Gene overexpression - Revision history

Tjaša Blatnik at 17:03, 1 November 2013

2013-11-01T17:03:15Z

← Older revision		Revision as of 17:03, 1 November 2013
Line 18:		Line 18:


	TRANSFORMACIJA GLIVNEGA PROTOPLASTA P. ostreatus TD 300 Z HRF, POSREDOVANA Z PEG/CaCl2		TRANSFORMACIJA GLIVNEGA PROTOPLASTA ''P. ostreatus'' TD 300 Z HRF, POSREDOVANA Z PEG/CaCl2

	Protoplaste ''P. ostreatus'' TD 300 so suspendirali v MTC pufru. 100μl suspenzije so zmešali z 10μg DNA fragmenta. Transformante so gojili na gojišču PDA z in brez dodatka higromicina B. Za preveritev zamenjave promoterja za GLS z narejenim HRF so uporabili dve PCR reakcijski mešanici z genomsko DNA transformant kot predlogo.		Protoplaste ''P. ostreatus'' TD 300 so suspendirali v MTC pufru. 100μl suspenzije so zmešali z 10μg DNA fragmenta. Transformante so gojili na gojišču PDA z in brez dodatka higromicina B. Za preveritev zamenjave promoterja za GLS z narejenim HRF so uporabili dve PCR reakcijski mešanici z genomsko DNA transformant kot predlogo.

Tjaša Blatnik at 17:01, 1 November 2013

2013-11-01T17:01:39Z

← Older revision		Revision as of 17:01, 1 November 2013
Line 1:		Line 1:
	== '''β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in Pleurotus ostreatus Using Promoter Swapping''' ==		== '''β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in ''Pleurotus ostreatus'' Using Promoter Swapping''' ==


	'''UVOD'''		'''UVOD'''

	β-glukani so glavne strukturne komponente glivnih celičnih sten. Delujejo kot antioksidanti, uporabljajo pa se tudi kot imunološki stimulatorji zaradi antitumorskega, antibakterijskega, antivirusnega, antihiperholesterolemičnega, antidiabetičnega efekta in lovljenja prostih radikalov. Produkcija glivnih β-glukanov po naravi zelo nizka, zato se za izboljšanje uporablja genetski inženiring. Za sintezo glivnih β-glukanov je odgovorna β-1,3-glukan sintaza (GLS). GLS kompleks je sestavljen iz katalitične (FKS) in regulatorne podenote (RHO). V glivnih genomih sta FKS in RHO zelo ohranjena in imata ponavadi samo kopijo ali dve v celici. Pleurotus ostreatus je uporabna zaradi velike prilagodljivosti, produktivnosti in kratkega časa rasti. V tej študiji so s homologno rekominacijo so zamenjali promoter za gen GLS iz P. ostreatus za promoter za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (Pgpd) iz Aspergillus nidulans.		β-glukani so glavne strukturne komponente glivnih celičnih sten. Delujejo kot antioksidanti, uporabljajo pa se tudi kot imunološki stimulatorji zaradi antitumorskega, antibakterijskega, antivirusnega, antihiperholesterolemičnega, antidiabetičnega efekta in lovljenja prostih radikalov. Produkcija glivnih β-glukanov po naravi zelo nizka, zato se za izboljšanje uporablja genetski inženiring. Za sintezo glivnih β-glukanov je odgovorna β-1,3-glukan sintaza (GLS). GLS kompleks je sestavljen iz katalitične (FKS) in regulatorne podenote (RHO). V glivnih genomih sta FKS in RHO zelo ohranjena in imata ponavadi samo kopijo ali dve v celici. ''Pleurotus ostreatus'' je uporabna zaradi velike prilagodljivosti, produktivnosti in kratkega časa rasti. V tej študiji so s homologno rekominacijo so zamenjali promoter za gen GLS iz P. ostreatus za promoter za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (Pgpd) iz ''Aspergillus nidulans''.


