Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells & SCNT - Revision history

TjašaGoričan at 12:29, 4 December 2013

2013-12-04T12:29:57Z

← Older revision		Revision as of 12:29, 4 December 2013
Line 37:		Line 37:


	Da bi ugotovili, kateri prašiči so transgeni, so izolirali genomsko DNA iz repa in izvedli ~~kapilarni~~ prenos. 2 prašiča od 4 živorojenih kloniranih iz genetsko spremenjenih MSC sta bila transgena. Da pa bi ugotovili, v katerih organih se vstavljeni gen izraža, so po 1 letu pri izbranih tkivih izvedli RT-PCR. Nato so PCR produkte sekvencirali, da so potrdili, da gre za ta gen. Dokazali so, da je bil specifično izražen v žlezah slinavkah.		Da bi ugotovili, kateri prašiči so transgeni, so izolirali genomsko DNA iz repa in izvedli prenos Southern. 2 prašiča od 4 živorojenih kloniranih iz genetsko spremenjenih MSC sta bila transgena. Da pa bi ugotovili, v katerih organih se vstavljeni gen izraža, so po 1 letu pri izbranih tkivih izvedli RT-PCR. Nato so PCR produkte sekvencirali, da so potrdili, da gre za ta gen. Dokazali so, da je bil specifično izražen v žlezah slinavkah.

TjašaGoričan at 12:28, 4 December 2013

2013-12-04T12:28:04Z

← Older revision		Revision as of 12:28, 4 December 2013
Line 2:		Line 2:


	Metoda jedrnega prenosa t.i. somatic cell nuclear transfer (SCNT) je pogosto uporabljena tehnika za kloniranje prašičev. Slabost te metode je njena nizka učinkovitost (ok. 1-3%). Na učinkovitost vpliva tudi sposobnost reprogramiranja donorske celice do pluripotentne. Kot donorske celice večinoma uporabljajo končno diferencirane fibroblasti, ki se pogosto nepravilno reprogramirajo, kar je eden od vzrokov za tako nizko učinkovitost metode. Oocite lažje reprogramirajo genom nediferenciranih ali manj diferenciranih celic kot genom končno diferenciranih celic. Ker embrionalne matične celice (ESC) prašičev niso dostopne, se uporabljajo multipotentne mezenhimske matične celice (MSC). Avtorji članka Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Are an Attractive Donor Cell Type for Production of Cloned Pigs As Well As Genetically Modified Cloned Pigs by Somatic Cell Nuclear ~~Tranfer~~ Li in sod. so v raziskavi primerjali sposobnost razvoja kloniranih prašičjih embrijev, nastalih iz MSC ali fibroblastov, po implantaciji ''in vivo''.		Metoda jedrnega prenosa t.i. somatic cell nuclear transfer (SCNT) je pogosto uporabljena tehnika za kloniranje prašičev. Slabost te metode je njena nizka učinkovitost (ok. 1-3%). Na učinkovitost vpliva tudi sposobnost reprogramiranja donorske celice do pluripotentne. Kot donorske celice večinoma uporabljajo končno diferencirane fibroblasti, ki se pogosto nepravilno reprogramirajo, kar je eden od vzrokov za tako nizko učinkovitost metode. Oocite lažje reprogramirajo genom nediferenciranih ali manj diferenciranih celic kot genom končno diferenciranih celic. Ker embrionalne matične celice (ESC) prašičev niso dostopne, se uporabljajo multipotentne mezenhimske matične celice (MSC). Avtorji članka Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Are an Attractive Donor Cell Type for Production of Cloned Pigs As Well As Genetically Modified Cloned Pigs by Somatic Cell Nuclear Transfer Li in sod. so v raziskavi primerjali sposobnost razvoja kloniranih prašičjih embrijev, nastalih iz MSC ali fibroblastov, po implantaciji ''in vivo''.


Line 34:		Line 34:


	== ~~KAPILARNI~~ PRENOS IN RT-PCR ==		== PRENOS SOUTHERN IN RT-PCR ==


Line 48:		Line 48:
	'''Članek:'''		'''Članek:'''

	Li, Z., He, X., Chen, L., Shi, J., Zhou, R., Xu, W., Liu, D., Wu Z. (2013). Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Are an Attractive Donor Cell Type for Production of Cloned Pigs As Well As Genetically Modified Cloned Pigs by Somatic Cell Nuclear Transfer. Cellular Reprogramming. 15, 459-470.		Li, Z., He, X., Chen, L., Shi, J., Zhou, R., Xu, W., Liu, D., Wu, Z. (2013). Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Are an Attractive Donor Cell Type for Production of Cloned Pigs As Well As Genetically Modified Cloned Pigs by Somatic Cell Nuclear Transfer. Cellular Reprogramming. 15, 459-470.
	(http://online.liebertpub.com/doi/pdf/10.1089/cell.2013.0010)		(http://online.liebertpub.com/doi/pdf/10.1089/cell.2013.0010)

TjašaGoričan at 18:06, 2 December 2013

2013-12-02T18:06:56Z

← Older revision		Revision as of 18:06, 2 December 2013
Line 17:		Line 17:


	== ~~SEKVENCIRANJE~~ Z ~~BISULFITOM~~ ==
			== DOLOČANJE ZAPOREDJA Z UPORABO BISULFITA ==

TjašaGoričan at 11:26, 30 November 2013

2013-11-30T11:26:33Z

← Older revision		Revision as of 11:26, 30 November 2013
Line 2:		Line 2:


	Metoda jedrnega prenosa t.i. somatic cell nuclear transfer (SCNT) je pogosto uporabljena tehnika za kloniranje prašičev. Slabost te metode je njena nizka učinkovitost (ok. 1-3%). Na učinkovitost vpliva tudi sposobnost reprogramiranja donorske celice do pluripotentne. Kot donorske celice večinoma uporabljajo končno diferencirane fibroblasti, ki se pogosto nepravilno reprogramirajo, kar je eden od vzrokov za tako nizko učinkovitost metode. Oocite lažje reprogramirajo genom nediferenciranih ali manj diferenciranih celic kot genom končno diferenciranih celic. Ker embrionalne matične celice (ESC) prašičev niso dostopne, se uporabljajo multipotentne mezenhimske matične celice (MSC). Avtorji članka Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Are an Attractive Donor Cell Type for Production of Cloned Pigs As Well As Genetically Modified Cloned Pigs by Somatic Cell Nuclear Tranfer Li in sod. so v raziskavi primerjali sposobnost razvoja kloniranih prašičjih embrijev, nastalih iz MSC ali fibroblastov, po implantaciji in vivo.		Metoda jedrnega prenosa t.i. somatic cell nuclear transfer (SCNT) je pogosto uporabljena tehnika za kloniranje prašičev. Slabost te metode je njena nizka učinkovitost (ok. 1-3%). Na učinkovitost vpliva tudi sposobnost reprogramiranja donorske celice do pluripotentne. Kot donorske celice večinoma uporabljajo končno diferencirane fibroblasti, ki se pogosto nepravilno reprogramirajo, kar je eden od vzrokov za tako nizko učinkovitost metode. Oocite lažje reprogramirajo genom nediferenciranih ali manj diferenciranih celic kot genom končno diferenciranih celic. Ker embrionalne matične celice (ESC) prašičev niso dostopne, se uporabljajo multipotentne mezenhimske matične celice (MSC). Avtorji članka Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Are an Attractive Donor Cell Type for Production of Cloned Pigs As Well As Genetically Modified Cloned Pigs by Somatic Cell Nuclear Tranfer Li in sod. so v raziskavi primerjali sposobnost razvoja kloniranih prašičjih embrijev, nastalih iz MSC ali fibroblastov, po implantaciji ''in vivo''.


Line 26:		Line 26:


	Za kloniranje prašičev so uporabili metodo SCNT, pri čemer so izolirali oocite in jim odstranili prvo polarno telo in okoliško citoplazmo, posledično vse kromosome. Nato so fibroblasti ali MSC mikroinjicirali v oocite. Potem so kompleks oocita-donorska celica gojili in ga aktivirali z dvema pulzoma, pri čemer sta se citoplazmi teh dveh celic zlili (fuzija).		Za kloniranje prašičev so uporabili metodo SCNT, pri čemer so izolirali oocite in jim odstranili prvo polarno telo in okoliško citoplazmo, posledično vse kromosome. Nato so fibroblasti ali MSC mikroinjicirali v oocite. Potem so kompleks oocita-donorska celica gojili in ga aktivirali z dvema električnima pulzoma, pri čemer sta se citoplazmi teh dveh celic zlili (fuzija).

	Sledilo je gojenje nastalih embrijev, pri čemer so spremljali sposobnost njihovega razvoja in vitro. Po implantaciji pa so to spremljali in vivo. Šlo je za statistično značilno večje št. živorojenih kloniranih prašičev glede na št. prenesenih embrijev in posledično večjo učinkovitost kloniranja prašičev pri uporabi MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov.		Sledilo je gojenje nastalih embrijev, pri čemer so spremljali sposobnost njihovega razvoja ''in vitro''. Po implantaciji pa so to spremljali ''in vivo''. Šlo je za statistično značilno večje št. živorojenih kloniranih prašičev glede na št. prenesenih embrijev in posledično večjo učinkovitost kloniranja prašičev pri uporabi MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov.

	Podoben postopek so izvedli tudi z embriji, nastalimi iz genetsko modificiranih MSC.		Podoben postopek so izvedli tudi z embriji, nastalimi iz genetsko modificiranih MSC.

TjašaGoričan at 11:07, 30 November 2013

2013-11-30T11:07:27Z

← Older revision		Revision as of 11:07, 30 November 2013
Line 2:		Line 2:


	Metoda jedrnega prenosa t.i. somatic cell nuclear transfer (SCNT) je pogosto uporabljena tehnika za kloniranje prašičev. Slabost te metode je njena nizka učinkovitost (ok. 1-3%). Na učinkovitost vpliva tudi sposobnost reprogramiranja donorske celice do pluripotentne. Kot donorske celice večinoma uporabljajo končno diferencirane fibroblasti, ki se pogosto nepravilno reprogramirajo, kar je eden od vzrokov za tako nizko učinkovitost metode. Oocite lažje reprogramirajo genom nediferenciranih ali manj diferenciranih celic kot genom končno diferenciranih celic. Ker embrionalne matične celice (ESC) prašičev niso dostopne, se uporabljajo multipotentne mezenhimske matične celice (MSC). Avtorji članka Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Are an Attractive Donor Cell Type for Production of Cloned Pigs As Well As Genetically Modified Cloned Pigs by Somatic Cell Nuclear Tranfer Li in sod. so v raziskavi primerjali sposobnost razvoja kloniranih prašičjih embrijev, nastalih iz MSC in fibroblastov, po implantaciji in vivo.		Metoda jedrnega prenosa t.i. somatic cell nuclear transfer (SCNT) je pogosto uporabljena tehnika za kloniranje prašičev. Slabost te metode je njena nizka učinkovitost (ok. 1-3%). Na učinkovitost vpliva tudi sposobnost reprogramiranja donorske celice do pluripotentne. Kot donorske celice večinoma uporabljajo končno diferencirane fibroblasti, ki se pogosto nepravilno reprogramirajo, kar je eden od vzrokov za tako nizko učinkovitost metode. Oocite lažje reprogramirajo genom nediferenciranih ali manj diferenciranih celic kot genom končno diferenciranih celic. Ker embrionalne matične celice (ESC) prašičev niso dostopne, se uporabljajo multipotentne mezenhimske matične celice (MSC). Avtorji članka Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Are an Attractive Donor Cell Type for Production of Cloned Pigs As Well As Genetically Modified Cloned Pigs by Somatic Cell Nuclear Tranfer Li in sod. so v raziskavi primerjali sposobnost razvoja kloniranih prašičjih embrijev, nastalih iz MSC ali fibroblastov, po implantaciji in vivo.

