FluoroLoop - Revision history

Eva Vene: /* Konstrukcija PFOA-odzivnega sistema TMS */

2024-05-14T06:40:38Z

Konstrukcija PFOA-odzivnega sistema TMS

← Older revision		Revision as of 06:40, 14 May 2024
Line 52:		Line 52:
	==Konstrukcija PFOA-odzivnega sistema TMS==		==Konstrukcija PFOA-odzivnega sistema TMS==

	Iz izhodiščnega TMS so pripravili tri variacije različnimi dolžinami debel. Glede na predvideno sekundarno strukturo osnovnega aptamera – ohranene dele in dele pomembne za vezavo fluoroforjev – so iterativno odstranjevali dele zaporedja, s čimer so testirali efekt debel. Najprej so odstranili nukleotide, potrebne za vezavo fluoroforjev, nato neohranjene regije. Pripravljena zaporedja vstavili v TMS. Testirali so jih za od PFOA odvisno inhibicijo izražanja reporterja ter nazadnje obdržali zgolj ohranjene regije z ohranjenimi zankastimi strukturami, ki predstavljajo zgolj 19 bp prvotnega aptamera. Rezultati za vse aptamere so pokazali zmanjšanje fluorescence ob povečanju koncentracije PFOA, kar se ne sklada z razlago mehanizma v izvornem članku. Glede na tekom projekta pridobljene podatke bi tako pričakovali, da določeni aptamerni ligandi izboljšajo interakcijo med TMS in mRNA ter dodatno inhibirajo izražanje proteina[3].		Iz izhodiščnega TMS so pripravili tri variacije različnimi dolžinami debel. Glede na predvideno sekundarno strukturo osnovnega aptamera – ohranene dele in dele pomembne za vezavo fluoroforjev – so iterativno odstranjevali dele zaporedja, s čimer so testirali efekt debel. Najprej so odstranili nukleotide, potrebne za vezavo fluoroforjev, nato neohranjene regije. Pripravljena zaporedja vstavili v TMS. Testirali so jih za od PFOA odvisno inhibicijo izražanja reporterja ter nazadnje obdržali zgolj ohranjene regije z ohranjenimi zankastimi strukturami, ki predstavljajo zgolj 19 bp prvotnega aptamera. Rezultati za vse aptamere so pokazali zmanjšanje fluorescence ob povečanju koncentracije PFOA, kar se ne sklada z razlago mehanizma v izvornem članku. Glede na tekom projekta pridobljene podatke bi tako pričakovali, da določeni aptamerni ligandi izboljšajo interakcijo med TMS in mRNA ter dodatno inhibirajo izražanje proteina [3].