	'''MATERIALI IN METODE'''		'''MATERIALI IN METODE'''

	Homologni rekombinantni fragment (HRF) za zamenjavo promoterja za GLS so sestavili iz petih DNA segmentov: UH, Pgpd 1035, hph, Pgpd in GLS 1025. 1015 bp dolga upstream homologna sekvenca UH je odgovarjala 3΄ koncu delne sekvence za promoter za GLS. 1035 bp dolg Pgdb 1035 je služil kot upstream FLP prepoznavna regija. To je promoter gena gpd iz Aspergillus nidulans. 2822 bp dolgo zaporedje hph je zapis za higromicin B iz ekspresijske kasete E. coli in je predstavljalo selektivni marker. 2206 bp dolgo zaporedje Pgpd so pomnožili s pomočjo plazmida pAN7-1. 1025 bp dolga downstream homologna sekvenca GLS 1025 se je vezala na 5΄konec delne sekvence P. ostreatus GLS.		Homologni rekombinantni fragment (HRF) za zamenjavo promoterja za GLS so sestavili iz petih DNA segmentov: UH, Pgpd 1035, hph, Pgpd in GLS 1025. 1015 bp dolga upstream homologna sekvenca UH je odgovarjala 3΄ koncu delne sekvence za promoter za GLS. 1035 bp dolg Pgdb 1035 je služil kot upstream FLP prepoznavna regija. To je promoter gena gpd iz ''Aspergillus nidulans''. 2822 bp dolgo zaporedje hph je zapis za higromicin B iz ekspresijske kasete E. coli in je predstavljalo selektivni marker. 2206 bp dolgo zaporedje Pgpd so pomnožili s pomočjo plazmida pAN7-1. 1025 bp dolga downstream homologna sekvenca GLS 1025 se je vezala na 5΄konec delne sekvence ''P. ostreatus'' GLS.


Line 20:		Line 20:
	TRANSFORMACIJA GLIVNEGA PROTOPLASTA P. ostreatus TD 300 Z HRF, POSREDOVANA Z PEG/CaCl2		TRANSFORMACIJA GLIVNEGA PROTOPLASTA P. ostreatus TD 300 Z HRF, POSREDOVANA Z PEG/CaCl2

	Protoplaste P. ostreatus TD 300 so suspendirali v MTC pufru. 100μl suspenzije so zmešali z 10μg DNA fragmenta. Transformante so gojili na gojišču PDA z in brez dodatka higromicina B. Za preveritev zamenjave promoterja za GLS z narejenim HRF so uporabili dve PCR reakcijski mešanici z genomsko DNA transformant kot predlogo.		Protoplaste ''P. ostreatus'' TD 300 so suspendirali v MTC pufru. 100μl suspenzije so zmešali z 10μg DNA fragmenta. Transformante so gojili na gojišču PDA z in brez dodatka higromicina B. Za preveritev zamenjave promoterja za GLS z narejenim HRF so uporabili dve PCR reakcijski mešanici z genomsko DNA transformant kot predlogo.

Tjaša Blatnik at 16:59, 1 November 2013

2013-11-01T16:59:31Z

← Older revision		Revision as of 16:59, 1 November 2013
Line 5:		Line 5:

	β-glukani so glavne strukturne komponente glivnih celičnih sten. Delujejo kot antioksidanti, uporabljajo pa se tudi kot imunološki stimulatorji zaradi antitumorskega, antibakterijskega, antivirusnega, antihiperholesterolemičnega, antidiabetičnega efekta in lovljenja prostih radikalov. Produkcija glivnih β-glukanov po naravi zelo nizka, zato se za izboljšanje uporablja genetski inženiring. Za sintezo glivnih β-glukanov je odgovorna β-1,3-glukan sintaza (GLS). GLS kompleks je sestavljen iz katalitične (FKS) in regulatorne podenote (RHO). V glivnih genomih sta FKS in RHO zelo ohranjena in imata ponavadi samo kopijo ali dve v celici. Pleurotus ostreatus je uporabna zaradi velike prilagodljivosti, produktivnosti in kratkega časa rasti. V tej študiji so s homologno rekominacijo so zamenjali promoter za gen GLS iz P. ostreatus za promoter za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (Pgpd) iz Aspergillus nidulans.		β-glukani so glavne strukturne komponente glivnih celičnih sten. Delujejo kot antioksidanti, uporabljajo pa se tudi kot imunološki stimulatorji zaradi antitumorskega, antibakterijskega, antivirusnega, antihiperholesterolemičnega, antidiabetičnega efekta in lovljenja prostih radikalov. Produkcija glivnih β-glukanov po naravi zelo nizka, zato se za izboljšanje uporablja genetski inženiring. Za sintezo glivnih β-glukanov je odgovorna β-1,3-glukan sintaza (GLS). GLS kompleks je sestavljen iz katalitične (FKS) in regulatorne podenote (RHO). V glivnih genomih sta FKS in RHO zelo ohranjena in imata ponavadi samo kopijo ali dve v celici. Pleurotus ostreatus je uporabna zaradi velike prilagodljivosti, produktivnosti in kratkega časa rasti. V tej študiji so s homologno rekominacijo so zamenjali promoter za gen GLS iz P. ostreatus za promoter za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (Pgpd) iz Aspergillus nidulans.


	'''MATERIALI IN METODE'''		'''MATERIALI IN METODE'''

	Homologni rekombinantni fragment (HRF) za zamenjavo promoterja za GLS so sestavili iz petih DNA segmentov: UH, Pgpd 1035, hph, Pgpd in GLS 1025. 1015 bp dolga upstream homologna sekvenca UH je odgovarjala 3΄ koncu delne sekvence za promoter za GLS. 1035 bp dolg Pgdb 1035 je služil kot upstream FLP prepoznavna regija. To je promoter gena gpd iz Aspergillus nidulans. 2822 bp dolgo zaporedje hph je zapis za higromicin B iz ekspresijske kasete E. coli in je predstavljalo selektivni marker. 2206 bp dolgo zaporedje Pgpd so pomnožili s pomočjo plazmida pAN7-1. 1025 bp dolga downstream homologna sekvenca GLS 1025 se je vezala na 5΄konec delne sekvence P. ostreatus GLS.		Homologni rekombinantni fragment (HRF) za zamenjavo promoterja za GLS so sestavili iz petih DNA segmentov: UH, Pgpd 1035, hph, Pgpd in GLS 1025. 1015 bp dolga upstream homologna sekvenca UH je odgovarjala 3΄ koncu delne sekvence za promoter za GLS. 1035 bp dolg Pgdb 1035 je služil kot upstream FLP prepoznavna regija. To je promoter gena gpd iz Aspergillus nidulans. 2822 bp dolgo zaporedje hph je zapis za higromicin B iz ekspresijske kasete E. coli in je predstavljalo selektivni marker. 2206 bp dolgo zaporedje Pgpd so pomnožili s pomočjo plazmida pAN7-1. 1025 bp dolga downstream homologna sekvenca GLS 1025 se je vezala na 5΄konec delne sekvence P. ostreatus GLS.