TjašaGoričan at 23:32, 29 November 2013

2013-11-29T23:32:21Z

← Older revision		Revision as of 23:32, 29 November 2013
Line 2:		Line 2:


	Metoda jedrnega prenosa t.i. somatic cell nuclear transfer (SCNT) je pogosto uporabljena tehnika za kloniranje prašičev. Slabost te metode je njena nizka učinkovitost (ok. 1-3%). Na učinkovitost vpliva tudi sposobnost reprogramiranja donorske celice do pluripotentne. Kot donorske celice večinoma uporabljajo končno diferencirane fibroblasti, ki se pogosto nepravilno reprogramirajo, kar je eden od vzrokov za tako nizko učinkovitost metode. Oocite lažje reprogramirajo genom nediferenciranih ali manj diferenciranih celic kot genom končno diferenciranih celic. Ker embrionalne matične celice (ESC) prašičev niso dostopne, se uporabljajo multipotentne mezenhimske matične celice (MSC). Avtorji članka Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Are an Attractive Donor Cell Type for Production of Cloned Pigs As Well As Genetically Modified Cloned Pigs by Somatic Cell Nuclear Tranfer Li in sod. so v raziskavi primerjali sposobnost razvoja kloniranih embrijev, nastalih iz MSC in fibroblastov, po implantaciji in vivo.		Metoda jedrnega prenosa t.i. somatic cell nuclear transfer (SCNT) je pogosto uporabljena tehnika za kloniranje prašičev. Slabost te metode je njena nizka učinkovitost (ok. 1-3%). Na učinkovitost vpliva tudi sposobnost reprogramiranja donorske celice do pluripotentne. Kot donorske celice večinoma uporabljajo končno diferencirane fibroblasti, ki se pogosto nepravilno reprogramirajo, kar je eden od vzrokov za tako nizko učinkovitost metode. Oocite lažje reprogramirajo genom nediferenciranih ali manj diferenciranih celic kot genom končno diferenciranih celic. Ker embrionalne matične celice (ESC) prašičev niso dostopne, se uporabljajo multipotentne mezenhimske matične celice (MSC). Avtorji članka Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Are an Attractive Donor Cell Type for Production of Cloned Pigs As Well As Genetically Modified Cloned Pigs by Somatic Cell Nuclear Tranfer Li in sod. so v raziskavi primerjali sposobnost razvoja kloniranih prašičjih embrijev, nastalih iz MSC in fibroblastov, po implantaciji in vivo.


Line 8:		Line 8:


	MSC so izolirali iz kostnega mozga, fibroblasti pa iz uhlja. MSC so se v določenem gojišču uspele diferencirati v osteocite oz. adipocite, kar potrjuje, da so bile izolirane MSC multipotentne. Preko metode sortiranja celic s fluorescenčno aktivacijo (FACS) so analizirali, kateri označevalci so bili vezani na površino teh celic. S tem so potrdili, da so izolirali MSC.		MSC so izolirali iz kostnega mozga, fibroblasti pa iz uhlja prašiča. MSC so se v določenem gojišču uspele diferencirati v osteocite oz. adipocite, kar potrjuje, da so bile izolirane MSC multipotentne. Preko metode sortiranja celic s fluorescenčno aktivacijo (FACS) so analizirali, kateri označevalci so bili vezani na površino teh celic. S tem so potrdili, da so izolirali MSC.

TjašaGoričan at 23:19, 29 November 2013

2013-11-29T23:19:01Z

← Older revision		Revision as of 23:19, 29 November 2013
Line 27:		Line 27:

	Za kloniranje prašičev so uporabili metodo SCNT, pri čemer so izolirali oocite in jim odstranili prvo polarno telo in okoliško citoplazmo, posledično vse kromosome. Nato so fibroblasti ali MSC mikroinjicirali v oocite. Potem so kompleks oocita-donorska celica gojili in ga aktivirali z dvema pulzoma, pri čemer sta se citoplazmi teh dveh celic zlili (fuzija).		Za kloniranje prašičev so uporabili metodo SCNT, pri čemer so izolirali oocite in jim odstranili prvo polarno telo in okoliško citoplazmo, posledično vse kromosome. Nato so fibroblasti ali MSC mikroinjicirali v oocite. Potem so kompleks oocita-donorska celica gojili in ga aktivirali z dvema pulzoma, pri čemer sta se citoplazmi teh dveh celic zlili (fuzija).

	Sledilo je gojenje nastalih embrijev, pri čemer so spremljali sposobnost njihovega razvoja in vitro. Po implantaciji pa so to spremljali in vivo. Šlo je za statistično značilno večje št. živorojenih kloniranih prašičev glede na št. prenesenih embrijev in posledično večjo učinkovitost kloniranja prašičev pri uporabi MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov.		Sledilo je gojenje nastalih embrijev, pri čemer so spremljali sposobnost njihovega razvoja in vitro. Po implantaciji pa so to spremljali in vivo. Šlo je za statistično značilno večje št. živorojenih kloniranih prašičev glede na št. prenesenih embrijev in posledično večjo učinkovitost kloniranja prašičev pri uporabi MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov.

