BeeYeast - Revision history

Matejam3270: /* Reference */

2024-04-05T10:36:32Z

Reference

← Older revision		Revision as of 10:36, 5 April 2024
Line 51:		Line 51:

	== Reference ==		== Reference ==
	[1] EstoniaTUIT iGEM project '''2023''' - https://2023.igem.wiki/estonia-tuit/home ~~(pridobljeno dne~~ 4~~.4.~~2024.)		[1] EstoniaTUIT iGEM project '''2023'''. Pridobljeno s: https://2023.igem.wiki/estonia-tuit/home [Dostopano 4 april 2024]

	[2] MARTIN, Stephen J., et al. Global honey bee viral landscape altered by a parasitic mite. ''Science'', '''2012''', 336.6086: 1304-1306.		[2] MARTIN, Stephen J., et al. Global honey bee viral landscape altered by a parasitic mite. ''Science'', '''2012''', 336.6086: 1304-1306.

Matejam3270: /* Načrtovanje in in silico testi */

2024-04-05T10:35:16Z

Načrtovanje in in silico testi

← Older revision		Revision as of 10:35, 5 April 2024
Line 30:		Line 30:
	V tej fazi projekta so se fokusirali najti odgovore na naslednje izzive:		V tej fazi projekta so se fokusirali najti odgovore na naslednje izzive:
	- Koliko učinkovita bo anti-DWV siRNA in kako ločiti bolj učinkovite od manj?		- Koliko učinkovita bo anti-DWV siRNA in kako ločiti bolj učinkovite od manj?
	- Kolika je stabilnost konstrukta? Če konstrukt ostane učinkovit in aktiven in vivo v čebelah?		- Kolika je stabilnost konstrukta? Če konstrukt ostane učinkovit in aktiven ''in vivo'' v čebelah?

	V '''1.''' fazi so z računalniškim orodjem GenScript siRNA Target Finder našli ustrezna specifična tarčna zaporedja na genomu virusa DWV. Predstavljeno je 10 potencialnih shRNA variant, ki so jim nadalje z matematičnimi in računalniškimi modeli testirali biofizikalne lastnosti. Rezultati kažejo, da 6 različnih zaporedji shRNA ima maksimalno raven izražanja in pravilnega zvitja, 1 pa ima najmanjšo. Iz tega so zaključili da same razlike v zaporedju vplivajo na proizvodnjo, razgradnjo in zvitje; kjer je glavna determinanta kopičenja shRNA njena stabilnost [1].		V '''1.''' fazi so z računalniškim orodjem GenScript siRNA Target Finder našli ustrezna specifična tarčna zaporedja na genomu virusa DWV. Predstavljeno je 10 potencialnih shRNA variant, ki so jim nadalje z matematičnimi in računalniškimi modeli testirali biofizikalne lastnosti. Rezultati kažejo, da 6 različnih zaporedji shRNA ima maksimalno raven izražanja in pravilnega zvitja, 1 pa ima najmanjšo. Iz tega so zaključili da same razlike v zaporedju vplivajo na proizvodnjo, razgradnjo in zvitje; kjer je glavna determinanta kopičenja shRNA njena stabilnost [1].

Matejam3270: /* Zaključek */

2024-04-05T10:34:40Z

Zaključek

← Older revision		Revision as of 10:34, 5 April 2024
Line 48:		Line 48:

