Biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode - Revision history

Ursic Tadej: /* Izboljšava MAN */

2023-05-14T21:40:58Z

Izboljšava MAN

← Older revision		Revision as of 21:40, 14 May 2023
Line 40:		Line 40:
	===Izboljšava MAN===		===Izboljšava MAN===

	Celice ki so bile transformirane s pET28a-SpyCatcher-PCS (oz. iscA), so gojili do OD600 = 0,6 – 0,8, nato so dodali IPTG (končna koncentracija 0,75 mM). Po 20 h indukcije so celice lizirali in ta lizat dodali v gojišče za celice transformirane s pET22b-csgA-SpyTag. S TEM so pokazali so da prisotnost SpyTag ne vpliva na sestavljanje MAN. Pokazali so tudi, pride do stabilne povezave med csgA-SpyTag in SpyCatcher-PCS(iscA).		Celice ''E. coli'', ki so bile transformirane s pET28a-SpyCatcher-PCS (oz. iscA), so gojili do OD600 = 0,6 – 0,8, nato so dodali IPTG (končna koncentracija 0,75 mM). Po 20 h indukcije so celice lizirali in ta lizat dodali v gojišče za celice transformirane s pET22b-csgA-SpyTag. S TEM so pokazali so da prisotnost SpyTag ne vpliva na sestavljanje MAN. Pokazali so tudi, pride do stabilne povezave med csgA-SpyTag in SpyCatcher-PCS(iscA).

	Sposobnost adsorpcije so najprej preverili za Pb ione z začetno koncentracijo 1mg/L. Po 6 h je bila adsorpcija za kombinacijo MAN-iscA 10 % (podobno kot kontrola), medtem ko je bila za kombinacijo MAN-PCS 90 %. To je pokazalo, da je za odstranjevanje težkih kovin uporabna kombinacija MAN in PCS. S to kombinacijo so ponovili tudi eksperiment za vpliv pH in ugotovili da je optimum med pH 5 in 7.		Sposobnost adsorpcije so najprej preverili za Pb ione z začetno koncentracijo 1mg/L. Po 6 h je bila adsorpcija za kombinacijo MAN-iscA 10 % (podobno kot kontrola), medtem ko je bila za kombinacijo MAN-PCS 90 %. To je pokazalo, da je za odstranjevanje težkih kovin uporabna kombinacija MAN in PCS. S to kombinacijo so ponovili tudi eksperiment za vpliv pH in ugotovili da je optimum med pH 5 in 7.

Ursic Tadej: /* Indukcija izražanja csgA in sestavljanje MAN */

2023-05-14T21:40:21Z

Indukcija izražanja csgA in sestavljanje MAN

← Older revision		Revision as of 21:40, 14 May 2023
Line 28:		Line 28:
	===Indukcija izražanja csgA in sestavljanje MAN===		===Indukcija izražanja csgA in sestavljanje MAN===

	Celice so gojili v gojišču YES-CA . Izražanje csgA so sprožili z dodatkom IPTG (končna koncentracija 0,5 mM). Raven izražanje so spremljali preko barvanja z barvilom Congo rdeče na intervalu 48 – 72 h po indukciji. Za kontrolo so uporabili E. coli B21 [DE3] transformirane s praznim pET22b vektorjem. Maksimalno raven izražanja so opazili 72 h po indukciji. Rezultat indukcije so preverili tudi s presevnim elektronskim mikroskopom, kjer so opazovali morfologijo amiloidnih struktur zunaj celic. Za rekombinantni sev so pokazali večjo rast amiloidnih vlaken, kar je pomenilo da jim je uspelo pripraviti celice, ki so v povečani meri izražale csgA [2].		Celice ''E. coli'' transformirane s pET22b-csgA so gojili v gojišču YES-CA . Izražanje csgA so sprožili z dodatkom IPTG (končna koncentracija 0,5 mM). Raven izražanje so spremljali preko barvanja z barvilom Congo rdeče na intervalu 48 – 72 h po indukciji. Za kontrolo so uporabili E. coli B21 [DE3] transformirane s praznim pET22b vektorjem. Maksimalno raven izražanja so opazili 72 h po indukciji. Rezultat indukcije so preverili tudi s presevnim elektronskim mikroskopom, kjer so opazovali morfologijo amiloidnih struktur zunaj celic. Za rekombinantni sev so pokazali večjo rast amiloidnih vlaken, kar je pomenilo da jim je uspelo pripraviti celice, ki so v povečani meri izražale csgA [2].