	Podoben postopek so izvedli tudi z embriji, nastalimi iz genetsko modificiranih MSC.		Podoben postopek so izvedli tudi z embriji, nastalimi iz genetsko modificiranih MSC.

TjašaGoričan at 23:17, 29 November 2013

2013-11-29T23:17:46Z

← Older revision		Revision as of 23:17, 29 November 2013
Line 1:		Line 1:
	UVOD		== UVOD ==


	Metoda jedrnega prenosa t.i. somatic cell nuclear transfer (SCNT) je pogosto uporabljena tehnika za kloniranje prašičev. Slabost te metode je njena nizka učinkovitost (ok. 1-3%). Na učinkovitost vpliva tudi sposobnost reprogramiranja donorske celice do pluripotentne. Kot donorske celice večinoma uporabljajo končno diferencirane fibroblasti, ki se pogosto nepravilno reprogramirajo, kar je eden od vzrokov za tako nizko učinkovitost metode. Oocite lažje reprogramirajo genom nediferenciranih ali manj diferenciranih celic kot genom končno diferenciranih celic. Ker embrionalne matične celice (ESC) prašičev niso dostopne, se uporabljajo multipotentne mezenhimske matične celice (MSC). Avtorji članka Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Are an Attractive Donor Cell Type for Production of Cloned Pigs As Well As Genetically Modified Cloned Pigs by Somatic Cell Nuclear Tranfer Li in sod. so v raziskavi primerjali sposobnost razvoja kloniranih embrijev, nastalih iz MSC in fibroblastov, po implantaciji in vivo.		Metoda jedrnega prenosa t.i. somatic cell nuclear transfer (SCNT) je pogosto uporabljena tehnika za kloniranje prašičev. Slabost te metode je njena nizka učinkovitost (ok. 1-3%). Na učinkovitost vpliva tudi sposobnost reprogramiranja donorske celice do pluripotentne. Kot donorske celice večinoma uporabljajo končno diferencirane fibroblasti, ki se pogosto nepravilno reprogramirajo, kar je eden od vzrokov za tako nizko učinkovitost metode. Oocite lažje reprogramirajo genom nediferenciranih ali manj diferenciranih celic kot genom končno diferenciranih celic. Ker embrionalne matične celice (ESC) prašičev niso dostopne, se uporabljajo multipotentne mezenhimske matične celice (MSC). Avtorji članka Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Are an Attractive Donor Cell Type for Production of Cloned Pigs As Well As Genetically Modified Cloned Pigs by Somatic Cell Nuclear Tranfer Li in sod. so v raziskavi primerjali sposobnost razvoja kloniranih embrijev, nastalih iz MSC in fibroblastov, po implantaciji in vivo.

	IZOLACIJA MSC IN FIBROBLASTOV, DIFERENCIACIJA MSC IN FACS
			== IZOLACIJA MSC IN FIBROBLASTOV, DIFERENCIACIJA MSC IN FACS ==


	MSC so izolirali iz kostnega mozga, fibroblasti pa iz uhlja. MSC so se v določenem gojišču uspele diferencirati v osteocite oz. adipocite, kar potrjuje, da so bile izolirane MSC multipotentne. Preko metode sortiranja celic s fluorescenčno aktivacijo (FACS) so analizirali, kateri označevalci so bili vezani na površino teh celic. S tem so potrdili, da so izolirali MSC.		MSC so izolirali iz kostnega mozga, fibroblasti pa iz uhlja. MSC so se v določenem gojišču uspele diferencirati v osteocite oz. adipocite, kar potrjuje, da so bile izolirane MSC multipotentne. Preko metode sortiranja celic s fluorescenčno aktivacijo (FACS) so analizirali, kateri označevalci so bili vezani na površino teh celic. S tem so potrdili, da so izolirali MSC.

	TRANSFEKCIJA MSC
			== TRANSFEKCIJA MSC ==


	Izvedli so transfekcijo MSC z lipofektaminom in lineariziranim plazmidom pPSP-xynB, ki je sestavljen iz gena za ksilanazo iz glive, katerega izražanje je uravnano s promotorjem, specifičnim za žleze slinavke, in iz selekcijskega markerja, ki omogoča odpornost proti G418 in je med dvema mestoma LoxP, kar omogoča, da se kasneje odstrani iz genoma transgenega prašiča. Po transfekciji so celice gojili v gojišču z G418 , pri čemer so se ohranile samo tiste MSC, ki so vsebovale vnešen plazmid. Za potrditev, da se je plazmid vgradil v genom, so MSC, odpornim na G418, izolirali genomsko DNA in s PCR pomnožili gen za ksilanazo. Nato so PCR produkt sekvencirali, da bi potrdili, da se je dobljeno nukleotidno zaporedje ujemalo s tistim od vstavljenega gena.		Izvedli so transfekcijo MSC z lipofektaminom in lineariziranim plazmidom pPSP-xynB, ki je sestavljen iz gena za ksilanazo iz glive, katerega izražanje je uravnano s promotorjem, specifičnim za žleze slinavke, in iz selekcijskega markerja, ki omogoča odpornost proti G418 in je med dvema mestoma LoxP, kar omogoča, da se kasneje odstrani iz genoma transgenega prašiča. Po transfekciji so celice gojili v gojišču z G418 , pri čemer so se ohranile samo tiste MSC, ki so vsebovale vnešen plazmid. Za potrditev, da se je plazmid vgradil v genom, so MSC, odpornim na G418, izolirali genomsko DNA in s PCR pomnožili gen za ksilanazo. Nato so PCR produkt sekvencirali, da bi potrdili, da se je dobljeno nukleotidno zaporedje ujemalo s tistim od vstavljenega gena.