	== Zaključek ==		== Zaključek ==
	Narejeni poskusi vodijo do treh pomembnih zaključkov. Prvo, predstavljeno delo potrjuje, da je uvedba proteinov Dicer in Argonaut v S. ~~Cerevisae~~ zadostna za rekonstitucijo odziva iRNA. Drugo, poskusi kažejo, da z uvedbo virusnega zaporedja v 3'-UTR kodirajočega zaporedja za GFP lahko ciljamo virusna zaporedja s shRNA in enostavno merimo učinkovitost iRNA. Tretje, s testiranimi anti-DWV siRNA kot potencialna terapija proti virusu DWV, so določili močne kandidate za nadalje testiranje na čebelah [1].		Narejeni poskusi vodijo do treh pomembnih zaključkov. Prvo, predstavljeno delo potrjuje, da je uvedba proteinov Dicer in Argonaut v ''S. cerevisae'' zadostna za rekonstitucijo odziva iRNA. Drugo, poskusi kažejo, da z uvedbo virusnega zaporedja v 3'-UTR kodirajočega zaporedja za GFP lahko ciljamo virusna zaporedja s shRNA in enostavno merimo učinkovitost iRNA. Tretje, s testiranimi anti-DWV siRNA kot potencialna terapija proti virusu DWV, so določili močne kandidate za nadalje testiranje na čebelah [1].

	== Reference ==		== Reference ==

Matejam3270: /* Zaključek */

2024-04-05T10:26:02Z

Zaključek

← Older revision		Revision as of 10:26, 5 April 2024
Line 48:		Line 48:

	== Zaključek ==		== Zaključek ==
	Narejeni poskusi vodijo do treh pomembnih zaključkov. Prvo, predstavljeno delo potrjuje, da je uvedba proteinov Dicer in Argonaut v S. Cerevisae zadostna za rekonstitucijo odziva iRNA. Drugo, poskusi kažejo, da z uvedbo virusnega zaporedja v 3'-UTR kodirajočega zaporedja za GFP lahko ciljamo virusna zaporedja s shRNA in enostavno merimo učinkovitost ~~RNAi~~. Tretje, s testiranimi anti-DWV siRNA kot potencialna terapija proti virusu DWV, so določili močne kandidate za nadalje testiranje na čebelah [1].		Narejeni poskusi vodijo do treh pomembnih zaključkov. Prvo, predstavljeno delo potrjuje, da je uvedba proteinov Dicer in Argonaut v S. Cerevisae zadostna za rekonstitucijo odziva iRNA. Drugo, poskusi kažejo, da z uvedbo virusnega zaporedja v 3'-UTR kodirajočega zaporedja za GFP lahko ciljamo virusna zaporedja s shRNA in enostavno merimo učinkovitost iRNA. Tretje, s testiranimi anti-DWV siRNA kot potencialna terapija proti virusu DWV, so določili močne kandidate za nadalje testiranje na čebelah [1].

