Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty - Revision history

Neža Peternel: /* Prednosti in slabosti uporabe SB sistemov */

2022-05-02T19:56:50Z

Prednosti in slabosti uporabe SB sistemov

← Older revision		Revision as of 19:56, 2 May 2022
Line 42:		Line 42:
	===Prednosti in slabosti uporabe SB sistemov===		===Prednosti in slabosti uporabe SB sistemov===

	Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo ~~določene transkripte~~, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distribucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.		Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo nivo transkripcije, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distribucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

	==VIRI==		==VIRI==

Neža Peternel: /* Izrezovanje Sleeping beauty transpozona */

2022-05-02T18:47:59Z

Izrezovanje Sleeping beauty transpozona

← Older revision		Revision as of 18:47, 2 May 2022
Line 20:		Line 20:
	===Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona===		===Izrezovanje ''Sleeping beauty'' transpozona===

	Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze~~, kar privede do proste~~ 3'-OH ~~skupine~~. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.		Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze s prosto 3'-OH skupino. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

	===Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona===		===Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona===

Neža Peternel at 10:06, 2 May 2022

2022-05-02T10:06:55Z

← Older revision		Revision as of 10:06, 2 May 2022
Line 40:		Line 40:
	''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost) kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejo. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij. Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.		''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost) kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejo. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij. Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

	===Prednosti in slabosti uporabe SB===		===Prednosti in slabosti uporabe SB sistemov===

	Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distribucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.		Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distribucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

Neža Peternel at 10:06, 2 May 2022

2022-05-02T10:06:04Z

← Older revision		Revision as of 10:06, 2 May 2022
Line 38:		Line 38:
	===Primeri biotehnološke uporabe===		===Primeri biotehnološke uporabe===

	"Sleeping beauty" transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost) kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejo. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij. Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.		''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost) kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejo. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij. Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

	===Prednosti in slabosti uporabe SB===		===Prednosti in slabosti uporabe SB===

Nuša Kos Thaler at 09:36, 2 May 2022

2022-05-02T09:36:20Z

← Older revision		Revision as of 09:36, 2 May 2022
Line 30:		Line 30:
	===Vstavljanje SB transpozona===		===Vstavljanje SB transpozona===

	Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na ~~prvailno~~ zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.		Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. ''Sleeping beauty'' transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na pravilno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

	===Optimizacija metod uporabe SB===		===Optimizacija metod uporabe SB===

Neža Peternel at 09:19, 2 May 2022

2022-05-02T09:19:03Z

← Older revision		Revision as of 09:19, 2 May 2022
Line 24:		Line 24:
	===Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona===		===Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona===

	Prosti 3'-OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.		Prosti 3'-OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

	==BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA==		==BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA==
Line 38:		Line 38:
	===Primeri biotehnološke uporabe===		===Primeri biotehnološke uporabe===

	''Sleeping beauty'' transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost), kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na ~~živinorejske~~. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.		"Sleeping beauty" transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost) kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejo. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij. Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

	===Prednosti in slabosti uporabe SB===		===Prednosti in slabosti uporabe SB===

	Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna ~~distirbucija~~ po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.		Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo določene transkripte, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distribucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

	==VIRI==		==VIRI==

Neža Peternel at 09:16, 2 May 2022

2022-05-02T09:16:50Z

← Older revision		Revision as of 09:16, 2 May 2022
Line 24:		Line 24:
	===Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona===		===Integracija ''Sleeping beauty'' transpozona===

	Prosti 3' -OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.		Prosti 3'-OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar pa vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

	==BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA==		==BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA==

Nuša Kos Thaler at 08:39, 2 May 2022

2022-05-02T08:39:01Z

← Older revision		Revision as of 08:39, 2 May 2022
Line 12:		Line 12:
	=== Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA ===		=== Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA ===

	Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozaznega vezavnega mesta vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz ~~izraženih~~ iz drugih podobnih družin ~~v istem genomu~~ na ''Sleeping beauty'' transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.		Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozaznega vezavnega mesta vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz iz drugih podobnih družin na ''Sleeping beauty'' transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

	===Nastanek sinaptičnega kompleksa===		===Nastanek sinaptičnega kompleksa===

Nuša Kos Thaler at 08:32, 2 May 2022

2022-05-02T08:32:03Z

← Older revision		Revision as of 08:32, 2 May 2022
Line 12:		Line 12:
	=== Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA ===		=== Vezava ''Sleeping beauty'' transpozaze na DNA ===

	Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec ~~transpozazne vezavne domene~~ vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na ''Sleeping beauty'' transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.		Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozaznega vezavnega mesta vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz izraženih iz drugih podobnih družin v istem genomu na ''Sleeping beauty'' transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za ''Sleeping beauty'' transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

	===Nastanek sinaptičnega kompleksa===		===Nastanek sinaptičnega kompleksa===

Nuša Kos Thaler at 17:52, 1 May 2022

2022-05-01T17:52:37Z

← Older revision		Revision as of 17:52, 1 May 2022
Line 46:		Line 46:
	==VIRI==		==VIRI==

	-‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).		‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

	-M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.		M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

	-Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.		Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

	-‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion \| Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).		‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion \| Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

	-S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.		S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.