	SEKVENCIRANJE Z BISULFITOM
			== SEKVENCIRANJE Z BISULFITOM ==


	Da bi primerjali vzorec metilacije imprintiranih genov, genov, ki vplivajo na pluripotentnost in ponavljajoče DNA v genomu MSC in fibroblastov, so genomsko DNA izolirali, nato denaturirali in obdelali z natrijevim bisulfitom, ki je pretvoril vse nemetilirane citozine v uracile. S PCR so pomnožili te dele genoma in jih sekvencirali. MSC in fibroblasti so se razlikovale v nivoju metilacije imprintiranih genov in ponavljajoče DNA.		Da bi primerjali vzorec metilacije imprintiranih genov, genov, ki vplivajo na pluripotentnost in ponavljajoče DNA v genomu MSC in fibroblastov, so genomsko DNA izolirali, nato denaturirali in obdelali z natrijevim bisulfitom, ki je pretvoril vse nemetilirane citozine v uracile. S PCR so pomnožili te dele genoma in jih sekvencirali. MSC in fibroblasti so se razlikovale v nivoju metilacije imprintiranih genov in ponavljajoče DNA.

	SCNT
			== SCNT ==


	Za kloniranje prašičev so uporabili metodo SCNT, pri čemer so izolirali oocite in jim odstranili prvo polarno telo in okoliško citoplazmo, posledično vse kromosome. Nato so fibroblasti ali MSC mikroinjicirali v oocite. Potem so kompleks oocita-donorska celica gojili in ga aktivirali z dvema pulzoma, pri čemer sta se citoplazmi teh dveh celic zlili (fuzija).		Za kloniranje prašičev so uporabili metodo SCNT, pri čemer so izolirali oocite in jim odstranili prvo polarno telo in okoliško citoplazmo, posledično vse kromosome. Nato so fibroblasti ali MSC mikroinjicirali v oocite. Potem so kompleks oocita-donorska celica gojili in ga aktivirali z dvema pulzoma, pri čemer sta se citoplazmi teh dveh celic zlili (fuzija).
Line 21:		Line 30:
	Podoben postopek so izvedli tudi z embriji, nastalimi iz genetsko modificiranih MSC.		Podoben postopek so izvedli tudi z embriji, nastalimi iz genetsko modificiranih MSC.

	KAPILARNI PRENOS IN RT-PCR
			== KAPILARNI PRENOS IN RT-PCR ==


	Da bi ugotovili, kateri prašiči so transgeni, so izolirali genomsko DNA iz repa in izvedli kapilarni prenos. 2 prašiča od 4 živorojenih kloniranih iz genetsko spremenjenih MSC sta bila transgena. Da pa bi ugotovili, v katerih organih se vstavljeni gen izraža, so po 1 letu pri izbranih tkivih izvedli RT-PCR. Nato so PCR produkte sekvencirali, da so potrdili, da gre za ta gen. Dokazali so, da je bil specifično izražen v žlezah slinavkah.		Da bi ugotovili, kateri prašiči so transgeni, so izolirali genomsko DNA iz repa in izvedli kapilarni prenos. 2 prašiča od 4 živorojenih kloniranih iz genetsko spremenjenih MSC sta bila transgena. Da pa bi ugotovili, v katerih organih se vstavljeni gen izraža, so po 1 letu pri izbranih tkivih izvedli RT-PCR. Nato so PCR produkte sekvencirali, da so potrdili, da gre za ta gen. Dokazali so, da je bil specifično izražen v žlezah slinavkah.

	ZAKLJUČEK
			== ZAKLJUČEK ==


	Glede na to, da je bilo št. celic v blastocisti statistično značilno večje v primeru uporabe MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov, in da se je nivo metilacije imprintiranih genov in ponavljajoče DNA razlikoval med MSC in fibroblastmi, so Li in sod. sklepali, da št. celic v blastocisti in vzorec metilacije v tem delu genoma pomembno vplivata na normalen razvoj embrija. Slednje je bilo v skladu z rezultati že narejenih raziskav. Dokazali so, da je večja učinkovitost kloniranja in vivo ob uporabi MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov in da se genetsko spremenjene MSC lahko uporabijo kot donorske celice pri SCNT za nastanek kloniranih transgenih prašičev.		Glede na to, da je bilo št. celic v blastocisti statistično značilno večje v primeru uporabe MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov, in da se je nivo metilacije imprintiranih genov in ponavljajoče DNA razlikoval med MSC in fibroblastmi, so Li in sod. sklepali, da št. celic v blastocisti in vzorec metilacije v tem delu genoma pomembno vplivata na normalen razvoj embrija. Slednje je bilo v skladu z rezultati že narejenih raziskav. Dokazali so, da je večja učinkovitost kloniranja in vivo ob uporabi MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov in da se genetsko spremenjene MSC lahko uporabijo kot donorske celice pri SCNT za nastanek kloniranih transgenih prašičev.