	== Reference ==		== Reference ==

Matejam3270: /* Sestavljanje konstruktov */

2024-04-05T10:25:51Z

Sestavljanje konstruktov

← Older revision		Revision as of 10:25, 5 April 2024
Line 44:		Line 44:
	Ker divji tip ''S. cerevisae'' ne vsebuje proteina Dicer in Argonaut, ki so nujni za generiranje siRNA iz shRNA, kodirajoča zaporedja so klonirali v ekspresijsko kaseto in so jih izražali v ''S. cerevisae''. Zapisa za proteina so vzeli iz sorodne kvasovke ''S. castellii'' in so jih izražali pod kontrolo dva različna, močna konstitutivna promotorja, ki so dobro opisani kot biokocke v registru iGEM.		Ker divji tip ''S. cerevisae'' ne vsebuje proteina Dicer in Argonaut, ki so nujni za generiranje siRNA iz shRNA, kodirajoča zaporedja so klonirali v ekspresijsko kaseto in so jih izražali v ''S. cerevisae''. Zapisa za proteina so vzeli iz sorodne kvasovke ''S. castellii'' in so jih izražali pod kontrolo dva različna, močna konstitutivna promotorja, ki so dobro opisani kot biokocke v registru iGEM.
	Vsako od 10 variant shRNA so klonirali v 2µ plazmide pod kontrolo močnega inducibilnega promotorja pGAL1, ki so uravnavali s kontrolo koncentracije galaktoze.		Vsako od 10 variant shRNA so klonirali v 2µ plazmide pod kontrolo močnega inducibilnega promotorja pGAL1, ki so uravnavali s kontrolo koncentracije galaktoze.
	Tarčno zaporedje genoma virusa DWV so fuzirali s kodirajočim zaporedjem za GFP in so konstrukt izražali pod kontrolo močnega inducibilnega promotorja pGAL1. Tako so generirali senzor s katerimi so merili učinkovitost ~~RNAi~~, kjer čim bolj učinkovit je konstrukt siRNA bo manjša raven izražanja GFP-ja, ker pride do utišanja tarčnega zaporedja gena.		Tarčno zaporedje genoma virusa DWV so fuzirali s kodirajočim zaporedjem za GFP in so konstrukt izražali pod kontrolo močnega inducibilnega promotorja pGAL1. Tako so generirali senzor s katerimi so merili učinkovitost iRNA, kjer čim bolj učinkovit je konstrukt siRNA bo manjša raven izražanja GFP-ja, ker pride do utišanja tarčnega zaporedja gena.
	Eksperimentalno, učinkovitost ~~RNAi~~ so določili z merjenjem fluorescence GFP-ja s pretočno citometrijo. Gensko spremenjene kvasovke so gojili 24h pri 30 °C in so kulture redčili do OD<sub>600</sub> vrednosti = 1. Celicam so inducirali izražanje shRNA in konstrukta GFP-tarčno zaporedje in so merili fluorescenco 24h po induciranju. V odsotnosti shRNA so kulture z GFP reporterjem pokazale veliko višji signal. Kot ozadje so uporabili kulture, ki jim niso inducirali izražanje reporterskega proteina. Med 10 variant shRNA konstruktov, ki so jih testirali, so se intezitete fluorescence bistveno razlikovale in so sklepali, da lahko virusno zaporedje, vneseno v 3'-UTR transkripta, vpliva na stabilnost mRNA. Z najbolj učinkovitimi konstrukti so dosegli relativno zmanjšanje intenzitete v fluorescenci za več kot 50% [1].		Eksperimentalno, učinkovitost iRNA so določili z merjenjem fluorescence GFP-ja s pretočno citometrijo. Gensko spremenjene kvasovke so gojili 24h pri 30 °C in so kulture redčili do OD<sub>600</sub> vrednosti = 1. Celicam so inducirali izražanje shRNA in konstrukta GFP-tarčno zaporedje in so merili fluorescenco 24h po induciranju. V odsotnosti shRNA so kulture z GFP reporterjem pokazale veliko višji signal. Kot ozadje so uporabili kulture, ki jim niso inducirali izražanje reporterskega proteina. Med 10 variant shRNA konstruktov, ki so jih testirali, so se intezitete fluorescence bistveno razlikovale in so sklepali, da lahko virusno zaporedje, vneseno v 3'-UTR transkripta, vpliva na stabilnost mRNA. Z najbolj učinkovitimi konstrukti so dosegli relativno zmanjšanje intenzitete v fluorescenci za več kot 50% [1].

	== Zaključek ==		== Zaključek ==

Matejam3270: /* Zaključek */

2024-04-05T10:25:25Z

Zaključek

← Older revision		Revision as of 10:25, 5 April 2024
Line 48:		Line 48:

	== Zaključek ==		== Zaključek ==
	Narejeni poskusi vodijo do treh pomembnih zaključkov. Prvo, predstavljeno delo potrjuje, da je uvedba proteinov Dicer in Argonaut v S. Cerevisae zadostna za rekonstitucijo odziva ~~RNAi~~. Drugo, poskusi kažejo, da z uvedbo virusnega zaporedja v 3'-UTR kodirajočega zaporedja za GFP lahko ciljamo virusna zaporedja s shRNA in enostavno merimo učinkovitost RNAi. Tretje, s testiranimi anti-DWV siRNA kot potencialna terapija proti virusu DWV, so določili močne kandidate za nadalje testiranje na čebelah [1].		Narejeni poskusi vodijo do treh pomembnih zaključkov. Prvo, predstavljeno delo potrjuje, da je uvedba proteinov Dicer in Argonaut v S. Cerevisae zadostna za rekonstitucijo odziva iRNA. Drugo, poskusi kažejo, da z uvedbo virusnega zaporedja v 3'-UTR kodirajočega zaporedja za GFP lahko ciljamo virusna zaporedja s shRNA in enostavno merimo učinkovitost RNAi. Tretje, s testiranimi anti-DWV siRNA kot potencialna terapija proti virusu DWV, so določili močne kandidate za nadalje testiranje na čebelah [1].