	===Sposobnost adsorpcije Pb na MAN===		===Sposobnost adsorpcije Pb na MAN===

Ursic Tadej: /* Zaključek */

2023-05-14T21:39:20Z

Zaključek

← Older revision		Revision as of 21:39, 14 May 2023
Line 56:		Line 56:
	==Zaključek==		==Zaključek==

	V tej študiji so pripravili samo-sestavljajoča mikrobna amiloidna nanovlakna, ki so bila sposobna vezave težkih kovin pri koncentraciji 50 mg/L. Pripravili so tudi pripravili fuzijo teh MAN s proteinom PCS, ki je omogočala adsorpcijo v nižjih koncentracijah težkih kovin. Na koncu pa so pripravili biohibridno membrano s temi izboljšanimi MAN, ki je bila sposobna adsorpcije težkih kovin pri nizkih koncentracijah in je bila hkrati robustna in omogočala večkratno uporabo.		V tej študiji so pripravili samo-sestavljajoča mikrobna amiloidna nanovlakna, ki so bila sposobna vezave težkih kovin pri koncentraciji 50 mg/L. Pripravili so tudi pripravili fuzijo teh MAN s proteinom PCS, ki je omogočala adsorpcijo v nižjih koncentracijah težkih kovin. Na koncu pa so pripravili biohibridno membrano s temi izboljšanimi MAN, ki je bila sposobna adsorpcije težkih kovin pri nizkih koncentracijah in je bila hkrati robustna in omogočala večkratno uporabo. Taka membrana predstavlja potencialno uporabnost pri odstranjevanju težkih kovin iz industrijsko onesnaženih vod.

	==Viri==		==Viri==

Ursic Tadej: /* Biohibridna membrana */

2023-05-14T21:38:12Z

Biohibridna membrana

← Older revision		Revision as of 21:38, 14 May 2023
Line 50:		Line 50:
	Adsorpcijske sposobnosti biohibridne membrane so preverjali pri koncentraciji težkih kovin (Pb, Cu in Cd) 1 mg/L. Adsorpcija je bila po 6 h za Cd 98,7 %, za Pb 95,33 % in za Cu 85,67 %.		Adsorpcijske sposobnosti biohibridne membrane so preverjali pri koncentraciji težkih kovin (Pb, Cu in Cd) 1 mg/L. Adsorpcija je bila po 6 h za Cd 98,7 %, za Pb 95,33 % in za Cu 85,67 %.

	Ker lahko v realnih vzorcih pride do interferenc z drugimi komponentami so izvedli še poskus s simulirano odpadno vodo, v katero so dodali težke kovine do koncentracij 1 mg/L. ~~Sosobnost adsopcije~~ Cd je bila še vedno nad 90 %, za Cu in Pb pa je bila nad 80 %. Kar kaže na ~~dobor~~ robustnost te membrane.		Ker lahko v realnih vzorcih pride do interferenc z drugimi komponentami so izvedli še poskus s simulirano odpadno vodo, v katero so dodali težke kovine do koncentracij 1 mg/L. Sposobnost adsorpcije Cd je bila še vedno nad 90 %, za Cu in Pb pa je bila nad 80 %. Kar kaže na dobro robustnost te membrane.

	Testirali so tudi sposobnost večkratne uporabe te membrane. Rezultati so pokazali da je po 8 uporabah sposobnost adsorpcije Cd in Pb nad 80 % in Cu 75 % [2].		Testirali so tudi sposobnost večkratne uporabe te membrane. Rezultati so pokazali, da je po 8 uporabah sposobnost adsorpcije Cd in Pb nad 80 % in Cu 75 %, kar kaže da je ta membrana primerna za večkratno uporabo [2].

	==Zaključek==		==Zaključek==

Ursic Tadej: /* Biohibridna membrana */

2023-05-14T21:37:06Z

Biohibridna membrana

← Older revision		Revision as of 21:37, 14 May 2023
Line 48:		Line 48:
	===Biohibridna membrana===		===Biohibridna membrana===

	Adsorpcijske sposobnosti so preverjali pri koncentraciji težkih kovin (Pb, Cu in Cd) 1 mg/L. Adsorpcija je bila po 6 h za Cd 98,7 %, za Pb 95,33 % in za Cu 85,67 %.		Adsorpcijske sposobnosti biohibridne membrane so preverjali pri koncentraciji težkih kovin (Pb, Cu in Cd) 1 mg/L. Adsorpcija je bila po 6 h za Cd 98,7 %, za Pb 95,33 % in za Cu 85,67 %.