	==Perspektiva za prihodnost==		==Perspektiva za prihodnost==

Eva Vene: /* Karakterizacija aptamera PFOA */

2024-05-14T06:40:28Z

Karakterizacija aptamera PFOA

← Older revision		Revision as of 06:40, 14 May 2024
Line 48:		Line 48:
	==Karakterizacija aptamera PFOA==		==Karakterizacija aptamera PFOA==
	V letu 2022 je bil obljavljen članek, ki je določil ssDNA aptamer z zmožnostjo vezave PFOA. Določili so ga z uporabo metode SELEX, kjer so pridobili deset različnih ssDNA z zmožnostjo vezave PFOA – <i>in silico</i> so analizirali sekundarne strukture zaporedij in odkrili tri regije ohranjene med več aptameri. S testom fluorescence so ocenili vezavne afinitete aptamerov z vezavo fluorofora na aptamer in utiševalca na vezavno verigo. Najboljši aptamer je PFOA vezal z disociacijsko konstanto K<sub>D</sub> 5,5 uM v čisti raztopini in 7,4 uM v odpadni vodi. Končna verzija aptamera je imela nivo detekcije 0,17 uM v vodi [6]. Ker je delo s ssDNA zahtevno, je skupina testirala potencialno preoblikovanje v ssRNA, ob čemer so testirali vezavno afiniteto PFOA na več verzij aptamerov.		V letu 2022 je bil obljavljen članek, ki je določil ssDNA aptamer z zmožnostjo vezave PFOA. Določili so ga z uporabo metode SELEX, kjer so pridobili deset različnih ssDNA z zmožnostjo vezave PFOA – <i>in silico</i> so analizirali sekundarne strukture zaporedij in odkrili tri regije ohranjene med več aptameri. S testom fluorescence so ocenili vezavne afinitete aptamerov z vezavo fluorofora na aptamer in utiševalca na vezavno verigo. Najboljši aptamer je PFOA vezal z disociacijsko konstanto K<sub>D</sub> 5,5 uM v čisti raztopini in 7,4 uM v odpadni vodi. Končna verzija aptamera je imela nivo detekcije 0,17 uM v vodi [6]. Ker je delo s ssDNA zahtevno, je skupina testirala potencialno preoblikovanje v ssRNA, ob čemer so testirali vezavno afiniteto PFOA na več verzij aptamerov.
	Za izvedbo eksperimenta so predvideli dve možnosti: ITC (ang. »<i>Isothermal Titration Calorimetry</i>«) in SPR (ang. »<i>Surface Plasmon Resonance</i>«). Obe metodi se uporabljata za določitev vezavne afinitete, a ITC potrebuje obiširne eksperimente za določitev ustreznih reakcijskih pogojev. SPR je za izvedbo prav tako zahtevna tehnika, ki jo je skupina izvedla v sodelovanju s Centrom za diagnostiko. Prvotni eksperimenti so generirali večje število lažnih pozitivnih rezultatov, za kar so ponudili več razlogov: vezava PFOA na ploščo, koagulacija PFOA ali neustrezna regeneracija plošče po vsakem testu. Tako aptamerov, specifičnih za PFOA, (zaenkrat) niso karakterizirali in/ali optimizirali. Za potrebe nadaljevanja projekta so uporabili najbolj usrezni aptamer, določen v članku [6].		Za izvedbo eksperimenta so predvideli dve možnosti: ITC (ang. »<i>Isothermal Titration Calorimetry</i>«) in SPR (ang. »<i>Surface Plasmon Resonance</i>«). Obe metodi se uporabljata za določitev vezavne afinitete, a ITC potrebuje obiširne eksperimente za določitev ustreznih reakcijskih pogojev. SPR je za izvedbo prav tako zahtevna tehnika, ki jo je skupina izvedla v sodelovanju s Centrom za diagnostiko. Prvotni eksperimenti so generirali večje število lažnih pozitivnih rezultatov, za kar so ponudili več razlogov: vezava PFOA na ploščo, koagulacija PFOA ali neustrezna regeneracija plošče po vsakem testu. Tako aptamerov, specifičnih za PFOA, (zaenkrat) niso karakterizirali in/ali optimizirali. Za potrebe nadaljevanja projekta so uporabili najbolj usrezni aptamer, določen v članku [3, 6].

	==Konstrukcija PFOA-odzivnega sistema TMS==		==Konstrukcija PFOA-odzivnega sistema TMS==

Eva Vene: /* Karakterizacija aptamera PFOA */

2024-05-14T06:39:39Z

Karakterizacija aptamera PFOA

← Older revision		Revision as of 06:39, 14 May 2024
Line 47:		Line 47:

	==Karakterizacija aptamera PFOA==		==Karakterizacija aptamera PFOA==
	V letu 2022 je bil obljavljen članek, ki je določil ssDNA aptamer z zmožnostjo vezave PFOA. Določili so ga z uporabo metode SELEX, kjer so pridobili deset različnih ssDNA z zmožnostjo vezave PFOA – <i>in silico</i> so analizirali sekundarne strukture zaporedij in odkrili tri regije ohranjene med več aptameri. S testom fluorescence so ocenili vezavne afinitete aptamerov z vezavo fluorofora na aptamer in utiševalca na vezavno verigo. Najboljši aptamer je PFOA vezal z disociacijsko konstanto K<sub>D</sub> 5,5 uM v čisti raztopini in 7,4 uM v odpadni vodi. Končna verzija aptamera je imela nivo detekcije 0,17 uM v vodi. Ker je delo s ssDNA zahtevno, je skupina testirala potencialno preoblikovanje v ssRNA, ob čemer so testirali vezavno afiniteto PFOA na več verzij aptamerov ~~[6]~~.		V letu 2022 je bil obljavljen članek, ki je določil ssDNA aptamer z zmožnostjo vezave PFOA. Določili so ga z uporabo metode SELEX, kjer so pridobili deset različnih ssDNA z zmožnostjo vezave PFOA – <i>in silico</i> so analizirali sekundarne strukture zaporedij in odkrili tri regije ohranjene med več aptameri. S testom fluorescence so ocenili vezavne afinitete aptamerov z vezavo fluorofora na aptamer in utiševalca na vezavno verigo. Najboljši aptamer je PFOA vezal z disociacijsko konstanto K<sub>D</sub> 5,5 uM v čisti raztopini in 7,4 uM v odpadni vodi. Končna verzija aptamera je imela nivo detekcije 0,17 uM v vodi [6]. Ker je delo s ssDNA zahtevno, je skupina testirala potencialno preoblikovanje v ssRNA, ob čemer so testirali vezavno afiniteto PFOA na več verzij aptamerov.
	Za izvedbo eksperimenta so predvideli dve možnosti: ITC (ang. »<i>Isothermal Titration Calorimetry</i>«) in SPR (ang. »<i>Surface Plasmon Resonance</i>«). Obe metodi se uporabljata za določitev vezavne afinitete, a ITC potrebuje obiširne eksperimente za določitev ustreznih reakcijskih pogojev. SPR je za izvedbo prav tako zahtevna tehnika, ki jo je skupina izvedla v sodelovanju s Centrom za diagnostiko. Prvotni eksperimenti so generirali večje število lažnih pozitivnih rezultatov, za kar so ponudili več razlogov: vezava PFOA na ploščo, koagulacija PFOA ali neustrezna regeneracija plošče po vsakem testu. Tako aptamerov, specifičnih za PFOA, (zaenkrat) niso karakterizirali in/ali optimizirali. Za potrebe nadaljevanja projekta so uporabili najbolj usrezni aptamer, določen v članku [6].		Za izvedbo eksperimenta so predvideli dve možnosti: ITC (ang. »<i>Isothermal Titration Calorimetry</i>«) in SPR (ang. »<i>Surface Plasmon Resonance</i>«). Obe metodi se uporabljata za določitev vezavne afinitete, a ITC potrebuje obiširne eksperimente za določitev ustreznih reakcijskih pogojev. SPR je za izvedbo prav tako zahtevna tehnika, ki jo je skupina izvedla v sodelovanju s Centrom za diagnostiko. Prvotni eksperimenti so generirali večje število lažnih pozitivnih rezultatov, za kar so ponudili več razlogov: vezava PFOA na ploščo, koagulacija PFOA ali neustrezna regeneracija plošče po vsakem testu. Tako aptamerov, specifičnih za PFOA, (zaenkrat) niso karakterizirali in/ali optimizirali. Za potrebe nadaljevanja projekta so uporabili najbolj usrezni aptamer, določen v članku [6].

Eva Vene: /* Karakterizacija aptamera PFOA */

2024-05-14T06:38:29Z

Karakterizacija aptamera PFOA

← Older revision		Revision as of 06:38, 14 May 2024
Line 47:		Line 47:

	==Karakterizacija aptamera PFOA==		==Karakterizacija aptamera PFOA==
	V letu 2022 je bil obljavljen članek, ki je določil ssDNA aptamer z zmožnostjo vezave PFOA. Določili so ga z uporabo metode SELEX, kjer so pridobili deset različnih ssDNA z zmožnostjo vezave PFOA – <i>in silico</i> so analizirali sekundarne strukture zaporedij in odkrili tri regije ohranjene med več aptameri. S testom fluorescence so ocenili vezavne afinitete aptamerov z vezavo fluorofora na aptamer in utiševalca na vezavno verigo. Najboljši aptamer je PFOA vezal z disociacijsko konstanto KD 5,5 uM v čisti raztopini in 7,4 uM v odpadni vodi. Končna verzija aptamera je imela nivo detekcije 0,17 uM v vodi. Ker je delo s ssDNA zahtevno, je skupina testirala potencialno preoblikovanje v ssRNA, ob čemer so testirali vezavno afiniteto PFOA na več verzij aptamerov [6].		V letu 2022 je bil obljavljen članek, ki je določil ssDNA aptamer z zmožnostjo vezave PFOA. Določili so ga z uporabo metode SELEX, kjer so pridobili deset različnih ssDNA z zmožnostjo vezave PFOA – <i>in silico</i> so analizirali sekundarne strukture zaporedij in odkrili tri regije ohranjene med več aptameri. S testom fluorescence so ocenili vezavne afinitete aptamerov z vezavo fluorofora na aptamer in utiševalca na vezavno verigo. Najboljši aptamer je PFOA vezal z disociacijsko konstanto K<sub>D</sub> 5,5 uM v čisti raztopini in 7,4 uM v odpadni vodi. Končna verzija aptamera je imela nivo detekcije 0,17 uM v vodi. Ker je delo s ssDNA zahtevno, je skupina testirala potencialno preoblikovanje v ssRNA, ob čemer so testirali vezavno afiniteto PFOA na več verzij aptamerov [6].
	Za izvedbo eksperimenta so predvideli dve možnosti: ITC (ang. »<i>Isothermal Titration Calorimetry</i>«) in SPR (ang. »<i>Surface Plasmon Resonance</i>«). Obe metodi se uporabljata za določitev vezavne afinitete, a ITC potrebuje obiširne eksperimente za določitev ustreznih reakcijskih pogojev. SPR je za izvedbo prav tako zahtevna tehnika, ki jo je skupina izvedla v sodelovanju s Centrom za diagnostiko. Prvotni eksperimenti so generirali večje število lažnih pozitivnih rezultatov, za kar so ponudili več razlogov: vezava PFOA na ploščo, koagulacija PFOA ali neustrezna regeneracija plošče po vsakem testu. Tako aptamerov, specifičnih za PFOA, (zaenkrat) niso karakterizirali in/ali optimizirali. Za potrebe nadaljevanja projekta so uporabili najbolj usrezni aptamer, določen v članku [6].		Za izvedbo eksperimenta so predvideli dve možnosti: ITC (ang. »<i>Isothermal Titration Calorimetry</i>«) in SPR (ang. »<i>Surface Plasmon Resonance</i>«). Obe metodi se uporabljata za določitev vezavne afinitete, a ITC potrebuje obiširne eksperimente za določitev ustreznih reakcijskih pogojev. SPR je za izvedbo prav tako zahtevna tehnika, ki jo je skupina izvedla v sodelovanju s Centrom za diagnostiko. Prvotni eksperimenti so generirali večje število lažnih pozitivnih rezultatov, za kar so ponudili več razlogov: vezava PFOA na ploščo, koagulacija PFOA ali neustrezna regeneracija plošče po vsakem testu. Tako aptamerov, specifičnih za PFOA, (zaenkrat) niso karakterizirali in/ali optimizirali. Za potrebe nadaljevanja projekta so uporabili najbolj usrezni aptamer, določen v članku [6].

Eva Vene: /* Validacija regulacijskega sistema TMS */

2024-05-14T06:37:55Z

Validacija regulacijskega sistema TMS

← Older revision		Revision as of 06:37, 14 May 2024
Line 34:		Line 34:

	==Validacija regulacijskega sistema TMS==		==Validacija regulacijskega sistema TMS==
	Za potrebe testa PFOA je morala skupina najprej vzpostaviti biosenzor. TMS iz članka, ki je prvotno definiral možnost uporabe TMS za regulacijo izražanja [5] so povezali z izražanjem fluorescirajočega proteina – v njihovem primeru GFP ter mCherry. Slednja omogočata preprosto detekcijo brez dodatnih korakov celične lize. Ustrezne plazmide za prenos v celice je ekipa zgradila s kloniranjem USER (<i>Uracil Specific Excision Reagent</i>). Slednje je osnovano na metodi PCR in tehnologiji kloniranja brez ligacije, ki omogoča sintezo plazmida z več inserti v enem koraku. Najprej željene dele pomnožimo s PCR, pri katerem uporabljamo posebej oblikovane začetne oligonukleotide, ki na 5' koncu dodajo ~~podaljše~~ z enim dU – delo poteka z uracil kompatibilno polimerazo (npr. X7). Produkte PCR očistimo in obdelamo z reagentom USER. Reakcija vključuje izrez podaljškov z uracilom s sledečo hibridizacijo specifičnih lepljivih koncev ~~– slednji so lahko oblikovani različno, kar omogoča kreacijo različnih komplementarnih previsov~~. Skupina je pridobljene produkte klonirala v DH5α <i>E. coli</i>. Po propagaciji v bakterijah, čiščenju in validaciji s PCR ter Sanger sekvenciranju, so plazmide kotransformirali v <i>E. coli</i> BL21(DE3) za izražanje proteina. Sev je bil izbran zaradi vsebnosti IPTG inducibilne T7 polimeraze. Seve so inkubirali preko noči, reinokulirali in inducirali v pozni fazi log. 5 ur po indukciji so izmerili fluorescenco in z rezultati ~~ugotvaljali~~ uspešnost represije fluorescirajočega proteina – mCherry [3,7].		Za potrebe testa PFOA je morala skupina najprej vzpostaviti biosenzor. TMS iz članka, ki je prvotno definiral možnost uporabe TMS za regulacijo izražanja [5] so povezali z izražanjem fluorescirajočega proteina – v njihovem primeru GFP ter mCherry. Slednja omogočata preprosto detekcijo brez dodatnih korakov celične lize. Ustrezne plazmide za prenos v celice je ekipa zgradila s kloniranjem USER (<i>Uracil Specific Excision Reagent</i>). Slednje je osnovano na metodi PCR in tehnologiji kloniranja brez ligacije, ki omogoča sintezo plazmida z več inserti v enem koraku. Najprej željene dele pomnožimo s PCR, pri katerem uporabljamo posebej oblikovane začetne oligonukleotide, ki na 5' koncu dodajo podaljšek z enim dU – delo poteka z uracil kompatibilno polimerazo (npr. X7). Produkte PCR očistimo in obdelamo z reagentom USER. Reakcija vključuje izrez podaljškov z uracilom s sledečo hibridizacijo specifičnih lepljivih koncev. Skupina je pridobljene produkte klonirala v DH5α <i>E. coli</i>. Po propagaciji v bakterijah, čiščenju in validaciji s PCR ter Sanger sekvenciranju, so plazmide kotransformirali v <i>E. coli</i> BL21(DE3) za izražanje proteina. Sev je bil izbran zaradi vsebnosti IPTG inducibilne T7 polimeraze. Seve so inkubirali preko noči, reinokulirali in inducirali v pozni fazi log. 5 ur po indukciji so izmerili fluorescenco in z rezultati ugotavljali uspešnost represije fluorescirajočega proteina – mCherry [3,7].
	Za zmanjšanje tveganja, da bo manj molekul TMS kot transkriptov za utišanje, je skupina izražala regulator TMS v plazmidu z velikim številom kopij, medtem ko so bili reporterski geni vstavljeni v plazmid z majhnim številom kopij. Posledično so dobili veliko večje število represorjev kot mRNA za utišanje, kar je izboljšalo puščanje sistema [3].		Za zmanjšanje tveganja, da bo manj molekul TMS kot transkriptov za utišanje, je skupina izražala regulator TMS v plazmidu z velikim številom kopij, medtem ko so bili reporterski geni vstavljeni v plazmid z majhnim številom kopij. Posledično so dobili veliko večje število represorjev kot mRNA za utišanje, kar je izboljšalo puščanje sistema [3].
	Za validacijo so izvedli dva sklopa eksperimentov, opisana v nadaljevanju.		Za validacijo so izvedli dva sklopa eksperimentov, opisana v nadaljevanju.

Eva Vene: /* Konstrukcija PFOA-odzivnega sistema TMS */

2024-05-14T06:34:03Z

Konstrukcija PFOA-odzivnega sistema TMS

← Older revision		Revision as of 06:34, 14 May 2024
Line 52:		Line 52:
	==Konstrukcija PFOA-odzivnega sistema TMS==		==Konstrukcija PFOA-odzivnega sistema TMS==