	== Reference ==		== Reference ==

Matejam3270: /* Uvod */

2024-04-05T10:24:01Z

Uvod

← Older revision		Revision as of 10:24, 5 April 2024
Line 6:		Line 6:
	== Uvod ==		== Uvod ==
	Medonosna čebela ima velik ekološki, gospodarski in kulturni pomen v človeški civilizaciji. Spadajo med najpomembnejše opraševalce rastlin in so nujne za ohranjanje biodiverzitete. Medonosne čebele oprašujejo 80 odstotkov vseh cvetočih rastlin, vključno z več kot 130 vrstami sadja in zelenjave [1, 2]. Z ekonomske strani so tudi zelo pomembne kot komercialni opraševalci, kjer je njihova tržna vrednost samo v Združenih državah Amerike ocenjena na približno 15–20 milijard dolarjev na leto, svetovno pa čebele kot glavni opraševalci rastlin zagotavljajo 153 milijard evrov, kar predstavlja 9,5 % skupne ekonomske vrednosti kmetijske proizvodnje, ki se neposredno uporablja za človeško hrano [1, 3].		Medonosna čebela ima velik ekološki, gospodarski in kulturni pomen v človeški civilizaciji. Spadajo med najpomembnejše opraševalce rastlin in so nujne za ohranjanje biodiverzitete. Medonosne čebele oprašujejo 80 odstotkov vseh cvetočih rastlin, vključno z več kot 130 vrstami sadja in zelenjave [1, 2]. Z ekonomske strani so tudi zelo pomembne kot komercialni opraševalci, kjer je njihova tržna vrednost samo v Združenih državah Amerike ocenjena na približno 15–20 milijard dolarjev na leto, svetovno pa čebele kot glavni opraševalci rastlin zagotavljajo 153 milijard evrov, kar predstavlja 9,5 % skupne ekonomske vrednosti kmetijske proizvodnje, ki se neposredno uporablja za človeško hrano [1, 3].
	Na žalost, populacije medenih čebel se po vsem svetu zmanjšujejo. Vzroke za odmiranje čebel prepisujejo manjšanju biodiverzitete rastlin, povečanju uporabe pesticidov in med-vrstnem prenosu patogenov in parazitov. Za največje izgube čebeljih družin so odgovorne parazitske pršice iz rodu Varroa, ki prenašajo virus deformiranih kril (ang. Deformed wing virus, DWV) [1,2]. Pršice se hranijo na čebeljih zalegah in pri tem nenamerno prenašajo DWV. Poleg tega pršice oslabijo imunski sistem čebel, zaradi česar so bolj dovzetne za okužbe z DWV. Posledično, kombinacija infestacij Varroa pršic in DWV močno vpliva na čebelje družine, kar vodi v motnje v koloniji in predstavlja pomembno grožnjo populacijam opraševalcev in kmetijskim ekosistemom. Trenutne prakse za preprečevanje ali obvladovanje virusnih okužb, kot je uporaba pesticidov, ne zagotavljajo zadostnih rezultatov za ustavitev upadanja populacij čebel [1, 2, 4, 5].		Na žalost, populacije medenih čebel se po vsem svetu zmanjšujejo. Vzroke za odmiranje čebel prepisujejo manjšanju biodiverzitete rastlin, povečanju uporabe pesticidov in med-vrstnem prenosu patogenov in parazitov. Za največje izgube čebeljih družin so odgovorne parazitske pršice iz rodu Varroa, ki prenašajo virus deformiranih kril (ang. Deformed wing virus, DWV) [1, 2]. Pršice se hranijo na čebeljih zalegah in pri tem nenamerno prenašajo DWV. Poleg tega pršice oslabijo imunski sistem čebel, zaradi česar so bolj dovzetne za okužbe z DWV. Posledično, kombinacija infestacij Varroa pršic in DWV močno vpliva na čebelje družine, kar vodi v motnje v koloniji in predstavlja pomembno grožnjo populacijam opraševalcev in kmetijskim ekosistemom. Trenutne prakse za preprečevanje ali obvladovanje virusnih okužb, kot je uporaba pesticidov, ne zagotavljajo zadostnih rezultatov za ustavitev upadanja populacij čebel [1, 2, 4, 5].


