Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave - Revision history

Tina Arnšek at 06:09, 5 May 2020

2020-05-05T06:09:38Z

← Older revision		Revision as of 06:09, 5 May 2020
Line 71:		Line 71:

	Korndörfer, I. P., Kanitz, A., Danzer, J., Zimmer, M., Loessner, M. J., & Skerra, A. Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 64(6), 644–650 (2008).		Korndörfer, I. P., Kanitz, A., Danzer, J., Zimmer, M., Loessner, M. J., & Skerra, A. Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 64(6), 644–650 (2008).

	Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).		Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).

Tina Arnšek at 06:08, 5 May 2020

2020-05-05T06:08:38Z

← Older revision		Revision as of 06:08, 5 May 2020
Line 70:		Line 70:
	São-José, C. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. Antibiotics vol. 7 (2018).		São-José, C. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. Antibiotics vol. 7 (2018).

	Korndörfer, I. P., Kanitz, A., Danzer, J., Zimmer, M., Loessner, M. J., & Skerra, A~~. (2008)~~. Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 64(6), 644–650. ~~doi: 10.1107/s0907444908007890~~		Korndörfer, I. P., Kanitz, A., Danzer, J., Zimmer, M., Loessner, M. J., & Skerra, A. Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 64(6), 644–650 (2008).

	Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).		Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).

	Schmelcher, M., Donovan, D. M., & Loessner, M. J~~. (2012)~~. Bacteriophage endolysins as novel antimicrobials. Future Microbiology, 7(10), 1147–1171~~. doi: 10.2217/fmb.12.97~~		Schmelcher, M., Donovan, D. M., & Loessner, M. J. Bacteriophage endolysins as novel antimicrobials. Future Microbiology, 7(10), 1147–1171 (2012)

	[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]		[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Tina Arnšek at 06:06, 5 May 2020

2020-05-05T06:06:00Z

← Older revision		Revision as of 06:06, 5 May 2020
Line 73:		Line 73:

	Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).		Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).

			Schmelcher, M., Donovan, D. M., & Loessner, M. J. (2012). Bacteriophage endolysins as novel antimicrobials. Future Microbiology, 7(10), 1147–1171. doi: 10.2217/fmb.12.97

	[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]		[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Greta Junger at 18:56, 4 May 2020

2020-05-04T18:56:59Z

← Older revision		Revision as of 18:56, 4 May 2020
Line 23:		Line 23:

	====Izboljšave====		====Izboljšave====
	N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije ~~enzobiotikov~~, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi~~. Iz tam so namreč majhni proteini zaradi delovanja ledvic hitro izločeni~~. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo ~~specifičnost~~.		N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo aktivnost.

	===Litične transglikozilaze===		===Litične transglikozilaze===

Greta Junger: /* N-acetilmuramidaze */

2020-05-04T18:53:12Z

N-acetilmuramidaze

← Older revision		Revision as of 18:53, 4 May 2020
Line 19:		Line 19:

	N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.		N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.

	Do zdaj sta poznani le dve modularni N-acetilmuramidazi, ki delujeta v Gram negativnih bakterijah, vendar pa njun mehanizem delovanja še ni dobro pojasnjen.		Do zdaj sta poznani le dve modularni N-acetilmuramidazi, ki delujeta v Gram negativnih bakterijah, vendar pa njun mehanizem delovanja še ni dobro pojasnjen.

Greta Junger: /* N-acetilmuramidaze */

2020-05-04T18:52:52Z

N-acetilmuramidaze

← Older revision		Revision as of 18:52, 4 May 2020
Line 19:		Line 19:

	N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.		N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.
			Do zdaj sta poznani le dve modularni N-acetilmuramidazi, ki delujeta v Gram negativnih bakterijah, vendar pa njun mehanizem delovanja še ni dobro pojasnjen.

	====Izboljšave====		====Izboljšave====
	N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije enzobiotikov, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi. Iz tam so namreč majhni proteini zaradi delovanja ledvic hitro izločeni. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo specifičnost.		N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije enzobiotikov, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi. Iz tam so namreč majhni proteini zaradi delovanja ledvic hitro izločeni. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo specifičnost.