	TD-OE PCR		TD-OE PCR
Line 14:		Line 16:
	Za fuzijo petih DNA segmentov, ki so tvorili HRF, so izvedli dva cikla kombiniranega touchdown in prekrivnega PCR. V prvem delu so izvedli fuzijo treh segmentov: hph, Pgpd, in GLS 1025. Nastal je dolg fuzijski segment hPG. V drugem delu TD-OE PCR so izvedli fuzijo ostalih treh DNA segmentov: UH, Pgpd 1035 in prej pridobljenega hPG.		Za fuzijo petih DNA segmentov, ki so tvorili HRF, so izvedli dva cikla kombiniranega touchdown in prekrivnega PCR. V prvem delu so izvedli fuzijo treh segmentov: hph, Pgpd, in GLS 1025. Nastal je dolg fuzijski segment hPG. V drugem delu TD-OE PCR so izvedli fuzijo ostalih treh DNA segmentov: UH, Pgpd 1035 in prej pridobljenega hPG.
	Značilno za touchdown PCR je, da se temperatura naleganja primerjev postopno znižuje v naslednjih ciklih. Temperatura začetnih ciklov je 3-5˚C višja od Tm uporabljenih primerjev, kasneje se zniža za ravno toliko napram Tm. Višja začetna temperatura naleganja omogoča večjo specifičnost za vezanje, medtem ko se z nižanjem temperature poveča učinkovitost podaljševanja.		Značilno za touchdown PCR je, da se temperatura naleganja primerjev postopno znižuje v naslednjih ciklih. Temperatura začetnih ciklov je 3-5˚C višja od Tm uporabljenih primerjev, kasneje se zniža za ravno toliko napram Tm. Višja začetna temperatura naleganja omogoča večjo specifičnost za vezanje, medtem ko se z nižanjem temperature poveča učinkovitost podaljševanja.


	TRANSFORMACIJA GLIVNEGA PROTOPLASTA P. ostreatus TD 300 Z HRF, POSREDOVANA Z PEG/CaCl2		TRANSFORMACIJA GLIVNEGA PROTOPLASTA P. ostreatus TD 300 Z HRF, POSREDOVANA Z PEG/CaCl2

	Protoplaste P. ostreatus TD 300 so suspendirali v MTC pufru. 100μl suspenzije so zmešali z 10μg DNA fragmenta. Transformante so gojili na gojišču PDA z in brez dodatka higromicina B. Za preveritev zamenjave promoterja za GLS z narejenim HRF so uporabili dve PCR reakcijski mešanici z genomsko DNA transformant kot predlogo.		Protoplaste P. ostreatus TD 300 so suspendirali v MTC pufru. 100μl suspenzije so zmešali z 10μg DNA fragmenta. Transformante so gojili na gojišču PDA z in brez dodatka higromicina B. Za preveritev zamenjave promoterja za GLS z narejenim HRF so uporabili dve PCR reakcijski mešanici z genomsko DNA transformant kot predlogo.


	SEMIKVANTITATIVNI RT-PCR		SEMIKVANTITATIVNI RT-PCR

	Za analizo izražanja GLS v transformantah so uporabili semikvanitativni RT-PCR z manjšimi odstopanji. Celotno RNA so izolirali iz transformant. Za reverzno transkripcijo in amplifikacijo GLS so uporabili primerje GLS-F in GLS-R, za reverzno transkripcijo in amplifikacijo gospodinjskega gena β-aktina pa so uporabili primerje AC-1 in AC-2.		Za analizo izražanja GLS v transformantah so uporabili semikvanitativni RT-PCR z manjšimi odstopanji. Celotno RNA so izolirali iz transformant. Za reverzno transkripcijo in amplifikacijo GLS so uporabili primerje GLS-F in GLS-R, za reverzno transkripcijo in amplifikacijo gospodinjskega gena β-aktina pa so uporabili primerje AC-1 in AC-2.


	ANALIZA VSEBINE β-GLUKANA IN INFRARDEČI SPEKTER		ANALIZA VSEBINE β-GLUKANA IN INFRARDEČI SPEKTER

	Vsebnost polisaharidov (β-glukanov) so določevali z fenol-žveplovo kislinsko metodo, značilnosti pa karakterizirali z infrardečo spektroskopijo.		Vsebnost polisaharidov (β-glukanov) so določevali z fenol-žveplovo kislinsko metodo, značilnosti pa karakterizirali z infrardečo spektroskopijo.