	== Imunski sistem čebel ==		== Imunski sistem čebel ==

Matejam3270: /* Načrtovanje in in silico testi */

2024-04-05T10:23:04Z

Načrtovanje in in silico testi

Matejam3270 at 10:22, 5 April 2024

2024-04-05T10:22:01Z

← Older revision		Revision as of 10:22, 5 April 2024
Line 29:		Line 29:

	V 1. fazi so z računalniškim orodjem GenScript siRNA Target Finder našli ustrezna specifična tarčna zaporedja na genomu virusa DWV. Predstavljeno je 10 potencialnih shRNA variant, ki so jim nadalje z matematičnimi in računalniškimi modeli testirali biofizikalne lastnosti. Rezultati kažejo, da 6 različnih zaporedji shRNA ima maksimalno raven izražanja in pravilnega zvitja, 1 pa ima najmanjšo. Iz tega so zaključili da same razlike v zaporedju vplivajo na proizvodnjo, razgradnjo in zvitje; kjer je glavna determinanta kopičenja shRNA njena stabilnost [1].		V 1. fazi so z računalniškim orodjem GenScript siRNA Target Finder našli ustrezna specifična tarčna zaporedja na genomu virusa DWV. Predstavljeno je 10 potencialnih shRNA variant, ki so jim nadalje z matematičnimi in računalniškimi modeli testirali biofizikalne lastnosti. Rezultati kažejo, da 6 različnih zaporedji shRNA ima maksimalno raven izražanja in pravilnega zvitja, 1 pa ima najmanjšo. Iz tega so zaključili da same razlike v zaporedju vplivajo na proizvodnjo, razgradnjo in zvitje; kjer je glavna determinanta kopičenja shRNA njena stabilnost [1].

	Po sintezi shRNA, v 2. fazi so računalniško testirali njeno molekularno procesiranje v funkcionalno siRNA. Divji tip kvasovk ne vsebuje encima Dicer, ki reže lasnično zanko na shRNA, pri čem nastane siRNA. Zato so se v tej fazi mogli odločiti, če bi delo nadaljevali tako, da bi uvedli zapis za Dicer v ''S. cerevisae'' ali bodo spremenili kvasovke tako, da izražajo samo shRNA, kjer bi procesiranje v siRNA potekalo v celicah čebel. Z analizo so odkrili, da so z uvedbo encima Dicer iz sorodne kvasovke ''S. castellii'' uspešno dosegli zadovoljivo raven izražanja encima Dicer in tako večino sintetizirane shRNA pretvorili v siRNA [1].		Po sintezi shRNA, v 2. fazi so računalniško testirali njeno molekularno procesiranje v funkcionalno siRNA. Divji tip kvasovk ne vsebuje encima Dicer, ki reže lasnično zanko na shRNA, pri čem nastane siRNA. Zato so se v tej fazi mogli odločiti, če bi delo nadaljevali tako, da bi uvedli zapis za Dicer v ''S. cerevisae'' ali bodo spremenili kvasovke tako, da izražajo samo shRNA, kjer bi procesiranje v siRNA potekalo v celicah čebel. Z analizo so odkrili, da so z uvedbo encima Dicer iz sorodne kvasovke ''S. castellii'' uspešno dosegli zadovoljivo raven izražanja encima Dicer in tako večino sintetizirane shRNA pretvorili v siRNA [1].

