrolirani temperaturi. Ekspresijo proteinov so dnevno spremljali z metodo SDS-PAGE, ki omogoča ločevanje proteinov glede na njihovo molekulsko maso.

Med prvim poskusom ekspresije so opazili kontaminacijo kultur, zato so morali del eksperimenta ponoviti v strožjih sterilnih pogojih. Pripravili so nova gojišča, dodali antibiotik Zeocin ter natančneje spremljali ekspresijo in stabilnost proteinov. Po petih dneh so dosegli zadovoljivo ekspresijo več IF proteinov in izbrali kulture z najboljšim izkoristkom za nadaljnje analize.

Po centrifugiranju kultur so zbrali supernatante, saj je bil IF zaradi α-faktor signalnega peptida izločen v gojišče. SDS-PAGE analiza je pokazala uspešno ekspresijo več IF proteinov. Najboljše izražanje so pokazali goveji, podganji in humani IF, medtem ko je bila ekspresija prašičjega in kljunaševega IF manj učinkovita.

===Purifikacija proteinov===
Purifikacija IF proteinov je potekala v dveh glavnih korakih: afinitetna kromatografija in size exclusion kromatografija (SEC).

Najprej so izvedli purifikacijo preko 6xHis oznake z uporabo Ni-NTA smole. Prvotno so želeli uporabiti avtomatski kromatografski sistem, vendar je med eksperimentom prišlo do okvare zaradi česar avtomatska purifikacija ni bila mogoča. Raziskovalci so zato prilagodili eksperimentalni pristop in uporabili ročno afinitetno kromatografijo.

Proteinske supernatante so inkubirali z Ni-NTA smolo, nato pa izvedli spiranje in elucijo proteinov z imidazolom ki izrine His-označene proteine iz Ni-NTA smole. Zbrane elucijske frakcije so analizirali z metodo SDS-PAGE. Rezultati so pokazali precejšnje razlike med vrstami. Najboljše proteinske pasove sta pokazala goveji in podganji IF, medtem ko so bili humani, kljunašev in prašičji IF izraženi bistveno slabše.

SDS-PAGE analiza je pokazala precejšnje razlike med posameznimi IF proteini. Najizrazitejše proteinske pasove sta pokazala goveji in podganji IF, kar kaže na uspešno purifikacijo in višji proteinski izkoristek. Pri humanem, kljunaševem in prašičjem IF so bili proteinski pasovi precej šibkejši.

Za dodatno čiščenje proteinov so nato izvedli size exclusion kromatografijo. SEC omogoča ločevanje proteinov glede na velikost ter odstranjevanje agregatov in kontaminantov.

Po SEC purifikaciji so raziskovalci ugotovili, da pri prašičjem IF ni bilo zaznati značilnega UV vrha niti proteinskih pasov na SDS-PAGE gelu. Zaradi prenizke koncentracije oziroma slabega izkoristka so prašičji IF izključili iz nadaljnjih analiz.

===Funkcionalna in imunološka karakterizacija===
Po uspešni purifikaciji proteinov so raziskovalci izvedli funkcionalne in imunološke analize IF proteinov. Namen teh analiz je bil preveriti, ali proteini ohranjajo sposobnost vezave vitamina B12 ter kako močno jih prepoznajo protitelesa proti humanemu intrinzičnemu faktorju.

Prva analiza je bila indirektni ELISA test. Ker raziskovalci niso našli ustreznega komercialnega sistema, so razvili lasten ELISA postopek. Na 96-jamčno ploščo so nanesli purificirane IF proteine različnih vrst ter komercialni rekombinantni humani IF kot pozitivno kontrolo. Nato so dodali protitelesa proti humanemu IF in primerjali imunološko reaktivnost med vrstami.

Rezultati ELISA testa so pokazali najmočnejšo vezavo pri komercialnem in humanem IF, medtem ko je bila reaktivnost pri nečloveških IF precej manjša. Najnižjo vezavo protiteles je pokazal podganji IF, kar nakazuje možnost manjše imunogenosti pri človeku. Tudi kljunašev IF je pokazal nizko imunološko reaktivnost, kar podpira hipotezo, da bi lahko nekateri nečloveški IF povzročali manj avtoimunskih interakcij.

Nato so raziskovalci izvedli še funkcionalno analizo vezave vitamina B12 z uporabo UV-Vis spektrofotometrije. Purificirane IF proteine so inkubirali s cianokobalaminom, nato pa z uporabo 3.5 kDa MWCO filtrov ločili vezani in nevezani vitamin B12. Absorbanco so merili pri 280 nm, ki predstavlja koncentracijo proteinov, ter pri 361 nm, ki ustreza vitaminu B12.

Rezultati so pokazali, da je imel goveji intrinzični faktor najboljšo sposobnost vezave vitamina B12. Dobro vezavo sta pokazala tudi humani in kljunašev IF, medtem ko je imel podganji IF bistveno nižjo vezavo vitamina B12, čeprav je hkrati pokazal najmanjšo imunološko reaktivnost v ELISA testu.

Raziskovalci so dodatno poskusili še z MP-AES elementalno analizo za določanje kobalta v IF–B12 kompleksih, saj vitamin B12 vsebuje atom kobalta. Vendar občutljivost metode ni bila zadostna za natančno kvantifikacijo vzorcev.

Na koncu so izvedli še CD spektroskopijo govejega intrinzičnega faktorja, ki je bil po purifikaciji na voljo v zadostni čistosti in koncentraciji. Analiza je pokazala pravilno α/β sekundarno strukturo, značilno za naravno zvite intrinzične faktorje, kar dodatno potrjuje funkcionalnost in stabilnost rekombinantnega proteina.«

==Zaključek==
Projekt AbsorBuddy predstavlja celovit pristop k razvoju alternativnega oralnega sistema za dostavo vitamina B12 pri bolnikih z moteno absorpcijo. Raziskovalci so uspešno vzpostavili sistem za produkcijo rekombinantnih intrinzičnih faktorjev različnih vrst v kvasovki Komagataella phaffii ter izvedli njihovo funkcionalno, imunološko in strukturno primerjavo.

Rezultati so pokazali, da imajo posamezni IF proteini pomembne razlike v ekspresiji, imunološki reaktivnosti in sposobnosti vezave vitamina B12. Posebej zanimiv se je izkazal podganji IF zaradi nizke vezave protiteles, medtem ko je goveji IF pokazal najboljšo vezavo vitamina B12 in dobro proteinsko stabilnost.

Čeprav projekt ni razvil končnega terapevtskega produkta, je pomembno prispeval k razumevanju medvrstnih razlik intrinzičnih faktorjev ter vzpostavil eksperimentalno platformo za nadaljnje raziskave oralnih terapij.

==Viri==
[1] Aalto-Helsinki. AbsorBuddy (https://2025.igem.wiki/aalto-helsinki/)

AbsorBuddy - Revision history

Milena Todorovska at 20:34, 24 May 2026

Milena Todorovska at 20:33, 24 May 2026

Milena Todorovska at 20:32, 24 May 2026