	Iz izhodiščnega TMS so pripravili tri variacije različnimi dolžinami debel. Glede na predvideno sekundarno strukturo osnovnega aptamera – ohranene dele in dele pomembne za vezavo fluoroforjev – so iterativno odstranjevali dele zaporedja, s čimer so testirali efekt debel. Najprej so odstranili nukleotide, potrebne za vezavo fluoroforjev, nato neohranjene regije. Pripravljena zaporedja vstavili v TMS. Testirali so jih za od PFOA odvisno inhibicijo izražanja reporterja ter nazadnje obdržali zgolj ohranjene regije z ohranjenimi zankastimi strukturami, ki predstavljajo zgolj 19 bp prvotnega aptamera. ~~Sicer so rezultati~~ za vse aptamere pokazali zmanjšanje fluorescence [3].		Iz izhodiščnega TMS so pripravili tri variacije različnimi dolžinami debel. Glede na predvideno sekundarno strukturo osnovnega aptamera – ohranene dele in dele pomembne za vezavo fluoroforjev – so iterativno odstranjevali dele zaporedja, s čimer so testirali efekt debel. Najprej so odstranili nukleotide, potrebne za vezavo fluoroforjev, nato neohranjene regije. Pripravljena zaporedja vstavili v TMS. Testirali so jih za od PFOA odvisno inhibicijo izražanja reporterja ter nazadnje obdržali zgolj ohranjene regije z ohranjenimi zankastimi strukturami, ki predstavljajo zgolj 19 bp prvotnega aptamera. Rezultati za vse aptamere so pokazali zmanjšanje fluorescence ob povečanju koncentracije PFOA, kar se ne sklada z razlago mehanizma v izvornem članku. Glede na tekom projekta pridobljene podatke bi tako pričakovali, da določeni aptamerni ligandi izboljšajo interakcijo med TMS in mRNA ter dodatno inhibirajo izražanje proteina[3].

	==Perspektiva za prihodnost==		==Perspektiva za prihodnost==

Eva Vene: /* Izražanje mCherry v odvisnosti od drugih ligandov */

2024-05-14T06:31:46Z

Izražanje mCherry v odvisnosti od drugih ligandov

← Older revision		Revision as of 06:31, 14 May 2024
Line 44:		Line 44:
	===Izražanje mCherry v odvisnosti od drugih ligandov===		===Izražanje mCherry v odvisnosti od drugih ligandov===

	Prvotni eksperiment z GFP in mCherry so modificirali za testiranje prilagoditve odvisnosti liganda z zamenjavo aptamera. Tako so v dano TMS vstavili že znana aptamerna zaporedja za mangan (dve zaporedji) in teofilin (dve zaporedji). Metoda bi morala še vedno delovati po istem načelu: v kolikor ni prisotnega vezanega liganda, se TMS poveže okoli RBS in prepreči izražanje mCherry. Ob prisotnosti ustreznega liganda TMS zaradi strukturnih ovir ni sposobna vezave in protein se prosto izraža. Rezultati so sledili postavljeni hipotezi, ob večjih koncentracijah liganda so zaznali manjšo fluorescenco [3].		Prvotni eksperiment z GFP in mCherry so modificirali za testiranje prilagoditve odvisnosti liganda z zamenjavo aptamera. Tako so v dano TMS vstavili že znana aptamerna zaporedja za mangan (dve zaporedji) in teofilin (dve zaporedji). Metoda bi morala še vedno delovati po istem načelu: v kolikor ni prisotnega vezanega liganda, se TMS poveže okoli RBS in prepreči izražanje mCherry. Ob prisotnosti ustreznega liganda TMS zaradi strukturnih ovir ni sposobna vezave in protein se prosto izraža. Rezultati niso sledili postavljeni hipotezi, ob večjih koncentracijah liganda so namreč zaznali manjšo fluorescenco [3].

	==Karakterizacija aptamera PFOA==		==Karakterizacija aptamera PFOA==

Eva Vene: /* Validacija regulacijskega sistema TMS */

2024-05-14T06:31:01Z

Validacija regulacijskega sistema TMS

← Older revision		Revision as of 06:31, 14 May 2024
Line 34:		Line 34:

	==Validacija regulacijskega sistema TMS==		==Validacija regulacijskega sistema TMS==
	Za potrebe testa PFOA je morala skupina najprej vzpostaviti biosenzor. TMS iz članka, ki je prvotno definiral možnost uporabe TMS za regulacijo izražanja [5] so povezali z izražanjem fluorescirajočega proteina – v njihovem primeru GFP ter mCherry. Slednja omogočata preprosto detekcijo brez dodatnih korakov celične lize. Ustrezne plazmide za prenos v celice je ekipa zgradila s kloniranjem USER (<i>Uracil Specific Excision Reagent</i>). Slednje je osnovano na metodi PCR in tehnologiji kloniranja brez ligacije, ki omogoča sintezo plazmida z več inserti v enem koraku. Najprej željene dele pomnožimo s PCR, pri katerem uporabljamo posebej oblikovane začetne oligonukleotide, ki na 5' koncu dodajo podaljše z enim dU – delo poteka z uracil kompatibilno polimerazo (npr. X7). Produkte PCR očistimo in obdelamo z reagentom USER. Reakcija vključuje izrez podaljškov z uracilom s sledečo hibridizacijo specifičnih lepljivih koncev – slednji so lahko oblikovani različno, kar omogoča kreacijo različnih komplementarnih previsov. Skupina je pridobljene produkte klonirala v ~~DH5alfa~~ E. coli. Po propagaciji v bakterijah, čiščenju in validaciji s PCR ter Sanger sekvenciranju, so plazmide kotransformirali v E. coli BL21(DE3) za izražanje proteina. Sev je bil izbran zaradi vsebnosti IPTG inducibilne T7 polimeraze. Seve so inkubirali preko noči, reinokulirali in inducirali v pozni fazi log. 5 ur po indukciji so izmerili fluorescenco in z rezultati ugotvaljali uspešnost represije fluorescirajočega proteina – mCherry [3,7].		Za potrebe testa PFOA je morala skupina najprej vzpostaviti biosenzor. TMS iz članka, ki je prvotno definiral možnost uporabe TMS za regulacijo izražanja [5] so povezali z izražanjem fluorescirajočega proteina – v njihovem primeru GFP ter mCherry. Slednja omogočata preprosto detekcijo brez dodatnih korakov celične lize. Ustrezne plazmide za prenos v celice je ekipa zgradila s kloniranjem USER (<i>Uracil Specific Excision Reagent</i>). Slednje je osnovano na metodi PCR in tehnologiji kloniranja brez ligacije, ki omogoča sintezo plazmida z več inserti v enem koraku. Najprej željene dele pomnožimo s PCR, pri katerem uporabljamo posebej oblikovane začetne oligonukleotide, ki na 5' koncu dodajo podaljše z enim dU – delo poteka z uracil kompatibilno polimerazo (npr. X7). Produkte PCR očistimo in obdelamo z reagentom USER. Reakcija vključuje izrez podaljškov z uracilom s sledečo hibridizacijo specifičnih lepljivih koncev – slednji so lahko oblikovani različno, kar omogoča kreacijo različnih komplementarnih previsov. Skupina je pridobljene produkte klonirala v DH5α <i>E. coli</i>. Po propagaciji v bakterijah, čiščenju in validaciji s PCR ter Sanger sekvenciranju, so plazmide kotransformirali v <i>E. coli</i> BL21(DE3) za izražanje proteina. Sev je bil izbran zaradi vsebnosti IPTG inducibilne T7 polimeraze. Seve so inkubirali preko noči, reinokulirali in inducirali v pozni fazi log. 5 ur po indukciji so izmerili fluorescenco in z rezultati ugotvaljali uspešnost represije fluorescirajočega proteina – mCherry [3,7].
	Za zmanjšanje tveganja, da bo manj molekul TMS kot transkriptov za utišanje, je skupina izražala regulator TMS v plazmidu z velikim številom kopij, medtem ko so bili reporterski geni vstavljeni v plazmid z majhnim številom kopij. Posledično so dobili veliko večje število represorjev kot mRNA za utišanje, kar je izboljšalo puščanje sistema [3].		Za zmanjšanje tveganja, da bo manj molekul TMS kot transkriptov za utišanje, je skupina izražala regulator TMS v plazmidu z velikim številom kopij, medtem ko so bili reporterski geni vstavljeni v plazmid z majhnim številom kopij. Posledično so dobili veliko večje število represorjev kot mRNA za utišanje, kar je izboljšalo puščanje sistema [3].
	Za validacijo so izvedli dva sklopa eksperimentov, opisana v nadaljevanju.		Za validacijo so izvedli dva sklopa eksperimentov, opisana v nadaljevanju.

	~~Opravili so dva sklopa eksperimentov.~~

	===Izražanje mCherry v odvisnosti od GFP===		===Izražanje mCherry v odvisnosti od GFP===
Line 46:		Line 44:
	===Izražanje mCherry v odvisnosti od drugih ligandov===		===Izražanje mCherry v odvisnosti od drugih ligandov===

