Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah - Revision history

Primož Šenica Pavletič: /* Sprostitev fagov */

2026-05-17T19:25:03Z

Sprostitev fagov

← Older revision		Revision as of 19:25, 17 May 2026
Line 53:		Line 53:
	Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.		Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

	~~Sprostitev fagov je bila dosežena~~ z osmotskim šokom. ~~Sintetične celice~~ so ~~se razgradile po prenosu~~ iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje. ~~Primerjava aktivnih sintetičnih celic~~ z ~~mrtvimi~~ celicami~~, ki~~ so ~~vsebovale RNazo~~ A, ~~je pokazala veliko razliko~~ v ~~nastajanju fagov~~. Aktivne sintetične celice so proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot ~~mrtve~~ celice. ~~Ta rezultat~~ potrjuje, da fagi ~~nastajajo zaradi aktivne transkripcije~~, ~~translacije~~, ~~replikacije~~ in ~~sestavljanja v notranjosti~~ liposomov~~, ne zgolj zaradi vezave začetnih fagov na membrano~~.		Fage so iz sintetičnih celic sprostili z osmotskim šokom. Liposome so prenesli iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje, zato je voda začela vstopati v liposome, membrana se je porušila in fagi so se sprostili v raztopino.

			Da bi preverili, ali novi fagi res nastajajo znotraj liposomov, so primerjali aktivne sintetične celice z “mrtvimi” celicami. Mrtve celice so pripravili z dodatkom RNaze A. RNaza A razgrajuje RNA, zato prepreči normalno izražanje genov v CFE sistemu. Če ni RNA, ne more potekati translacija fagnih proteinov, zato se novi fagi ne morejo učinkovito sestavljati.

			Aktivne sintetične celice so po okužbi proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot celice z RNazo A. To potrjuje, da fagi niso bili samo začetni fagi, vezani na membrano, ampak so nastali z aktivnim izražanjem genov, replikacijo in sestavljanjem znotraj liposomov.

	==Pomen raziskave in zaključek==		==Pomen raziskave in zaključek==

Primož Šenica Pavletič: /* Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS */

2026-05-17T19:21:46Z

Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS

← Older revision		Revision as of 19:21, 17 May 2026
Line 46:		Line 46:

	===Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS===		===Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS===
	Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, ~~celo~~ učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. ~~Verjetna razlaga~~ je ~~prostorska omejitev~~ liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno ~~bolj~~ zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in ~~masni sistem~~ bolj ~~primerljiva~~.		Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Masna CFE reakcija pomeni, da reakcija poteka prosto v raztopini, na primer v epruveti, in ni zaprta v liposome. Razlika je verjetno posledica prostorske omejitve liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti bolj lokalno zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski sistem in masna reakcija po učinkovitosti bolj podobna.

	~~Pomembna omejitev sistema~~ je ~~bila ponovna vezava novo nastalih~~ fagov na RdLPS. Pri fagih~~, ki se~~ močno ~~vežejo na~~ RdLPS~~, je bilo zaznano~~ približno 94 % ~~zmanjšanje~~ prostih infektivnih delcev. To ~~ne pomeni~~, da se fagi niso ~~sestavili. Bolj verjetno je~~, da so ~~se po nastanku ireverzibilno vezali~~ na ~~RdLPS~~ in zato niso bili ~~več~~ zaznani kot prosti infektivni ~~delci~~. RdLPS je ~~tako nujen za vstop genoma~~, hkrati pa ~~lahko zmanjša~~ razpoložljivost potomnih fagov.		RdLPS je bil za sistem hkrati nujen in omejujoč. Na začetku je omogočil vezavo faga T7 na membrano in s tem vstop genoma v sintetično celico. Težava pa se je pojavila po sestavljanju novih fagov, saj so se ti lahko ponovno vezali na RdLPS v membrani. Pri fagih z močno afiniteto do RdLPS so zato zaznali približno 94 % manj prostih infektivnih delcev. To kaže, da se fagi verjetno niso izgubili zaradi neuspešnega sestavljanja, ampak so ostali vezani na receptor in zato niso bili zaznani kot prosti infektivni fagi v raztopini. RdLPS je torej omogočil začetek okužbe, hkrati pa je zmanjšal razpoložljivost potomnih fagov po njihovem nastanku.