	Ker je namen narediti kvasovke, ki izražajo specifično siRNA, ki bi potem dali čebelam kot prehranski dodatek z namenom preventivne zaščite čebel proti okužbi z virusom DWV, so v 3. fazi razvili model in testirali, če je siRNA dovolj stabilna v prebavnem sistemu čebel in sposobnost celic, da sprejemajo siRNA. V literaturi je omenjeno da sta za absorbcijo siRNA v insektih pomembni Sid-u podobni proteini in od klatrina-povzročena endocitoza [8]. Ker mehanizmi niso v celoti znani, modele so pripravili na osnovi kinetičnih konstanti iz literature [9]. Simulacija kaže, da se privzem siRNA zgodi hitro (vrh prevzema je približno pri 25 min.) in nakazuje, da je potrebna kontinuirna dostava siRNA, da bi se ohranila ustrezno visoka koncentracija siRNA. Iz modelov, najbolji med kandidati so lahko dosegli koncentracijo 8 nM v celicah, medtem da so najbolj nestabilni kandidati lahko dosegli koncentracijo 2 nM [1].		Ker je namen narediti kvasovke, ki izražajo specifično siRNA, ki bi potem dali čebelam kot prehranski dodatek z namenom preventivne zaščite čebel proti okužbi z virusom DWV, so v 3. fazi razvili model in testirali, če je siRNA dovolj stabilna v prebavnem sistemu čebel in sposobnost celic, da sprejemajo siRNA. V literaturi je omenjeno da sta za absorbcijo siRNA v insektih pomembni Sid-u podobni proteini in od klatrina-povzročena endocitoza [8]. Ker mehanizmi niso v celoti znani, modele so pripravili na osnovi kinetičnih konstanti iz literature [9]. Simulacija kaže, da se privzem siRNA zgodi hitro (vrh prevzema je približno pri 25 min.) in nakazuje, da je potrebna kontinuirna dostava siRNA, da bi se ohranila ustrezno visoka koncentracija siRNA. Iz modelov, najbolji med kandidati so lahko dosegli koncentracijo 8 nM v celicah, medtem da so najbolj nestabilni kandidati lahko dosegli koncentracijo 2 nM [1].

	V 4. fazi modeliranja so združili razpoložljive informacije z modelom, ki opisuje razgradnjo siRNA. Tako so ocenili aktivno koncentracij siRNA in Argonauta za učinkovit boj proti okužbi z DWV. Rezultati testov nakazujejo, da se pri 2 nM siRNA večina DWV RNA razgradi v nekaj minutah [1].		V 4. fazi modeliranja so združili razpoložljive informacije z modelom, ki opisuje razgradnjo siRNA. Tako so ocenili aktivno koncentracij siRNA in Argonauta za učinkovit boj proti okužbi z DWV. Rezultati testov nakazujejo, da se pri 2 nM siRNA večina DWV RNA razgradi v nekaj minutah [1].

Matejam3270 at 10:21, 5 April 2024

2024-04-05T10:21:11Z

← Older revision		Revision as of 10:21, 5 April 2024
Line 1:		Line 1:
	Estonijska podiplomska (postgraduate) ekipa EstoniaTUIT je leta 2023 na iGEM tekmovanju s projektom BeeYeast osvojila glavno nagrado v svoji skupini. Njihov projekt je dostopen na povezavi: https://2023.igem.wiki/estonia-tuit/home		Estonijska podiplomska (postgraduate) ekipa EstoniaTUIT je leta 2023 na iGEM tekmovanju s projektom BeeYeast osvojila glavno nagrado v svoji skupini. Njihov projekt je dostopen na povezavi: https://2023.igem.wiki/estonia-tuit/home