	'''REZULTATI'''		'''REZULTATI'''

	DNA segmenti HRF so se uspešno zlepili skupaj, njegova velikost je obsegala 8103 bp. Samo integracijo in zamenjavo promoterjev so preverili s PCR. Naključno so izbrali šest transformant. Pričakovane pomnožitve PCR so pridobili iz druge generacije in iz pete generacije transformant. Rezultat je pokazal, da se je hph gen v HRF zbrisal v tretji generaciji. Predstavljeni Pgpd je zamenjal GLS promoter in ostal genetsko stabilen. Z RT PCR so ugotovili, da je izražanje GLS dva do štirikrat večje kot pri divjem tipu. Polisaharidni donos šestih transformant je bil ocenjen na 32% do 131% višji kot pri divjem tipu.		DNA segmenti HRF so se uspešno zlepili skupaj, njegova velikost je obsegala 8103 bp. Samo integracijo in zamenjavo promoterjev so preverili s PCR. Naključno so izbrali šest transformant. Pričakovane pomnožitve PCR so pridobili iz druge generacije in iz pete generacije transformant. Rezultat je pokazal, da se je hph gen v HRF zbrisal v tretji generaciji. Predstavljeni Pgpd je zamenjal GLS promoter in ostal genetsko stabilen. Z RT PCR so ugotovili, da je izražanje GLS dva do štirikrat večje kot pri divjem tipu. Polisaharidni donos šestih transformant je bil ocenjen na 32% do 131% višji kot pri divjem tipu.


	'''ZAKLJUČEK'''		'''ZAKLJUČEK'''

	Glavna strategija za metabolni inženiring je inženiring promoterjev. Obsega spreminjanje promoterjev za čim večjo ekspresijo ključnih genov. Uspešno se uporablja pri bakterijah in glivah. Pgpd je konstitutivni promoter, ki ga uporabljajo za različne glivne vrste in zagotavlja visoko raven konstitutivnega izražanja genov. Za izgradnjo HRF je potrebna fuzija petih do šestih DNA segmentov. Fuzije večih segmentov ponavadi izvajamo z OE PCR, vendar ta ne zmore zliti skupaj več kot dveh segmentov hkrati. V tej študiji so uporabili kombinirani metodi PCR (TD in OE) samo v dveh ciklih za fuzijo petih segmentov fragmenta, kar jim je omogočilo narediti HRF za zamenjavo GLS promoterja brez prilagoditve temperature naleganja primerjev.		Glavna strategija za metabolni inženiring je inženiring promoterjev. Obsega spreminjanje promoterjev za čim večjo ekspresijo ključnih genov. Uspešno se uporablja pri bakterijah in glivah. Pgpd je konstitutivni promoter, ki ga uporabljajo za različne glivne vrste in zagotavlja visoko raven konstitutivnega izražanja genov. Za izgradnjo HRF je potrebna fuzija petih do šestih DNA segmentov. Fuzije večih segmentov ponavadi izvajamo z OE PCR, vendar ta ne zmore zliti skupaj več kot dveh segmentov hkrati. V tej študiji so uporabili kombinirani metodi PCR (TD in OE) samo v dveh ciklih za fuzijo petih segmentov fragmenta, kar jim je omogočilo narediti HRF za zamenjavo GLS promoterja brez prilagoditve temperature naleganja primerjev.

Tjaša Blatnik at 16:58, 1 November 2013

2013-11-01T16:58:47Z

← Older revision		Revision as of 16:58, 1 November 2013
Line 1:		Line 1:
			== '''β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in Pleurotus ostreatus Using Promoter Swapping''' ==

	~~== '''β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in Pleurotus ostreatus Using Promoter Swapping''' ==~~

			'''UVOD'''