	Prvotni eksperiment z GFP in mCherry so modificirali za testiranje prilagoditve odvisnosti liganda z zamenjavo aptamera. Tako so v dano TMS vstavili že znana aptamerna zaporedja za mangan (dve zaporedji) in teofilin (dve zaporedji). Metoda bi morala še vedno delovati po istem načelu: v kolikor ni prisotnega vezanega liganda, se TMS poveže okoli RBS in prepreči izražanje mCherry. Ob prisotnosti ustreznega liganda TMS zaradi strukturnih ovir ni sposobna vezave in protein se prosto izraža. Rezultati so sledili postavljeni hipotezi, ob večjih koncentracijah liganda so zaznali manjšo fluorescenco [3].		Prvotni eksperiment z GFP in mCherry so modificirali za testiranje prilagoditve odvisnosti liganda z zamenjavo aptamera. Tako so v dano TMS vstavili že znana aptamerna zaporedja za mangan (dve zaporedji) in teofilin (dve zaporedji). Metoda bi morala še vedno delovati po istem načelu: v kolikor ni prisotnega vezanega liganda, se TMS poveže okoli RBS in prepreči izražanje mCherry. Ob prisotnosti ustreznega liganda TMS zaradi strukturnih ovir ni sposobna vezave in protein se prosto izraža. Rezultati so sledili postavljeni hipotezi, ob večjih koncentracijah liganda so zaznali manjšo fluorescenco [3].

	==Karakterizacija aptamera PFOA==		==Karakterizacija aptamera PFOA==

Eva Vene: /* Problematika PFAS */

2024-05-12T15:37:36Z

Problematika PFAS

← Older revision		Revision as of 15:37, 12 May 2024
Line 3:		Line 3:
	=Uvod=		=Uvod=
	==Problematika PFAS==		==Problematika PFAS==
	Per- in ~~polifluorinirane~~ alkil snovi, ki jih poznamo pod kratico PFAS, so pestra skupina sintetičnih kemikalij, ki se uporabljajo za proizvodnjo produktov s fluoropolimernimi premazi približno od leta 1950 - od posode proti prijemanju, dežnih plaščev do ognjevarnih pen.		Per- in polifluorirane alkil snovi, ki jih poznamo pod kratico PFAS, so pestra skupina sintetičnih kemikalij, ki se uporabljajo za proizvodnjo produktov s fluoropolimernimi premazi približno od leta 1950 - od posode proti prijemanju, dežnih plaščev do ognjevarnih pen.
	So dolgotrajni okoljski onesnaževalci, ki lahko povzročajo izgubo biodiverzitete, rakava obolenja in neplodnost. Gre za skupino ti. »večnih kemikalij« oziroma forever chemicals, ki so močno ali popolnoma fluorirane. Zaradi vezi C-F so zelo stabilne, kar je v določenih primerih izredno uporabna lastnost, a obenem predstavlja veliko breme za okolje – same od sebe namreč ne razpadejo, za razgradnjo večinoma potrebujejo temperature višje od 1100 <sup>o</sup>C, mikroorganizmi jih načeloma ne morejo razgraditi. Znani so tudi kot bioakumulanti in imajo za človeka številne negativne posledice [1-3].		So dolgotrajni okoljski onesnaževalci, ki lahko povzročajo izgubo biodiverzitete, rakava obolenja in neplodnost. Gre za skupino ti. »večnih kemikalij« oziroma forever chemicals, ki so močno ali popolnoma fluorirane. Zaradi vezi C-F so zelo stabilne, kar je v določenih primerih izredno uporabna lastnost, a obenem predstavlja veliko breme za okolje – same od sebe namreč ne razpadejo, za razgradnjo večinoma potrebujejo temperature višje od 1100 <sup>o</sup>C, mikroorganizmi jih načeloma ne morejo razgraditi. Znani so tudi kot bioakumulanti in imajo za človeka številne negativne posledice [1-3].

Eva Vene: /* Določanje PFAS */

2024-05-12T15:10:16Z

Določanje PFAS

← Older revision		Revision as of 15:10, 12 May 2024
Line 10:		Line 10:
	Zaenkrat se za določanje PFAS v vzorcih odpadne vode uporabljajo:		Zaenkrat se za določanje PFAS v vzorcih odpadne vode uporabljajo:
	*kromatografske metode:		*kromatografske metode:
	**LC-MS (tekočinska kromatografija in masna spektrometrija)		**LC-MS (tekočinska kromatografija in masna spektrometrija)
	**GC-MS		**GC-MS (plinska kromatografija in masna spektrometrija)
	*semi-kvantitativne metode:		*semi-kvantitativne metode:
	**TOP (total oxidizable precursor)		**TOP (total oxidizable precursor)