	Ker lahko v realnih vzorcih pride do interferenc z drugimi komponentami so izvedli še poskus s simulirano odpadno vodo, v katero so dodali težke kovine do koncentracij 1 mg/L. Sosobnost adsopcije Cd je bila še vedno nad 90 %, za Cu in Pb pa je bila nad 80 %. Kar kaže na dobor robustnost te membrane.		Ker lahko v realnih vzorcih pride do interferenc z drugimi komponentami so izvedli še poskus s simulirano odpadno vodo, v katero so dodali težke kovine do koncentracij 1 mg/L. Sosobnost adsopcije Cd je bila še vedno nad 90 %, za Cu in Pb pa je bila nad 80 %. Kar kaže na dobor robustnost te membrane.

	Testirali so tudi sposobnost večkratne uporabe te membrane. Rezultati so pokazali da je po 8 uporabah sposobnost adsorpcije Cd in Pb nad 80 % in Cu 75 %		Testirali so tudi sposobnost večkratne uporabe te membrane. Rezultati so pokazali da je po 8 uporabah sposobnost adsorpcije Cd in Pb nad 80 % in Cu 75 % [2].

	==Zaključek==		==Zaključek==

Ursic Tadej: /* Izboljšava MAN */

2023-05-14T21:36:22Z

Izboljšava MAN

← Older revision		Revision as of 21:36, 14 May 2023
Line 42:		Line 42:
	Celice ki so bile transformirane s pET28a-SpyCatcher-PCS (oz. iscA), so gojili do OD600 = 0,6 – 0,8, nato so dodali IPTG (končna koncentracija 0,75 mM). Po 20 h indukcije so celice lizirali in ta lizat dodali v gojišče za celice transformirane s pET22b-csgA-SpyTag. S TEM so pokazali so da prisotnost SpyTag ne vpliva na sestavljanje MAN. Pokazali so tudi, pride do stabilne povezave med csgA-SpyTag in SpyCatcher-PCS(iscA).		Celice ki so bile transformirane s pET28a-SpyCatcher-PCS (oz. iscA), so gojili do OD600 = 0,6 – 0,8, nato so dodali IPTG (končna koncentracija 0,75 mM). Po 20 h indukcije so celice lizirali in ta lizat dodali v gojišče za celice transformirane s pET22b-csgA-SpyTag. S TEM so pokazali so da prisotnost SpyTag ne vpliva na sestavljanje MAN. Pokazali so tudi, pride do stabilne povezave med csgA-SpyTag in SpyCatcher-PCS(iscA).

	Sposobnost adsorpcije so najprej preverili za Pb ione z začetno koncentracijo. Po 6 h je bila adsorpcija za kombinacijo MAN-iscA 10 % (podobno kot kontrola), ~~medetem~~ ko je bila za kombinacijo MAN-PCS 90 %. To je pokazalo da je za odstranjevanje težkih kovin ~~upporabna~~ kombinacija MAN in PCS. S to kombinacijo so ponovili tudi eksperiment za vpliv pH in ugotovili da je optimum med pH 5 in 7.		Sposobnost adsorpcije so najprej preverili za Pb ione z začetno koncentracijo 1mg/L. Po 6 h je bila adsorpcija za kombinacijo MAN-iscA 10 % (podobno kot kontrola), medtem ko je bila za kombinacijo MAN-PCS 90 %. To je pokazalo, da je za odstranjevanje težkih kovin uporabna kombinacija MAN in PCS. S to kombinacijo so ponovili tudi eksperiment za vpliv pH in ugotovili da je optimum med pH 5 in 7.

	Nato so preverili ~~adsorpcijseke~~ sposobnosti MAN-PCS za ione bakra, kadmija in svinca pri različnih začetnih koncentracijah težkih kovin, in sicer 0,8 mg/L, 1 mg/L in 1,2 mg/L. Najboljši rezultati so bili za Cd ione kjer so dobili 91,85 % adsorpcijo. Na splošno pa so je bila sposobnost adsorpcije pri sevih s kombinacijo MAN-PCS boljša v primerjavi s kontrolo.		Nato so preverili adsorpcijske sposobnosti MAN-PCS za ione bakra, kadmija in svinca pri različnih začetnih koncentracijah težkih kovin, in sicer 0,8 mg/L, 1 mg/L in 1,2 mg/L. Najboljši rezultati so bili za Cd ione kjer so dobili 91,85 % adsorpcijo. Na splošno pa so je bila sposobnost adsorpcije pri sevih s kombinacijo MAN-PCS boljša v primerjavi s kontrolo [2].