	Avtor povzetka: Mateja Milošević		Avtor povzetka: Mateja Milošević

← Older revision		Revision as of 10:23, 5 April 2024
Line 19:		Line 19:
	== Načrtovanje in ''in silico'' testi==		== Načrtovanje in ''in silico'' testi==
	Zaradi optimizacije dela, projekt je strateški načrtovan v 4 faze:		Zaradi optimizacije dela, projekt je strateški načrtovan v 4 faze:

	1. Proizvodnja shRNA v kvasovkah		1. Proizvodnja shRNA v kvasovkah

	2. Procesiranje shRNA v kvasovkah s proteinom Dicer		2. Procesiranje shRNA v kvasovkah s proteinom Dicer

	3. Dostava siRNA v celicah čebel		3. Dostava siRNA v celicah čebel

	4. Aktivna iRNA v čebelah		4. Aktivna iRNA v čebelah

	Modeliranje proizvodnje shRNA v kvasovkah je bilo ključno za optimizacijo različnih vidikov procesa, kot je: izbira promotorja za ekspresijo shRNA in proteina Dicer, učinkovita koncentracija, uspešnost zvitja shRNA in njena stabilnost [1].		Modeliranje proizvodnje shRNA v kvasovkah je bilo ključno za optimizacijo različnih vidikov procesa, kot je: izbira promotorja za ekspresijo shRNA in proteina Dicer, učinkovita koncentracija, uspešnost zvitja shRNA in njena stabilnost [1].
	V tej fazi projekta so se fokusirali najti odgovore na naslednje izzive:		V tej fazi projekta so se fokusirali najti odgovore na naslednje izzive:
Line 28:		Line 33:
	- Kolika je stabilnost konstrukta? Če konstrukt ostane učinkovit in aktiven in vivo v čebelah?		- Kolika je stabilnost konstrukta? Če konstrukt ostane učinkovit in aktiven in vivo v čebelah?

	V 1. fazi so z računalniškim orodjem GenScript siRNA Target Finder našli ustrezna specifična tarčna zaporedja na genomu virusa DWV. Predstavljeno je 10 potencialnih shRNA variant, ki so jim nadalje z matematičnimi in računalniškimi modeli testirali biofizikalne lastnosti. Rezultati kažejo, da 6 različnih zaporedji shRNA ima maksimalno raven izražanja in pravilnega zvitja, 1 pa ima najmanjšo. Iz tega so zaključili da same razlike v zaporedju vplivajo na proizvodnjo, razgradnjo in zvitje; kjer je glavna determinanta kopičenja shRNA njena stabilnost [1].		V '''1.''' fazi so z računalniškim orodjem GenScript siRNA Target Finder našli ustrezna specifična tarčna zaporedja na genomu virusa DWV. Predstavljeno je 10 potencialnih shRNA variant, ki so jim nadalje z matematičnimi in računalniškimi modeli testirali biofizikalne lastnosti. Rezultati kažejo, da 6 različnih zaporedji shRNA ima maksimalno raven izražanja in pravilnega zvitja, 1 pa ima najmanjšo. Iz tega so zaključili da same razlike v zaporedju vplivajo na proizvodnjo, razgradnjo in zvitje; kjer je glavna determinanta kopičenja shRNA njena stabilnost [1].