			'''Članek:'''

			Li, Z., He, X., Chen, L., Shi, J., Zhou, R., Xu, W., Liu, D., Wu Z. (2013). Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Are an Attractive Donor Cell Type for Production of Cloned Pigs As Well As Genetically Modified Cloned Pigs by Somatic Cell Nuclear Transfer. Cellular Reprogramming. 15, 459-470.
			(http://online.liebertpub.com/doi/pdf/10.1089/cell.2013.0010)

TjašaGoričan at 22:40, 29 November 2013

2013-11-29T22:40:22Z

← Older revision		Revision as of 22:40, 29 November 2013
Line 1:		Line 1:
	~~SCNT~~
	UVOD		UVOD

	Metoda jedrnega prenosa t.i. somatic cell nuclear transfer (SCNT) je pogosto uporabljena tehnika za kloniranje prašičev. Slabost te metode je njena nizka učinkovitost (ok. 1-3%). Na učinkovitost vpliva tudi sposobnost reprogramiranja donorske celice do pluripotentne. Kot donorske celice večinoma uporabljajo končno diferencirane fibroblasti, ki se pogosto nepravilno reprogramirajo, kar je eden od vzrokov za tako nizko učinkovitost metode. Oocite lažje reprogramirajo genom nediferenciranih ali manj diferenciranih celic kot genom končno diferenciranih celic. Ker embrionalne matične celice (ESC) prašičev niso dostopne, se uporabljajo multipotentne mezenhimske matične celice (MSC). Avtorji članka Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Are an Attractive Donor Cell Type for Production of Cloned Pigs As Well As Genetically Modified Cloned Pigs by Somatic Cell Nuclear Tranfer Li in sod. so v raziskavi primerjali sposobnost razvoja kloniranih embrijev, nastalih iz MSC in fibroblastov, po implantaciji in vivo.		Metoda jedrnega prenosa t.i. somatic cell nuclear transfer (SCNT) je pogosto uporabljena tehnika za kloniranje prašičev. Slabost te metode je njena nizka učinkovitost (ok. 1-3%). Na učinkovitost vpliva tudi sposobnost reprogramiranja donorske celice do pluripotentne. Kot donorske celice večinoma uporabljajo končno diferencirane fibroblasti, ki se pogosto nepravilno reprogramirajo, kar je eden od vzrokov za tako nizko učinkovitost metode. Oocite lažje reprogramirajo genom nediferenciranih ali manj diferenciranih celic kot genom končno diferenciranih celic. Ker embrionalne matične celice (ESC) prašičev niso dostopne, se uporabljajo multipotentne mezenhimske matične celice (MSC). Avtorji članka Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Are an Attractive Donor Cell Type for Production of Cloned Pigs As Well As Genetically Modified Cloned Pigs by Somatic Cell Nuclear Tranfer Li in sod. so v raziskavi primerjali sposobnost razvoja kloniranih embrijev, nastalih iz MSC in fibroblastov, po implantaciji in vivo.

	IZOLACIJA MSC IN FIBROBLASTOV, DIFERENCIACIJA MSC IN FACS		IZOLACIJA MSC IN FIBROBLASTOV, DIFERENCIACIJA MSC IN FACS

	MSC so izolirali iz kostnega mozga, fibroblasti pa iz uhlja. MSC so se v določenem gojišču uspele diferencirati v osteocite oz. adipocite, kar potrjuje, da so bile izolirane MSC multipotentne. Preko metode sortiranja celic s fluorescenčno aktivacijo (FACS) so analizirali, kateri označevalci so bili vezani na površino teh celic. S tem so potrdili, da so izolirali MSC.		MSC so izolirali iz kostnega mozga, fibroblasti pa iz uhlja. MSC so se v določenem gojišču uspele diferencirati v osteocite oz. adipocite, kar potrjuje, da so bile izolirane MSC multipotentne. Preko metode sortiranja celic s fluorescenčno aktivacijo (FACS) so analizirali, kateri označevalci so bili vezani na površino teh celic. S tem so potrdili, da so izolirali MSC.

	TRANSFEKCIJA MSC		TRANSFEKCIJA MSC

	Izvedli so transfekcijo MSC z lipofektaminom in lineariziranim plazmidom pPSP-xynB, ki je sestavljen iz gena za ksilanazo iz glive, katerega izražanje je uravnano s promotorjem, specifičnim za žleze slinavke, in iz selekcijskega markerja, ki omogoča odpornost proti G418 in je med dvema mestoma LoxP, kar omogoča, da se kasneje odstrani iz genoma transgenega prašiča. Po transfekciji so celice gojili v gojišču z G418 , pri čemer so se ohranile samo tiste MSC, ki so vsebovale vnešen plazmid. Za potrditev, da se je plazmid vgradil v genom, so MSC, odpornim na G418, izolirali genomsko DNA in s PCR pomnožili gen za ksilanazo. Nato so PCR produkt sekvencirali, da bi potrdili, da se je dobljeno nukleotidno zaporedje ujemalo s tistim od vstavljenega gena.		Izvedli so transfekcijo MSC z lipofektaminom in lineariziranim plazmidom pPSP-xynB, ki je sestavljen iz gena za ksilanazo iz glive, katerega izražanje je uravnano s promotorjem, specifičnim za žleze slinavke, in iz selekcijskega markerja, ki omogoča odpornost proti G418 in je med dvema mestoma LoxP, kar omogoča, da se kasneje odstrani iz genoma transgenega prašiča. Po transfekciji so celice gojili v gojišču z G418 , pri čemer so se ohranile samo tiste MSC, ki so vsebovale vnešen plazmid. Za potrditev, da se je plazmid vgradil v genom, so MSC, odpornim na G418, izolirali genomsko DNA in s PCR pomnožili gen za ksilanazo. Nato so PCR produkt sekvencirali, da bi potrdili, da se je dobljeno nukleotidno zaporedje ujemalo s tistim od vstavljenega gena.