	~~UVOD~~
	β-glukani so glavne strukturne komponente glivnih celičnih sten. Delujejo kot antioksidanti, uporabljajo pa se tudi kot imunološki stimulatorji zaradi antitumorskega, antibakterijskega, antivirusnega, antihiperholesterolemičnega, antidiabetičnega efekta in lovljenja prostih radikalov. Produkcija glivnih β-glukanov po naravi zelo nizka, zato se za izboljšanje uporablja genetski inženiring. Za sintezo glivnih β-glukanov je odgovorna β-1,3-glukan sintaza (GLS). GLS kompleks je sestavljen iz katalitične (FKS) in regulatorne podenote (RHO). V glivnih genomih sta FKS in RHO zelo ohranjena in imata ponavadi samo kopijo ali dve v celici. Pleurotus ostreatus je uporabna zaradi velike prilagodljivosti, produktivnosti in kratkega časa rasti. V tej študiji so s homologno rekominacijo so zamenjali promoter za gen GLS iz P. ostreatus za promoter za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (Pgpd) iz Aspergillus nidulans.		β-glukani so glavne strukturne komponente glivnih celičnih sten. Delujejo kot antioksidanti, uporabljajo pa se tudi kot imunološki stimulatorji zaradi antitumorskega, antibakterijskega, antivirusnega, antihiperholesterolemičnega, antidiabetičnega efekta in lovljenja prostih radikalov. Produkcija glivnih β-glukanov po naravi zelo nizka, zato se za izboljšanje uporablja genetski inženiring. Za sintezo glivnih β-glukanov je odgovorna β-1,3-glukan sintaza (GLS). GLS kompleks je sestavljen iz katalitične (FKS) in regulatorne podenote (RHO). V glivnih genomih sta FKS in RHO zelo ohranjena in imata ponavadi samo kopijo ali dve v celici. Pleurotus ostreatus je uporabna zaradi velike prilagodljivosti, produktivnosti in kratkega časa rasti. V tej študiji so s homologno rekominacijo so zamenjali promoter za gen GLS iz P. ostreatus za promoter za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (Pgpd) iz Aspergillus nidulans.

	MATERIALI IN METODE		'''MATERIALI IN METODE'''

	Homologni rekombinantni fragment (HRF) za zamenjavo promoterja za GLS so sestavili iz petih DNA segmentov: UH, Pgpd 1035, hph, Pgpd in GLS 1025. 1015 bp dolga upstream homologna sekvenca UH je odgovarjala 3΄ koncu delne sekvence za promoter za GLS. 1035 bp dolg Pgdb 1035 je služil kot upstream FLP prepoznavna regija. To je promoter gena gpd iz Aspergillus nidulans. 2822 bp dolgo zaporedje hph je zapis za higromicin B iz ekspresijske kasete E. coli in je predstavljalo selektivni marker. 2206 bp dolgo zaporedje Pgpd so pomnožili s pomočjo plazmida pAN7-1. 1025 bp dolga downstream homologna sekvenca GLS 1025 se je vezala na 5΄konec delne sekvence P. ostreatus GLS.		Homologni rekombinantni fragment (HRF) za zamenjavo promoterja za GLS so sestavili iz petih DNA segmentov: UH, Pgpd 1035, hph, Pgpd in GLS 1025. 1015 bp dolga upstream homologna sekvenca UH je odgovarjala 3΄ koncu delne sekvence za promoter za GLS. 1035 bp dolg Pgdb 1035 je služil kot upstream FLP prepoznavna regija. To je promoter gena gpd iz Aspergillus nidulans. 2822 bp dolgo zaporedje hph je zapis za higromicin B iz ekspresijske kasete E. coli in je predstavljalo selektivni marker. 2206 bp dolgo zaporedje Pgpd so pomnožili s pomočjo plazmida pAN7-1. 1025 bp dolga downstream homologna sekvenca GLS 1025 se je vezala na 5΄konec delne sekvence P. ostreatus GLS.