	Po sintezi shRNA, v 2. fazi so računalniško testirali njeno molekularno procesiranje v funkcionalno siRNA. Divji tip kvasovk ne vsebuje encima Dicer, ki reže lasnično zanko na shRNA, pri čem nastane siRNA. Zato so se v tej fazi mogli odločiti, če bi delo nadaljevali tako, da bi uvedli zapis za Dicer v ''S. cerevisae'' ali bodo spremenili kvasovke tako, da izražajo samo shRNA, kjer bi procesiranje v siRNA potekalo v celicah čebel. Z analizo so odkrili, da so z uvedbo encima Dicer iz sorodne kvasovke ''S. castellii'' uspešno dosegli zadovoljivo raven izražanja encima Dicer in tako večino sintetizirane shRNA pretvorili v siRNA [1].		Po sintezi shRNA, v '''2.''' fazi so računalniško testirali njeno molekularno procesiranje v funkcionalno siRNA. Divji tip kvasovk ne vsebuje encima Dicer, ki reže lasnično zanko na shRNA, pri čem nastane siRNA. Zato so se v tej fazi mogli odločiti, če bi delo nadaljevali tako, da bi uvedli zapis za Dicer v ''S. cerevisae'' ali bodo spremenili kvasovke tako, da izražajo samo shRNA, kjer bi procesiranje v siRNA potekalo v celicah čebel. Z analizo so odkrili, da so z uvedbo encima Dicer iz sorodne kvasovke ''S. castellii'' uspešno dosegli zadovoljivo raven izražanja encima Dicer in tako večino sintetizirane shRNA pretvorili v siRNA [1].

	Ker je namen narediti kvasovke, ki izražajo specifično siRNA, ki bi potem dali čebelam kot prehranski dodatek z namenom preventivne zaščite čebel proti okužbi z virusom DWV, so v 3. fazi razvili model in testirali, če je siRNA dovolj stabilna v prebavnem sistemu čebel in sposobnost celic, da sprejemajo siRNA. V literaturi je omenjeno da sta za absorbcijo siRNA v insektih pomembni Sid-u podobni proteini in od klatrina-povzročena endocitoza [8]. Ker mehanizmi niso v celoti znani, modele so pripravili na osnovi kinetičnih konstanti iz literature [9]. Simulacija kaže, da se privzem siRNA zgodi hitro (vrh prevzema je približno pri 25 min.) in nakazuje, da je potrebna kontinuirna dostava siRNA, da bi se ohranila ustrezno visoka koncentracija siRNA. Iz modelov, najbolji med kandidati so lahko dosegli koncentracijo 8 nM v celicah, medtem da so najbolj nestabilni kandidati lahko dosegli koncentracijo 2 nM [1].		Ker je namen narediti kvasovke, ki izražajo specifično siRNA, ki bi potem dali čebelam kot prehranski dodatek z namenom preventivne zaščite čebel proti okužbi z virusom DWV, so v '''3.''' fazi razvili model in testirali, če je siRNA dovolj stabilna v prebavnem sistemu čebel in sposobnost celic, da sprejemajo siRNA. V literaturi je omenjeno da sta za absorbcijo siRNA v insektih pomembni Sid-u podobni proteini in od klatrina-povzročena endocitoza [8]. Ker mehanizmi niso v celoti znani, modele so pripravili na osnovi kinetičnih konstanti iz literature [9]. Simulacija kaže, da se privzem siRNA zgodi hitro (vrh prevzema je približno pri 25 min.) in nakazuje, da je potrebna kontinuirna dostava siRNA, da bi se ohranila ustrezno visoka koncentracija siRNA. Iz modelov, najbolji med kandidati so lahko dosegli koncentracijo 8 nM v celicah, medtem da so najbolj nestabilni kandidati lahko dosegli koncentracijo 2 nM [1].

	V 4. fazi modeliranja so združili razpoložljive informacije z modelom, ki opisuje razgradnjo siRNA. Tako so ocenili aktivno koncentracij siRNA in Argonauta za učinkovit boj proti okužbi z DWV. Rezultati testov nakazujejo, da se pri 2 nM siRNA večina DWV RNA razgradi v nekaj minutah [1].		V '''4.''' fazi modeliranja so združili razpoložljive informacije z modelom, ki opisuje razgradnjo siRNA. Tako so ocenili aktivno koncentracij siRNA in Argonauta za učinkovit boj proti okužbi z DWV. Rezultati testov nakazujejo, da se pri 2 nM siRNA večina DWV RNA razgradi v nekaj minutah [1].

	== Sestavljanje konstruktov ==		== Sestavljanje konstruktov ==