	===Sprostitev fagov===		===Sprostitev fagov===

Primož Šenica Pavletič: /* Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev */

2026-05-17T14:57:32Z

Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev

← Older revision		Revision as of 14:57, 17 May 2026
Line 41:		Line 41:
	==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==		==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
	===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===		===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
	Čas vstopa genoma ~~v sintetične celice je bil ocenjen~~ s primerjavo dveh pogojev: ~~v prvem~~ je bil fagni genom že ~~prisoten~~ v ~~notranjosti liposoma~~, v drugem pa je moral ~~genom~~ vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku ~~fluorescenčnega signala~~ je pokazala, da prenos genoma T7 ~~v tem sistemu~~ traja približno ~~od 100 do 105~~ minut.		Čas vstopa genoma so ocenili s primerjavo dveh pogojev: pri enem je bil fagni genom že v liposomu, pri drugem pa je moral vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescence je pokazala, da prenos genoma T7 traja približno 100–105 minut.

	Nastajanje infektivnih fagov ~~je bilo spremljano z meritvijo~~ PFU ~~na nanoliter~~. PFU pomeni ~~plaque-forming units, torej~~ število ~~infektivnih fagnih delcev~~, ki lahko tvorijo ~~plake na bakterijski plasti~~. ~~Prvi infektivni fagi~~ so ~~bili zaznani~~ po približno eni uri~~. Po dveh urah je bilo doseženih več kot 50 % končnega titra~~, po petih urah pa približno 10⁵ PFU/nL. ~~Pri 30 °C so bili titri v masni CFE reakciji in v sintetičnih celicah podobni.~~		Nastajanje infektivnih fagov so merili kot PFU/nL. PFU pomeni število fagov, ki lahko okužijo bakterije in tvorijo plak; titer pa pomeni koncentracijo teh infektivnih fagov v vzorcu. Prve infektivne fage so zaznali po približno eni uri, po petih urah pa je titer dosegel približno 10⁵ PFU/nL. Ker je bil izmerjeni titer višji od pričakovanega brez replikacije DNA, so sklepali, da je v sintetičnih celicah prišlo do delnega pomnoževanja fagnega genoma. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5.

	~~Izmerjeni titri so bili nekoliko~~ višji od ~~vrednosti~~, ~~pričakovane v primeru~~, da ~~bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA~~ v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5~~, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma~~.

	===Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS===		===Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS===

Primož Šenica Pavletič: /* Pomen raziskave in zaključek */

2026-05-17T14:52:45Z

Pomen raziskave in zaključek

← Older revision		Revision as of 14:52, 17 May 2026
Line 58:		Line 58:

	==Pomen raziskave in zaključek==		==Pomen raziskave in zaključek==
	Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče ~~v celično-prostem sistemu~~ sintetičnih celic združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.		Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče ustvariti sistem sintetičnih celic in združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.

	Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.		Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.

Primož Šenica Pavletič: /* Priprava sinteznih celic */

2026-05-17T11:31:25Z

Priprava sinteznih celic

← Older revision		Revision as of 11:31, 17 May 2026
Line 11:		Line 11:
	Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.		Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

	==Priprava ~~sinteznih~~ celic==		==Priprava sintetičnih celic==
	===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===		===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
	Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. Kot receptorsko komponento so uporabili RdLPS (angl. rough deep lipopolysaccharide), krajšo obliko LPS, pri kateri je sladkorni del močno skrajšan in vsebuje predvsem notranje jedro. Takšna zgradba mu daje večjo hidrofobnost, zato se v lipidno membrano liposoma vgrajuje stabilneje kot daljše oblike LPS.		Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. Kot receptorsko komponento so uporabili RdLPS (angl. rough deep lipopolysaccharide), krajšo obliko LPS, pri kateri je sladkorni del močno skrajšan in vsebuje predvsem notranje jedro. Takšna zgradba mu daje večjo hidrofobnost, zato se v lipidno membrano liposoma vgrajuje stabilneje kot daljše oblike LPS.