	===Biohibridna membrana===		===Biohibridna membrana===

Ursic Tadej at 21:34, 14 May 2023

2023-05-14T21:34:29Z

← Older revision		Revision as of 21:34, 14 May 2023
Line 10:		Line 10:
	===Mikrobna amiloidna vlakna (MAN)===		===Mikrobna amiloidna vlakna (MAN)===

	Amiloidne fibrile navadno povezujemo z nevrodegenerativnimi boleznimi, kot so Parkinsonova in Alzheimerjeva bolezen, ampak te fibrile najdemo tudi v vlogah, ki so koristne organizmom. Tako imenovane funkcionalne amiloide najdemo pri človeku, glivah, še posebej pa so pogosti pri bakterijah. Tam nastopajo kot strukturni element biofilmov in so zaslužni za togost in adhezivne lastnosti. Protein ki tvori amiloidne fibrile pri ''E. coli'' se imenuje ''curli''. Ta tvori omrežje prepletenih fibril, ki obdajajo celice in tvori nekakšno membrano ki ščiti celice pred eksogenimi polutanti.		Amiloidne fibrile navadno povezujemo z nevrodegenerativnimi boleznimi, kot so Parkinsonova in Alzheimerjeva bolezen, ampak te fibrile najdemo tudi v vlogah, ki so koristne organizmom. Tako imenovane funkcionalne amiloide najdemo pri človeku, glivah, še posebej pa so pogosti pri bakterijah. Tam nastopajo kot strukturni element biofilmov in so zaslužni za togost in adhezivne lastnosti. Protein ki tvori amiloidne fibrile pri ''E. coli'' se imenuje ''curli''. Ta tvori omrežje prepletenih fibril, ki obdajajo celice in tvori nekakšno membrano ki ščiti celice pred eksogenimi polutanti[2,3].

	Za biosintezo ''curli'' vlaken so potrebni proteini zapisani na operonih csgBAC in csgDEFG. CsgA predstavlja največji strukturni element teh fibril, medtem ko csgB sodeluje pri nukleaciji samih fibril. CsgC, csgE in csgF so šaperoni, csgG pa tvori proteinski kanal na zunanji membrani bakterije. Za tvorbo MAN so v tej raziskavi pripravili bakterije ''E. coli'', v katere so vstavili vezje, s katerim so lahko regulirali izražanje csgA gena. To so naredili tako, da so v plazmid pET22b vstavili zapis za csgA (ta je bil pod kontrolo lac operatorja) in z njim transformirali sev ''E. coli'' B21 [DE3]. Tako so z dodatkom IPTG lahko dboili celice ki so v povišani meri proizvajale csgA.		Za biosintezo ''curli'' vlaken so potrebni proteini zapisani na operonih csgBAC in csgDEFG. CsgA predstavlja največji strukturni element teh fibril, medtem ko csgB sodeluje pri nukleaciji samih fibril. CsgC, csgE in csgF so šaperoni, csgG pa tvori proteinski kanal na zunanji membrani bakterije. Za tvorbo MAN so v tej raziskavi pripravili bakterije ''E. coli'', v katere so vstavili vezje, s katerim so lahko regulirali izražanje csgA gena. To so naredili tako, da so v plazmid pET22b vstavili zapis za csgA (ta je bil pod kontrolo lac operatorja) in z njim transformirali sev ''E. coli'' B21 [DE3]. Tako so z dodatkom IPTG lahko dboili celice ki so v povišani meri proizvajale csgA [2].

	===Izboljšava MAN===		===Izboljšava MAN===

	Za izboljšanje adsorbcije težkih kovin na MAN, so nanje vezali dodatne proteine, ki so sposobni vezave težkih kovin. v tej študiji so se odoločili da preizkusijo dva taka proteina, in sicer PCS in iscA. PCS oz. fitokelatin sintaza je protein, ki ga najdemo v rastlinah in glivah. Njegova naloga je, da v prisotnosti težkih kovin začne sintetizirati fitokelatine. To so polimeri glutationa, ki so sposobni kelirati ione težkih kovin. Protein iscA (Iron-Sulfur Cluster Assembly) ima v celici več vlog, med drugim ima sposobnost vezave ionov železa. Pokazano pa je tudi bilo da ima sposobnost vezave ionov nekaterih težkih kovin [1,3].		Za izboljšanje adsorbcije težkih kovin na MAN, so nanje vezali dodatne proteine, ki so sposobni vezave težkih kovin. v tej študiji so se odoločili da preizkusijo dva taka proteina, in sicer PCS in iscA. PCS oz. fitokelatin sintaza je protein, ki ga najdemo v rastlinah in glivah. Njegova naloga je, da v prisotnosti težkih kovin začne sintetizirati fitokelatine. To so polimeri glutationa, ki so sposobni kelirati ione težkih kovin. Protein iscA (Iron-Sulfur Cluster Assembly) ima v celici več vlog, med drugim ima sposobnost vezave ionov železa. Pokazano pa je tudi bilo da ima sposobnost vezave ionov nekaterih težkih kovin [2,4].