	TD-OE PCR		TD-OE PCR

	Za fuzijo petih DNA segmentov, ki so tvorili HRF, so izvedli dva cikla kombiniranega touchdown in prekrivnega PCR. V prvem delu so izvedli fuzijo treh segmentov: hph, Pgpd, in GLS 1025. Nastal je dolg fuzijski segment hPG. V drugem delu TD-OE PCR so izvedli fuzijo ostalih treh DNA segmentov: UH, Pgpd 1035 in prej pridobljenega hPG.		Za fuzijo petih DNA segmentov, ki so tvorili HRF, so izvedli dva cikla kombiniranega touchdown in prekrivnega PCR. V prvem delu so izvedli fuzijo treh segmentov: hph, Pgpd, in GLS 1025. Nastal je dolg fuzijski segment hPG. V drugem delu TD-OE PCR so izvedli fuzijo ostalih treh DNA segmentov: UH, Pgpd 1035 in prej pridobljenega hPG.
	Značilno za touchdown PCR je, da se temperatura naleganja primerjev postopno znižuje v naslednjih ciklih. Temperatura začetnih ciklov je 3-5˚C višja od Tm uporabljenih primerjev, kasneje se zniža za ravno toliko napram Tm. Višja začetna temperatura naleganja omogoča večjo specifičnost za vezanje, medtem ko se z nižanjem temperature poveča učinkovitost podaljševanja.		Značilno za touchdown PCR je, da se temperatura naleganja primerjev postopno znižuje v naslednjih ciklih. Temperatura začetnih ciklov je 3-5˚C višja od Tm uporabljenih primerjev, kasneje se zniža za ravno toliko napram Tm. Višja začetna temperatura naleganja omogoča večjo specifičnost za vezanje, medtem ko se z nižanjem temperature poveča učinkovitost podaljševanja.

	TRANSFORMACIJA GLIVNEGA PROTOPLASTA P. ostreatus TD 300 Z HRF, POSREDOVANA Z PEG/CaCl2		TRANSFORMACIJA GLIVNEGA PROTOPLASTA P. ostreatus TD 300 Z HRF, POSREDOVANA Z PEG/CaCl2

	Protoplaste P. ostreatus TD 300 so suspendirali v MTC pufru. 100μl suspenzije so zmešali z 10μg DNA fragmenta. Transformante so gojili na gojišču PDA z in brez dodatka higromicina B. Za preveritev zamenjave promoterja za GLS z narejenim HRF so uporabili dve PCR reakcijski mešanici z genomsko DNA transformant kot predlogo.		Protoplaste P. ostreatus TD 300 so suspendirali v MTC pufru. 100μl suspenzije so zmešali z 10μg DNA fragmenta. Transformante so gojili na gojišču PDA z in brez dodatka higromicina B. Za preveritev zamenjave promoterja za GLS z narejenim HRF so uporabili dve PCR reakcijski mešanici z genomsko DNA transformant kot predlogo.

	SEMIKVANTITATIVNI RT-PCR		SEMIKVANTITATIVNI RT-PCR

	Za analizo izražanja GLS v transformantah so uporabili semikvanitativni RT-PCR z manjšimi odstopanji. Celotno RNA so izolirali iz transformant. Za reverzno transkripcijo in amplifikacijo GLS so uporabili primerje GLS-F in GLS-R, za reverzno transkripcijo in amplifikacijo gospodinjskega gena β-aktina pa so uporabili primerje AC-1 in AC-2.		Za analizo izražanja GLS v transformantah so uporabili semikvanitativni RT-PCR z manjšimi odstopanji. Celotno RNA so izolirali iz transformant. Za reverzno transkripcijo in amplifikacijo GLS so uporabili primerje GLS-F in GLS-R, za reverzno transkripcijo in amplifikacijo gospodinjskega gena β-aktina pa so uporabili primerje AC-1 in AC-2.

	ANALIZA VSEBINE β-GLUKANA IN INFRARDEČI SPEKTER		ANALIZA VSEBINE β-GLUKANA IN INFRARDEČI SPEKTER

	Vsebnost polisaharidov (β-glukanov) so določevali z fenol-žveplovo kislinsko metodo, značilnosti pa karakterizirali z infrardečo spektroskopijo.		Vsebnost polisaharidov (β-glukanov) so določevali z fenol-žveplovo kislinsko metodo, značilnosti pa karakterizirali z infrardečo spektroskopijo.