	===Litične transglikozilaze===		===Litične transglikozilaze===

Greta Junger: /* N-acetilglukozaminidaze */

2020-05-04T18:37:40Z

N-acetilglukozaminidaze

← Older revision		Revision as of 18:37, 4 May 2020
Line 34:		Line 34:
	===N-acetilglukozaminidaze===		===N-acetilglukozaminidaze===

	Edini strukturno znan endolizin z aktivnostjo N-acetilglukozaminidaze, ki cepi vez za N-acetilglukozaminom je PlyC. Encim je kompleks, sestavljen iz ene velike podenote in homooktamernega obroča. Na veliki podenoti se nahajata obe do sedaj identificirani encimsko aktivni domeni: od cisteina in histidina odvisna amidohidrolazna/peptidazna domena (PlyCCHAP) in N-acetilglukozaminidazna domena (PlyCGyH). Jedro PlyCGyH sestavlja struktura iz šestih α-heliksov, podobno kot pri nekaterih proteinih družine glikozidnih hidrolaz 73 (GH73). Znotraj omenjene regije je ohranjen aminokislinski ostanek Glu78, ki pri reakciji deluje kot kislina. Pri nekaterih encimih iz družine GH73, so bili opaženi možni katalitični aminokislinski ostanki na β-traku nasproti aktivnega mesta, ki pa v primeru PlyC ne obstaja. Zaradi odsotnosti kislih ostankov je verjetno v mehanizmu pozicioniranja in cepitve vezi vključen Tyr74.		Edini strukturno znan endolizin z aktivnostjo N-acetilglukozaminidaze, ki cepi vez za N-acetilglukozaminom, je PlyC. Encim je kompleks, sestavljen iz ene velike podenote in homooktamernega obroča. Na veliki podenoti se nahajata obe do sedaj identificirani encimsko aktivni domeni: od cisteina in histidina odvisna amidohidrolazna/peptidazna domena (PlyCCHAP) in N-acetilglukozaminidazna domena (PlyCGyH). Jedro PlyCGyH sestavlja struktura iz šestih α-heliksov, podobno kot pri nekaterih proteinih družine glikozidnih hidrolaz 73 (GH73). Znotraj omenjene regije je ohranjen aminokislinski ostanek Glu78, ki pri reakciji deluje kot kislina. Pri nekaterih encimih iz družine GH73, so bili opaženi možni katalitični aminokislinski ostanki na β-traku nasproti aktivnega mesta, ki pa v primeru PlyC ne obstaja. Zaradi odsotnosti kislih ostankov je verjetno v mehanizmu pozicioniranja in cepitve vezi vključen Tyr74.

	====Izboljšave====		====Izboljšave====

	Endolizin se je izkazal za učinkovitega, vendar izgubi svojo aktivnost že pri 45˚C, za kar je odgovorna velika podenota, vendar se da z uvedbo mutacij termično stabilnost močno povečati. Za razvoj modificiranih encimov, ki bi delovali na več vrst bakterij, bi rabili več znanih encimov, da bi lahko preučili mehanizme delovanja.		Endolizin se je izkazal za učinkovitega, vendar izgubi svojo aktivnost že pri 45˚C, za kar je odgovorna velika podenota, vendar se da z uvedbo mutacij termično stabilnost močno povečati. Za razvoj modificiranih encimov, ki bi delovali na več vrst bakterij, bi rabili več znanih encimov, da bi lahko preučili mehanizme delovanja.


	==N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze==		==N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze==

Greta Junger: /* Litične transglikozilaze */

2020-05-04T18:33:58Z

Litične transglikozilaze

← Older revision		Revision as of 18:33, 4 May 2020
Line 26:		Line 26:
	===Litične transglikozilaze===		===Litične transglikozilaze===

	Litične transglikozilaze tako kot N-acetilmuramidaze cepijo β-1,4 vez med N-acetilglukozaminom in N-acetilmuraminsko kislino, pri čemer nastane 1,6-anhidromuramoil, vendar z razliko, da za delovanje ne potrebujejo vode. Edini endolizin iz tega razreda, ki so ga uspeli kristalizirati in potrditi njegovo katalitično funkcijo je Gp144 (deluje na Pseudomonas aeruginoso). Prav tako je eden izmed redkih, ki deluje na ~~Gram negativne~~ bakterije. Endolizin v raztopini obstaja v različnih oligomernih oblikah, in sicer kot mono-, di- in trimer. V cepitev vezi je vpleten Glu115, vendar rezultati več raziskav kažejo, da je vpleten tudi Glu178.		Litične transglikozilaze tako kot N-acetilmuramidaze cepijo β-1,4 vez med N-acetilglukozaminom in N-acetilmuraminsko kislino, pri čemer nastane 1,6-anhidromuramoil, vendar z razliko, da za delovanje ne potrebujejo vode. Edini endolizin iz tega razreda, ki so ga uspeli kristalizirati in potrditi njegovo katalitično funkcijo je Gp144 (deluje na Pseudomonas aeruginoso). Prav tako je eden izmed redkih, ki deluje na Gramnegativne bakterije. Endolizin v raztopini obstaja v različnih oligomernih oblikah, in sicer kot mono-, di- in trimer. V cepitev vezi je vpleten Glu115, vendar rezultati več raziskav kažejo, da je vpleten tudi Glu178.