	Za vezavo teh dveh proteinov na MAN, so uporabili sistem SpyTag – SpyCatcher. Ta sistem deluje tako, da SpyTag, ki je 13 aminokislin dolg peptid, spontano tvori izopeptidno vez s svojim partenrjem SpyCatcher. Na C konec csgA so dodali SpyTag (pripravili so plazmid pET22b-csgA-SpyTag in z njim transformirali E. coli B21 [DE3]). SpyCatcher pa so pripeli na N konec proteinov PCS in iscA. Ta dva konstrukt so vstavili v vektor pET28a. S tema rekombinantnima vektorjema (pET28a-SpyCatcher-PCS in pET28a-SpyCatcher-iscA) so transformirali ''E. coli''B21 [DE3]. S kombinacijo produktov teh dveh sevov so dobili celice, ki so izražale MAN, ki je imel gor pripete PCS ali iscA in tako boljše sposobnosti vezave težkih kovin [1].		Za vezavo teh dveh proteinov na MAN, so uporabili sistem SpyTag – SpyCatcher. Ta sistem deluje tako, da SpyTag, ki je 13 aminokislin dolg peptid, spontano tvori izopeptidno vez s svojim partenrjem SpyCatcher. Na C konec csgA so dodali SpyTag (pripravili so plazmid pET22b-csgA-SpyTag in z njim transformirali E. coli B21 [DE3]). SpyCatcher pa so pripeli na N konec proteinov PCS in iscA. Ta dva konstrukt so vstavili v vektor pET28a. S tema rekombinantnima vektorjema (pET28a-SpyCatcher-PCS in pET28a-SpyCatcher-iscA) so transformirali ''E. coli''B21 [DE3]. S kombinacijo produktov teh dveh sevov so dobili celice, ki so izražale MAN, ki je imel gor pripete PCS ali iscA in tako boljše sposobnosti vezave težkih kovin [2].

	===Biohibridne membrane===		===Biohibridne membrane===

	Same celice E. coli obdane z MAN so uspešne pri vezavi težkih kovin, ampak so za uporabo nepraktične. To so raziskovalci rešili tako da so jim dodali aktivno oglje. To mešanico so vakuumsko filtrirali da so dobili 0,22 μm adsorpcijski film na celulozni membrani. ~~Tako~~ so ~~dobili končne~~ biohibridne ~~membrane~~.		Same celice E. coli obdane z MAN so uspešne pri vezavi težkih kovin, ampak so za uporabo nepraktične. To so raziskovalci rešili tako, da so jim dodali aktivno oglje. To mešanico so vakuumsko filtrirali da so dobili 0,22 μm adsorpcijski film na celulozni membrani. Na ta način so naredili biohibridne mebrane, ki so bile končni izdelek te raziskave [2].

	==Rezultati==		==Rezultati==
Line 28:		Line 28:
	===Indukcija izražanja csgA in sestavljanje MAN===		===Indukcija izražanja csgA in sestavljanje MAN===

	Celice so gojili v YES-CA ~~gojišču~~. Izražanje csgA so sprožili z dodatkom IPTG (končna koncentracija 0,5 mM). Raven izražanje so spremljali preko barvanja z barvilom Congo rdeče na intervalu 48 – 72 h po indukciji. Za kontrolo so uporabili E. coli B21 [DE3] transformirane s praznim pET22b vektorjem. Maksimalno raven izražanja so opazili 72 h po indukciji. Rezultat indukcije so preverili tudi s presevnim elektronskim mikroskopom, kjer so opazovali morfologijo amiloidnih struktur zunaj celic. Za rekombinantni sev so pokazali večjo rast amiloidnih vlaken, kar je pomenilo da jim je uspelo pripraviti celice, ki so v povečani meri izražale csgA.		Celice so gojili v gojišču YES-CA . Izražanje csgA so sprožili z dodatkom IPTG (končna koncentracija 0,5 mM). Raven izražanje so spremljali preko barvanja z barvilom Congo rdeče na intervalu 48 – 72 h po indukciji. Za kontrolo so uporabili E. coli B21 [DE3] transformirane s praznim pET22b vektorjem. Maksimalno raven izražanja so opazili 72 h po indukciji. Rezultat indukcije so preverili tudi s presevnim elektronskim mikroskopom, kjer so opazovali morfologijo amiloidnih struktur zunaj celic. Za rekombinantni sev so pokazali večjo rast amiloidnih vlaken, kar je pomenilo da jim je uspelo pripraviti celice, ki so v povečani meri izražale csgA [2].