Primož Šenica Pavletič: /* Sprostitev fagov */

2026-05-17T11:31:00Z

Sprostitev fagov

← Older revision		Revision as of 11:31, 17 May 2026
Line 52:		Line 52:
	Pomembna omejitev sistema je bila ponovna vezava novo nastalih fagov na RdLPS. Pri fagih, ki se močno vežejo na RdLPS, je bilo zaznano približno 94 % zmanjšanje prostih infektivnih delcev. To ne pomeni, da se fagi niso sestavili. Bolj verjetno je, da so se po nastanku ireverzibilno vezali na RdLPS in zato niso bili več zaznani kot prosti infektivni delci. RdLPS je tako nujen za vstop genoma, hkrati pa lahko zmanjša razpoložljivost potomnih fagov.		Pomembna omejitev sistema je bila ponovna vezava novo nastalih fagov na RdLPS. Pri fagih, ki se močno vežejo na RdLPS, je bilo zaznano približno 94 % zmanjšanje prostih infektivnih delcev. To ne pomeni, da se fagi niso sestavili. Bolj verjetno je, da so se po nastanku ireverzibilno vezali na RdLPS in zato niso bili več zaznani kot prosti infektivni delci. RdLPS je tako nujen za vstop genoma, hkrati pa lahko zmanjša razpoložljivost potomnih fagov.

	==Sprostitev fagov==		===Sprostitev fagov===
	Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.		Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Primož Šenica Pavletič: /* Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS */

2026-05-17T11:30:48Z

Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS

← Older revision		Revision as of 11:30, 17 May 2026
Line 47:		Line 47:
	Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.		Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.

	==Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS==		===Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS===
	Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, celo učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Verjetna razlaga je prostorska omejitev liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno bolj zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in masni sistem bolj primerljiva.		Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, celo učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Verjetna razlaga je prostorska omejitev liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno bolj zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in masni sistem bolj primerljiva.

Primož Šenica Pavletič: /* Neposredno spremljanje fagne DNA */

2026-05-17T11:30:15Z

Neposredno spremljanje fagne DNA

← Older revision		Revision as of 11:30, 17 May 2026
Line 35:		Line 35:

	===Neposredno spremljanje fagne DNA===		===Neposredno spremljanje fagne DNA===
			Vstop in replikacijo fagne DNA so spremljali z dvema fluorescenčnima označevalcema. SYBR Gold se veže na DNA, zato so z njim zaznali prisotnost fagnega genoma v notranjosti liposomov. Po dodatku faga so se pojavili zeleni fluorescenčni skupki, kar kaže, da je fagna DNA vstopila v sintetične celice. Ob tem se je povečevala rdeča fluorescenca mCherry, kar potrjuje, da se je genom začel izražati.

			Replikacijo DNA so preverili še s FITC-dCTP, fluorescenčnim nukleotidom, ki se vgradi v novo sintetizirano DNA. Tudi pri tem so opazili zelene skupke, ki so se kasneje razpršili. Takšna dinamika je skladna z nastankom dolgih povezanih kopij fagne DNA, ki se nato obdelajo in zapakirajo v nove kapside.

	==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==		==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
	===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===		===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===

Primož Šenica Pavletič: /* Literatura */

2026-05-17T11:28:54Z

Literatura

← Older revision		Revision as of 11:28, 17 May 2026
Line 59:		Line 59:

	==Literatura==		==Literatura==
	[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (~~2026h~~). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557-. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8		[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Primož Šenica Pavletič: /* Vpliv MOI in velikosti liposomov */

2026-05-17T11:23:44Z

Vpliv MOI in velikosti liposomov

← Older revision		Revision as of 11:23, 17 May 2026
Line 33:		Line 33:

	Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.		Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

	~~===Vpliv MOI in velikosti liposomov===~~
	Učinkovitost okužbe je bila močno odvisna od MOI (multiplicity of infection; število infektivnih fagov na eno sintetično celico). Pri MOI približno 3 je bilo okuženih manj kot 2 % sintetičnih celic, pri MOI 300 pa je delež okuženih celic narasel na skoraj 70 %. To kaže, da je za učinkovito okužbo v tem sistemu potrebna razmeroma visoka koncentracija fagov.

	Na izražanje mCherry je vplivala tudi velikost liposomov. Manjši liposomi, s premerom pod 10 µm, so imeli višjo koncentracijo mCherry kot večji liposomi. Ta učinek je najverjetneje povezan z razmerjem med površino in volumnom. Pri manjšem liposomu že manjše število vnesenih genomov povzroči višjo koncentracijo DNA v notranjosti, zato je tudi fluorescenčni signal močnejši.

	===Neposredno spremljanje fagne DNA===		===Neposredno spremljanje fagne DNA===