	SEKVENCIRANJE Z BISULFITOM		SEKVENCIRANJE Z BISULFITOM

	Da bi primerjali vzorec metilacije imprintiranih genov, genov, ki vplivajo na pluripotentnost in ponavljajoče DNA v genomu MSC in fibroblastov, so genomsko DNA izolirali, nato denaturirali in obdelali z natrijevim bisulfitom, ki je pretvoril vse nemetilirane citozine v uracile. S PCR so pomnožili te dele genoma in jih sekvencirali. MSC in fibroblasti so se razlikovale v nivoju metilacije imprintiranih genov in ponavljajoče DNA.		Da bi primerjali vzorec metilacije imprintiranih genov, genov, ki vplivajo na pluripotentnost in ponavljajoče DNA v genomu MSC in fibroblastov, so genomsko DNA izolirali, nato denaturirali in obdelali z natrijevim bisulfitom, ki je pretvoril vse nemetilirane citozine v uracile. S PCR so pomnožili te dele genoma in jih sekvencirali. MSC in fibroblasti so se razlikovale v nivoju metilacije imprintiranih genov in ponavljajoče DNA.

	SCNT		SCNT

	Za kloniranje prašičev so uporabili metodo SCNT, pri čemer so izolirali oocite in jim odstranili prvo polarno telo in okoliško citoplazmo, posledično vse kromosome. Nato so fibroblasti ali MSC mikroinjicirali v oocite. Potem so kompleks oocita-donorska celica gojili in ga aktivirali z dvema pulzoma, pri čemer sta se citoplazmi teh dveh celic zlili (fuzija).		Za kloniranje prašičev so uporabili metodo SCNT, pri čemer so izolirali oocite in jim odstranili prvo polarno telo in okoliško citoplazmo, posledično vse kromosome. Nato so fibroblasti ali MSC mikroinjicirali v oocite. Potem so kompleks oocita-donorska celica gojili in ga aktivirali z dvema pulzoma, pri čemer sta se citoplazmi teh dveh celic zlili (fuzija).
	Sledilo je gojenje nastalih embrijev, pri čemer so spremljali sposobnost njihovega razvoja in vitro. Po implantaciji pa so to spremljali in vivo. Šlo je za statistično značilno večje št. živorojenih kloniranih prašičev glede na št. prenesenih embrijev in posledično večjo učinkovitost kloniranja prašičev pri uporabi MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov.		Sledilo je gojenje nastalih embrijev, pri čemer so spremljali sposobnost njihovega razvoja in vitro. Po implantaciji pa so to spremljali in vivo. Šlo je za statistično značilno večje št. živorojenih kloniranih prašičev glede na št. prenesenih embrijev in posledično večjo učinkovitost kloniranja prašičev pri uporabi MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov.
	Podoben postopek so izvedli tudi z embriji, nastalimi iz genetsko modificiranih MSC.		Podoben postopek so izvedli tudi z embriji, nastalimi iz genetsko modificiranih MSC.

	KAPILARNI PRENOS IN RT-PCR		KAPILARNI PRENOS IN RT-PCR

	Da bi ugotovili, kateri prašiči so transgeni, so izolirali genomsko DNA iz repa in izvedli kapilarni prenos. 2 prašiča od 4 živorojenih kloniranih iz genetsko spremenjenih MSC sta bila transgena. Da pa bi ugotovili, v katerih organih se vstavljeni gen izraža, so po 1 letu pri izbranih tkivih izvedli RT-PCR. Nato so PCR produkte sekvencirali, da so potrdili, da gre za ta gen. Dokazali so, da je bil specifično izražen v žlezah slinavkah.		Da bi ugotovili, kateri prašiči so transgeni, so izolirali genomsko DNA iz repa in izvedli kapilarni prenos. 2 prašiča od 4 živorojenih kloniranih iz genetsko spremenjenih MSC sta bila transgena. Da pa bi ugotovili, v katerih organih se vstavljeni gen izraža, so po 1 letu pri izbranih tkivih izvedli RT-PCR. Nato so PCR produkte sekvencirali, da so potrdili, da gre za ta gen. Dokazali so, da je bil specifično izražen v žlezah slinavkah.

	ZAKLJUČEK		ZAKLJUČEK

	Glede na to, da je bilo št. celic v blastocisti statistično značilno večje v primeru uporabe MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov, in da se je nivo metilacije imprintiranih genov in ponavljajoče DNA razlikoval med MSC in fibroblastmi, so Li in sod. sklepali, da št. celic v blastocisti in vzorec metilacije v tem delu genoma pomembno vplivata na normalen razvoj embrija. Slednje je bilo v skladu z rezultati že narejenih raziskav. Dokazali so, da je večja učinkovitost kloniranja in vivo ob uporabi MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov in da se genetsko spremenjene MSC lahko uporabijo kot donorske celice pri SCNT za nastanek kloniranih transgenih prašičev.		Glede na to, da je bilo št. celic v blastocisti statistično značilno večje v primeru uporabe MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov, in da se je nivo metilacije imprintiranih genov in ponavljajoče DNA razlikoval med MSC in fibroblastmi, so Li in sod. sklepali, da št. celic v blastocisti in vzorec metilacije v tem delu genoma pomembno vplivata na normalen razvoj embrija. Slednje je bilo v skladu z rezultati že narejenih raziskav. Dokazali so, da je večja učinkovitost kloniranja in vivo ob uporabi MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov in da se genetsko spremenjene MSC lahko uporabijo kot donorske celice pri SCNT za nastanek kloniranih transgenih prašičev.

TjašaGoričan: New page: SCNT UVOD Metoda jedrnega prenosa t.i. somatic cell nuclear transfer (SCNT) je pogosto uporabljena tehnika za kloniranje prašičev. Slabost te metode je njena nizka učinkovitost (ok. 1-3...