	===Sposobnost adsorpcije Pb na MAN===		===Sposobnost adsorpcije Pb na MAN===
Line 36:		Line 36:
	Preverjali so tudi vpliv pH na adsorpcijo. Raven adsorpcije se je z višanjem pH povečevala in imela maksimum pri pH = 6, na kar se je začela zniževati. Razlog je da pri nižjih vrednostih pH pride do tekmovanja za vezavo na MAN med protoni in ioni Pb. Tako so določili da je optimalen pH za odstranjevanje Pb ionov med 5 in 7.		Preverjali so tudi vpliv pH na adsorpcijo. Raven adsorpcije se je z višanjem pH povečevala in imela maksimum pri pH = 6, na kar se je začela zniževati. Razlog je da pri nižjih vrednostih pH pride do tekmovanja za vezavo na MAN med protoni in ioni Pb. Tako so določili da je optimalen pH za odstranjevanje Pb ionov med 5 in 7.

	Vpliv začetne koncentracije Pb ionov na adsorpcijo so preverjjali s koncentracijami od 100 mg/L do 1 mg/L. Sposobnost adsorpcije je z nižanjem začetne koncentracije najprej naraščala, nato pa je začela padati. Najboljša adsorpcija je bila pri začetni koncentracij 50 mg/L, kjer je bila 98,26%. Pri koncentracij 1 mg/L pa je bila sposobnost adsorpcije seva, ki je povečano izražal csgA skoraj enaka kontroli (okrog 10 %). Kar kaže, da so bili sevi ki povišano izražajo csgA neobčutljivi na nizke koncentracije težkih kovin.		Vpliv začetne koncentracije Pb ionov na adsorpcijo so preverjjali s koncentracijami od 100 mg/L do 1 mg/L. Sposobnost adsorpcije je z nižanjem začetne koncentracije najprej naraščala, nato pa je začela padati. Najboljša adsorpcija je bila pri začetni koncentracij 50 mg/L, kjer je bila 98,26%. Pri koncentracij 1 mg/L pa je bila sposobnost adsorpcije seva, ki je povečano izražal csgA, skoraj enaka kontroli (okrog 10 %). Kar kaže, da so bili sevi, ki povišano izražajo csgA neobčutljivi na nizke koncentracije težkih kovin [2].

	===Izboljšava MAN===		===Izboljšava MAN===

Ursic Tadej: /* Izboljšava MAN */

2023-05-14T21:29:28Z

Izboljšava MAN

← Older revision		Revision as of 21:29, 14 May 2023
Line 16:		Line 16:
	===Izboljšava MAN===		===Izboljšava MAN===

	Za izboljšanje adsorbcije težkih kovin na MAN, so ~~tem dodali~~ proteine ki so sposobni vezave težkih kovin. ~~Fitokelatini (PCs, PhytoChelatins)~~ so ~~oligomeri gluttiona~~, ~~ki jih sintetizira~~ fitokelatin sintaza ~~(PCS~~, ~~PhytoChelatin Synthase), kot odgovor na prisotnost težkih kovin. Najdemo jih~~ v rastlinah in glivah. ~~Njihova~~ naloga je, da ~~zunaj celice kelirajo~~ ione težkih kovin ~~in jim tako preprečijo vstop v celico~~. ~~Poleg fitokelatinov pa je bilo pokazano, da~~ iscA (Iron-Sulfur Cluster Assembly) ~~protein lahko veže~~ tudi ~~nekatere težke kovine~~.		Za izboljšanje adsorbcije težkih kovin na MAN, so nanje vezali dodatne proteine, ki so sposobni vezave težkih kovin. v tej študiji so se odoločili da preizkusijo dva taka proteina, in sicer PCS in iscA. PCS oz. fitokelatin sintaza je protein, ki ga najdemo v rastlinah in glivah. Njegova naloga je, da v prisotnosti težkih kovin začne sintetizirati fitokelatine. To so polimeri glutationa, ki so sposobni kelirati ione težkih kovin. Protein iscA (Iron-Sulfur Cluster Assembly) ima v celici več vlog, med drugim ima sposobnost vezave ionov železa. Pokazano pa je tudi bilo da ima sposobnost vezave ionov nekaterih težkih kovin [1,3].