	====Izboljšave====		====Izboljšave====

Greta Junger: /* Izboljšave */

2020-05-04T18:33:32Z

Izboljšave

← Older revision		Revision as of 18:33, 4 May 2020
Line 30:		Line 30:
	====Izboljšave====		====Izboljšave====

	Pri ~~Gram pozitivnih~~ bakterijah se je izkazalo, da se ta aktivnost izgubi, saj te O-acetilirajo peptidoglikan na tisti stranski skupini, ki je vključena v nastanek 1,6-anhidromuramoila. Prav tako je bilo dokazano, da je pri tej vrsti bakterij interakcija encima s peptidoglikanom oslabljena. Delovanje na ~~Gram pozitivne~~ bakterije, ki nimajo zaestrenih skupin, in ~~Gram negativne~~ bi lahko izboljšali, če bi poznali natančne mehanizme vezave, da bi te lahko izboljšali. Pri modificiranju encima bi bilo potrebno paziti, da modifikacije ne bi vplivale na procese, ki so povezane z oligomerizacijo.		Pri Grampozitivnih bakterijah se je izkazalo, da se ta aktivnost izgubi, saj te O-acetilirajo peptidoglikan na tisti stranski skupini, ki je vključena v nastanek 1,6-anhidromuramoila. Prav tako je bilo dokazano, da je pri tej vrsti bakterij interakcija encima s peptidoglikanom oslabljena. Delovanje na Grampozitivne bakterije, ki nimajo zaestrenih skupin, in Gramnegativne bi lahko izboljšali, če bi poznali natančne mehanizme vezave, da bi te lahko izboljšali. Pri modificiranju encima bi bilo potrebno paziti, da modifikacije ne bi vplivale na procese, ki so povezane z oligomerizacijo.


	===N-acetilglukozaminidaze===		===N-acetilglukozaminidaze===

Anababnik at 18:33, 4 May 2020

2020-05-04T18:33:07Z

← Older revision		Revision as of 18:33, 4 May 2020
Line 44:		Line 44:
	==N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze==		==N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze==

	N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze cepijo amidno vez med N-acetilmuraminsko kislino in L-alaninom. V družino od cinka odvisnih amidaz 2 sodijo PlyL, PlyG, XlyA in LysGH15, ki imajo podobno strukturo in ohranjenost katalitičih ostankov. Zn-ion je koordiniran med molekulo vode, dvema histidinskima in enim cisteinskim ostankom. Pomembna ostanka sta glutamat, ki aktivira vodo za nukleofilni napad, in lizin, ki stabilizira intermediat. ~~Poznani~~ sta dve amidazi PlyPSA in CD27L, ki spadata v skupino od cinka odvisnih amidaz 3. Endolizine te skupine sestavlja β-ploskev iz šest trakov, ki jih obdaja pet α-vijačnic. Zn-ion je koordiniran v vezavnem žepu z dvema histidinskima in enim glutamatskim ostankom. Ohranjena glutamatska ostanka med reakcijo delujeta kot akceptorja protona.		N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze cepijo amidno vez med N-acetilmuraminsko kislino in L-alaninom. V družino od cinka odvisnih amidaz 2 sodijo PlyL, PlyG, XlyA in LysGH15, ki imajo podobno strukturo in ohranjenost katalitičih ostankov. Zn-ion je koordiniran med molekulo vode, dvema histidinskima in enim cisteinskim ostankom. Pomembna ostanka sta glutamat, ki aktivira vodo za nukleofilni napad, in lizin, ki stabilizira intermediat. Znani sta dve amidazi PlyPSA in CD27L, ki spadata v skupino od cinka odvisnih amidaz 3. Endolizine te skupine sestavlja β-ploskev iz šest trakov, ki jih obdaja pet α-vijačnic. Zn-ion je koordiniran v vezavnem žepu z dvema histidinskima in enim glutamatskim ostankom. Ohranjena glutamatska ostanka med reakcijo delujeta kot akceptorja protona.

	===Izboljšave===		===Izboljšave===