CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA - Revision history

Luka Fink: /* Samomorilski mehanizem razlaga */

2025-04-15T13:33:48Z

Samomorilski mehanizem razlaga

← Older revision		Revision as of 13:33, 15 April 2025
Line 23:		Line 23:

	== Samomorilski mehanizem razlaga ==		== Samomorilski mehanizem razlaga ==
	Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišano koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen ''mCherry'' in ''tracrRNA''. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentraciji dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentraciji dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-~~mCherrz~~ in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.		Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišano koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen ''mCherry'' in ''tracrRNA''. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentraciji dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentraciji dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherry in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

	Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma, je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivi koncentraciji amonijevega klorida, kot virom dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so, da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.		Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma, je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivi koncentraciji amonijevega klorida, kot virom dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so, da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.

Luka Fink: /* Delecija phaC2 */

2025-04-15T13:05:50Z

Delecija phaC2

← Older revision		Revision as of 13:05, 15 April 2025
Line 10:		Line 10:
	Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembe v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA, nastajali pa bi še ostali stranski produkti. Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.		Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembe v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA, nastajali pa bi še ostali stranski produkti. Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.

	== Delecija phaC2 ==		== Delecija ''phaC2'' ==
	PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se, da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekurzor za sintezo PUFA.		PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se, da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekurzor za sintezo PUFA.

Luka Fink: /* Delecija PHB */

2025-04-15T13:05:38Z

Delecija PHB

← Older revision		Revision as of 13:05, 15 April 2025
Line 10:		Line 10:
	Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembe v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA, nastajali pa bi še ostali stranski produkti. Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.		Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembe v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA, nastajali pa bi še ostali stranski produkti. Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.

	== Delecija ~~PHB~~ ==		== Delecija phaC2 ==
	PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se, da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekurzor za sintezo PUFA.		PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se, da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekurzor za sintezo PUFA.

Luka Fink: /* Samomorilski mehanizem razlaga */

2025-04-15T09:53:30Z

Samomorilski mehanizem razlaga

← Older revision		Revision as of 09:53, 15 April 2025
Line 23:		Line 23:

	== Samomorilski mehanizem razlaga ==		== Samomorilski mehanizem razlaga ==
	Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s ~~povišno~~ koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani ~~koncentracij~~ dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani ~~koncentracij~~ dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.		Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišano koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen ''mCherry'' in ''tracrRNA''. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentraciji dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentraciji dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

			Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma, je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivi koncentraciji amonijevega klorida, kot virom dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so, da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.

	Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
	== Transport DHA in EPA v sojo ==		== Transport DHA in EPA v sojo ==
	Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.		Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
	== Viri in literatura ==		== Viri in literatura ==
	[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)		[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

Luka Fink: /* Regulacija in sinteza modula */

2025-04-15T09:50:22Z

Regulacija in sinteza modula

← Older revision		Revision as of 09:50, 15 April 2025
Line 18:		Line 18:
	Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.		Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

	Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se ~~nahaj~~ zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k ~~oddisocira~~ in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.		Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se nahaja zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je, da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisociira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

			Cilj regulacije je, da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja navzdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'', do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je ''nifH'' promotor sploh aktiven.

	Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'' do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
	== Samomorilski mehanizem razlaga ==		== Samomorilski mehanizem razlaga ==
	Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.		Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Luka Fink: /* Delecija PHB */

2025-04-15T09:46:35Z

Delecija PHB

← Older revision		Revision as of 09:46, 15 April 2025
Line 11:		Line 11:

	== Delecija PHB ==		== Delecija PHB ==
	PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot ~~prekursor~~ za sintezo PUFA.		PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se, da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekurzor za sintezo PUFA.

			Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so, da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili, da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.

	Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.
	== Regulacija in sinteza modula ==		== Regulacija in sinteza modula ==
	Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.		Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Luka Fink: /* Izvedba projekta */

2025-04-15T09:44:55Z

Izvedba projekta

← Older revision		Revision as of 09:44, 15 April 2025
Line 8:		Line 8:

	== Izvedba projekta ==		== Izvedba projekta ==
	Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembe v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA ~~ter hkrati~~ bi ~~nastajali~~ še ostali stranski produkti). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.		Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembe v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA, nastajali pa bi še ostali stranski produkti. Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.

	== Delecija PHB ==		== Delecija PHB ==

Luka Fink: /* Izvedba projekta */

2025-04-15T09:43:36Z

Izvedba projekta

← Older revision		Revision as of 09:43, 15 April 2025
Line 8:		Line 8:

	== Izvedba projekta ==		== Izvedba projekta ==
	Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na ~~spremembne~~ v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA ter hkrati bi nastajali še ostali stranski produkti). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.		Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembe v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA ter hkrati bi nastajali še ostali stranski produkti). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.

	== Delecija PHB ==		== Delecija PHB ==
	PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.		PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Luka Fink: /* UVOD */

2025-04-15T09:43:09Z

UVOD

← Older revision		Revision as of 09:43, 15 April 2025
Line 5:		Line 5:
	Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbiontske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.		Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbiontske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

	Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko ~~uporaljajo~~. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi ~~v zmanjšanje število~~ koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakovost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.		Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporabljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi do zmanjšanja števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakovost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.

	== Izvedba projekta ==		== Izvedba projekta ==

Luka Fink: /* UVOD */

2025-04-15T09:42:07Z

UVOD

← Older revision		Revision as of 09:42, 15 April 2025
Line 3:		Line 3:
	Človeštvo že dolgo časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na raznorazne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebej soje.		Človeštvo že dolgo časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na raznorazne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebej soje.

	Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo ~~simbionstske~~ bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.		Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbiontske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

	Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje število koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakovost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.		Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje število koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakovost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.