	Za vezavo teh dveh proteinov na MAN, so uporabili sistem SpyTag – SpyCatcher. Ta sistem deluje tako, da SpyTag, ki je 13 aminokislin dolg peptid, spontano tvori izopeptidno vez s svojim partenrjem SpyCatcher. Na C konec csgA so dodali SpyTag (pripravili so plazmid pET22b-csgA-SpyTag in z njim transformirali E. coli B21 [DE3]). ~~Za kombinacijo~~ SpyCatcher in ~~PCS oziroma~~ iscA pa so ~~uporabili drug~~ vektor~~, in sicer~~ pET28a~~, pripravili so rekombinantna vektorja~~ pET28a-SpyCatcher-PCS in pET28a-SpyCatcher-iscA ~~ter z njima~~ transformirali E. coli B21 [DE3]. S kombinacijo sevov so dobili ~~membrano iz~~ MAN, ki ~~imajo vezana proteina~~ PCS in ~~iscA~~.		Za vezavo teh dveh proteinov na MAN, so uporabili sistem SpyTag – SpyCatcher. Ta sistem deluje tako, da SpyTag, ki je 13 aminokislin dolg peptid, spontano tvori izopeptidno vez s svojim partenrjem SpyCatcher. Na C konec csgA so dodali SpyTag (pripravili so plazmid pET22b-csgA-SpyTag in z njim transformirali E. coli B21 [DE3]). SpyCatcher pa so pripeli na N konec proteinov PCS in iscA. Ta dva konstrukt so vstavili v vektor pET28a. S tema rekombinantnima vektorjema (pET28a-SpyCatcher-PCS in pET28a-SpyCatcher-iscA) so transformirali ''E. coli''B21 [DE3]. S kombinacijo produktov teh dveh sevov so dobili celice, ki so izražale MAN, ki je imel gor pripete PCS ali iscA in tako boljše sposobnosti vezave težkih kovin [1].

	===Biohibridne membrane===		===Biohibridne membrane===

Ursic Tadej: /* Mikrobna amiloidna vlakna (MAN) */

2023-05-14T21:16:37Z

Mikrobna amiloidna vlakna (MAN)

← Older revision		Revision as of 21:16, 14 May 2023
Line 10:		Line 10:
	===Mikrobna amiloidna vlakna (MAN)===		===Mikrobna amiloidna vlakna (MAN)===

	Amiloidne fibrile navadno povezujemo z nevrodegenerativnimi boleznimi, kot so Parkinsonova in Alzheimerjeva bolezen~~. Vendar~~ te ~~z β-strukturami bogate~~ fibrile najdemo tudi v vlogah, ki so koristne organizmom. Tako imenovane funkcionalne amiloide najdemo pri človeku, glivah, še posebej pa so pogosti pri bakterijah. Tam nastopajo kot strukturni element biofilmov in so zaslužni za togost in adhezivne lastnosti ~~teh struktur~~. Protein ki tvori amiloidne fibrile pri E. coli se imenuje curli. Ta tvori omrežje prepletenih fibril, ki obdajajo celice in tvori nekakšno membrano ki ščiti celice pred eksogenimi polutanti.		Amiloidne fibrile navadno povezujemo z nevrodegenerativnimi boleznimi, kot so Parkinsonova in Alzheimerjeva bolezen, ampak te fibrile najdemo tudi v vlogah, ki so koristne organizmom. Tako imenovane funkcionalne amiloide najdemo pri človeku, glivah, še posebej pa so pogosti pri bakterijah. Tam nastopajo kot strukturni element biofilmov in so zaslužni za togost in adhezivne lastnosti. Protein ki tvori amiloidne fibrile pri ''E. coli'' se imenuje ''curli''. Ta tvori omrežje prepletenih fibril, ki obdajajo celice in tvori nekakšno membrano ki ščiti celice pred eksogenimi polutanti.

	Za biosintezo curli vlaken so potrebni proteini zapisani na operonih csgBAC in csgDEFG. CsgA predstavlja največji strukturni element teh fibril, medtem ko csgB sodeluje pri ~~nzkleaciji~~ samih fibril. CsgC, csgE in csgF so šaperoni in csgG pa tvori proteinski kanal na zunanji membrani bakterije. Za tvorbo MAN so v tej raziskavi pripravili bakterije E. coli, v katere so vstavili vezje, s katerim so lahko regulirali izražanje csgA gena. To so naredili tako da so v plazmid pET22b vstavili zapis za csgA (ta je bil pod kontrolo lac operatorja) in z njim transformirali sev E. coli B21 [DE3]. Z dodatkom IPTG so v ~~kulturi teh celic lahko inducirali tvorbo MAN~~.		Za biosintezo ''curli'' vlaken so potrebni proteini zapisani na operonih csgBAC in csgDEFG. CsgA predstavlja največji strukturni element teh fibril, medtem ko csgB sodeluje pri nukleaciji samih fibril. CsgC, csgE in csgF so šaperoni, csgG pa tvori proteinski kanal na zunanji membrani bakterije. Za tvorbo MAN so v tej raziskavi pripravili bakterije ''E. coli'', v katere so vstavili vezje, s katerim so lahko regulirali izražanje csgA gena. To so naredili tako, da so v plazmid pET22b vstavili zapis za csgA (ta je bil pod kontrolo lac operatorja) in z njim transformirali sev ''E. coli'' B21 [DE3]. Tako so z dodatkom IPTG lahko dboili celice ki so v povišani meri proizvajale csgA.