2013-11-29T22:34:06Z

New page: SCNT UVOD Metoda jedrnega prenosa t.i. somatic cell nuclear transfer (SCNT) je pogosto uporabljena tehnika za kloniranje prašičev. Slabost te metode je njena nizka učinkovitost (ok. 1-3...

New page

SCNT
UVOD
Metoda jedrnega prenosa t.i. somatic cell nuclear transfer (SCNT) je pogosto uporabljena tehnika za kloniranje prašičev. Slabost te metode je njena nizka učinkovitost (ok. 1-3%). Na učinkovitost vpliva tudi sposobnost reprogramiranja donorske celice do pluripotentne. Kot donorske celice večinoma uporabljajo končno diferencirane fibroblasti, ki se pogosto nepravilno reprogramirajo, kar je eden od vzrokov za tako nizko učinkovitost metode. Oocite lažje reprogramirajo genom nediferenciranih ali manj diferenciranih celic kot genom končno diferenciranih celic. Ker embrionalne matične celice (ESC) prašičev niso dostopne, se uporabljajo multipotentne mezenhimske matične celice (MSC). Avtorji članka Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Are an Attractive Donor Cell Type for Production of Cloned Pigs As Well As Genetically Modified Cloned Pigs by Somatic Cell Nuclear Tranfer Li in sod. so v raziskavi primerjali sposobnost razvoja kloniranih embrijev, nastalih iz MSC in fibroblastov, po implantaciji in vivo.
IZOLACIJA MSC IN FIBROBLASTOV, DIFERENCIACIJA MSC IN FACS
MSC so izolirali iz kostnega mozga, fibroblasti pa iz uhlja. MSC so se v določenem gojišču uspele diferencirati v osteocite oz. adipocite, kar potrjuje, da so bile izolirane MSC multipotentne. Preko metode sortiranja celic s fluorescenčno aktivacijo (FACS) so analizirali, kateri označevalci so bili vezani na površino teh celic. S tem so potrdili, da so izolirali MSC.
TRANSFEKCIJA MSC
Izvedli so transfekcijo MSC z lipofektaminom in lineariziranim plazmidom pPSP-xynB, ki je sestavljen iz gena za ksilanazo iz glive, katerega izražanje je uravnano s promotorjem, specifičnim za žleze slinavke, in iz selekcijskega markerja, ki omogoča odpornost proti G418 in je med dvema mestoma LoxP, kar omogoča, da se kasneje odstrani iz genoma transgenega prašiča. Po transfekciji so celice gojili v gojišču z G418 , pri čemer so se ohranile samo tiste MSC, ki so vsebovale vnešen plazmid. Za potrditev, da se je plazmid vgradil v genom, so MSC, odpornim na G418, izolirali genomsko DNA in s PCR pomnožili gen za ksilanazo. Nato so PCR produkt sekvencirali, da bi potrdili, da se je dobljeno nukleotidno zaporedje ujemalo s tistim od vstavljenega gena.
SEKVENCIRANJE Z BISULFITOM
Da bi primerjali vzorec metilacije imprintiranih genov, genov, ki vplivajo na pluripotentnost in ponavljajoče DNA v genomu MSC in fibroblastov, so genomsko DNA izolirali, nato denaturirali in obdelali z natrijevim bisulfitom, ki je pretvoril vse nemetilirane citozine v uracile. S PCR so pomnožili te dele genoma in jih sekvencirali. MSC in fibroblasti so se razlikovale v nivoju metilacije imprintiranih genov in ponavljajoče DNA.
SCNT
Za kloniranje prašičev so uporabili metodo SCNT, pri čemer so izolirali oocite in jim odstranili prvo polarno telo in okoliško citoplazmo, posledično vse kromosome. Nato so fibroblasti ali MSC mikroinjicirali v oocite. Potem so kompleks oocita-donorska celica gojili in ga aktivirali z dvema pulzoma, pri čemer sta se citoplazmi teh dveh celic zlili (fuzija).
Sledilo je gojenje nastalih embrijev, pri čemer so spremljali sposobnost njihovega razvoja in vitro. Po implantaciji pa so to spremljali in vivo. Šlo je za statistično značilno večje št. živorojenih kloniranih prašičev glede na št. prenesenih embrijev in posledično večjo učinkovitost kloniranja prašičev pri uporabi MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov.
Podoben postopek so izvedli tudi z embriji, nastalimi iz genetsko modificiranih MSC.
KAPILARNI PRENOS IN RT-PCR
Da bi ugotovili, kateri prašiči so transgeni, so izolirali genomsko DNA iz repa in izvedli kapilarni prenos. 2 prašiča od 4 živorojenih kloniranih iz genetsko spremenjenih MSC sta bila transgena. Da pa bi ugotovili, v katerih organih se vstavljeni gen izraža, so po 1 letu pri izbranih tkivih izvedli RT-PCR. Nato so PCR produkte sekvencirali, da so potrdili, da gre za ta gen. Dokazali so, da je bil specifično izražen v žlezah slinavkah.
ZAKLJUČEK
Glede na to, da je bilo št. celic v blastocisti statistično značilno večje v primeru uporabe MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov, in da se je nivo metilacije imprintiranih genov in ponavljajoče DNA razlikoval med MSC in fibroblastmi, so Li in sod. sklepali, da št. celic v blastocisti in vzorec metilacije v tem delu genoma pomembno vplivata na normalen razvoj embrija. Slednje je bilo v skladu z rezultati že narejenih raziskav. Dokazali so, da je večja učinkovitost kloniranja in vivo ob uporabi MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov in da se genetsko spremenjene MSC lahko uporabijo kot donorske celice pri SCNT za nastanek kloniranih transgenih prašičev.