	===Izboljšava MAN===		===Izboljšava MAN===

Ursic Tadej: /* Uvod */

2023-05-14T21:12:31Z

Uvod

← Older revision		Revision as of 21:12, 14 May 2023
Line 2:		Line 2:

	==Uvod==		==Uvod==
	Onesnaženje s težkimi kovinami je problem s katerim se spopadamo na svetovni ravni~~, še zlasti pri državah v razvoju~~. Dejavnosti, kot so rudarjenje in taljenje rude, razne industrije (plastika, galvanizacija, tekstil, elektronka, …), kmetijstvo in odlaganje odpadkov (blato čistilnih naprav, izlužki iz deponij, kovinski odpadki, …), pripomorejo k izločanju težkih kovin v okolje. Težke kovine, kot so na primer Cu, Pb, Cd, Hg, Cr (VI), As …; se za razliko od organskih snovi ne razgrajujejo, temveč se v okolju akumulirajo. Poleg tega so to pogosto neesencialni elementi ~~za organizme~~ in lahko povzročajo resne zdravstvene težave [1,2].		Onesnaženje s težkimi kovinami je problem s katerim se spopadamo na svetovni ravni. Dejavnosti, kot so rudarjenje in taljenje rude, razne industrije (plastika, galvanizacija, tekstil, elektronka, …), kmetijstvo in odlaganje odpadkov (blato čistilnih naprav, izlužki iz deponij, kovinski odpadki, …), pripomorejo k izločanju težkih kovin v okolje. Težke kovine, kot so na primer Cu, Pb, Cd, Hg, Cr (VI), As …; se za razliko od organskih snovi ne razgrajujejo, temveč se v okolju akumulirajo. Poleg tega so to pogosto za organizme neesencialni elementi in lahko povzročajo resne zdravstvene težave [1,2].

	V vodi se težke kovine sicer akumulirajo v nižjih koncentracijah (manj kot 1 mg/L), vendar še vedno predstavljajo nevarnost za okolje in človeško zdravje. Uveljavljene metode za odstranjevanje težkih kovin so: ionska izmenjava, membranska filtracija, precipitacijske metode in elektrokemijske tehnike. Precipitacija omogoča 99 % odstranjenje težkih kovin, ampak povzroča sekundarno onesnaževanje vode. Elektrokemijske metode in ionska izmenjava sta učinkovita načina odstranjevanja težkih kovin, vendar potrebujeta drago opremo in veliko energije. Membranska filtracija predstavlja dobro alternativo tem tehnikam, vendar ima kot vse ostale uveljavljene tehnike pomanjkljivost, ~~in sicer~~ ni uspešna pri odstranjevanju težkih kovin v nizkih koncentracijah. V tem članku so za ta namen so iz mikrobnih amiloidnih nanovlaken (MAN, Microbila Amyloid Nanofibers), ki so sposobni vezave težkih kovin, pripravili biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode [2].		V vodi se težke kovine sicer akumulirajo v nižjih koncentracijah (manj kot 1 mg/L), vendar še vedno predstavljajo nevarnost za okolje in človeško zdravje. Uveljavljene metode za odstranjevanje težkih kovin so: ionska izmenjava, membranska filtracija, precipitacijske metode in elektrokemijske tehnike. Precipitacija omogoča 99 % odstranjenje težkih kovin, ampak povzroča sekundarno onesnaževanje vode. Elektrokemijske metode in ionska izmenjava sta učinkovita načina odstranjevanja težkih kovin, vendar potrebujeta drago opremo in veliko energije. Membranska filtracija sicer predstavlja dobro alternativo tem tehnikam, vendar ima kot vse ostale uveljavljene tehnike pomanjkljivost, saj ni uspešna pri odstranjevanju težkih kovin v nizkih koncentracijah. V tem članku so za ta namen so iz mikrobnih amiloidnih nanovlaken (MAN, Microbila Amyloid Nanofibers), ki so sposobni vezave težkih kovin, pripravili biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode [2].

	==Priprava biohibridnih membran==		==Priprava biohibridnih membran==