	REZULTATI		'''REZULTATI'''

	DNA segmenti HRF so se uspešno zlepili skupaj, njegova velikost je obsegala 8103 bp. Samo integracijo in zamenjavo promoterjev so preverili s PCR. Naključno so izbrali šest transformant. Pričakovane pomnožitve PCR so pridobili iz druge generacije in iz pete generacije transformant. Rezultat je pokazal, da se je hph gen v HRF zbrisal v tretji generaciji. Predstavljeni Pgpd je zamenjal GLS promoter in ostal genetsko stabilen. Z RT PCR so ugotovili, da je izražanje GLS dva do štirikrat večje kot pri divjem tipu. Polisaharidni donos šestih transformant je bil ocenjen na 32% do 131% višji kot pri divjem tipu.		DNA segmenti HRF so se uspešno zlepili skupaj, njegova velikost je obsegala 8103 bp. Samo integracijo in zamenjavo promoterjev so preverili s PCR. Naključno so izbrali šest transformant. Pričakovane pomnožitve PCR so pridobili iz druge generacije in iz pete generacije transformant. Rezultat je pokazal, da se je hph gen v HRF zbrisal v tretji generaciji. Predstavljeni Pgpd je zamenjal GLS promoter in ostal genetsko stabilen. Z RT PCR so ugotovili, da je izražanje GLS dva do štirikrat večje kot pri divjem tipu. Polisaharidni donos šestih transformant je bil ocenjen na 32% do 131% višji kot pri divjem tipu.

	ZAKLJUČEK		'''ZAKLJUČEK'''

	Glavna strategija za metabolni inženiring je inženiring promoterjev. Obsega spreminjanje promoterjev za čim večjo ekspresijo ključnih genov. Uspešno se uporablja pri bakterijah in glivah. Pgpd je konstitutivni promoter, ki ga uporabljajo za različne glivne vrste in zagotavlja visoko raven konstitutivnega izražanja genov. Za izgradnjo HRF je potrebna fuzija petih do šestih DNA segmentov. Fuzije večih segmentov ponavadi izvajamo z OE PCR, vendar ta ne zmore zliti skupaj več kot dveh segmentov hkrati. V tej študiji so uporabili kombinirani metodi PCR (TD in OE) samo v dveh ciklih za fuzijo petih segmentov fragmenta, kar jim je omogočilo narediti HRF za zamenjavo GLS promoterja brez prilagoditve temperature naleganja primerjev.		Glavna strategija za metabolni inženiring je inženiring promoterjev. Obsega spreminjanje promoterjev za čim večjo ekspresijo ključnih genov. Uspešno se uporablja pri bakterijah in glivah. Pgpd je konstitutivni promoter, ki ga uporabljajo za različne glivne vrste in zagotavlja visoko raven konstitutivnega izražanja genov. Za izgradnjo HRF je potrebna fuzija petih do šestih DNA segmentov. Fuzije večih segmentov ponavadi izvajamo z OE PCR, vendar ta ne zmore zliti skupaj več kot dveh segmentov hkrati. V tej študiji so uporabili kombinirani metodi PCR (TD in OE) samo v dveh ciklih za fuzijo petih segmentov fragmenta, kar jim je omogočilo narediti HRF za zamenjavo GLS promoterja brez prilagoditve temperature naleganja primerjev.

Tjaša Blatnik at 16:57, 1 November 2013

2013-11-01T16:57:47Z

← Older revision		Revision as of 16:57, 1 November 2013
Line 1:		Line 1:
	'''β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in Pleurotus ostreatus Using Promoter Swapping'''
			== '''β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in Pleurotus ostreatus Using Promoter Swapping''' ==


	UVOD		UVOD

Tjaša Blatnik at 16:57, 1 November 2013

2013-11-01T16:57:33Z

← Older revision		Revision as of 16:57, 1 November 2013
Line 1:		Line 1:
	β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in Pleurotus ostreatus Using Promoter Swapping		'''β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in Pleurotus ostreatus Using Promoter Swapping'''

	UVOD		UVOD

Tjaša Blatnik: New page: β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in Pleurotus ostreatus Using Promoter Swapping UVOD β-glukani so glavne strukturne komponente glivnih celičnih sten....

2013-11-01T16:57:13Z

New page: β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in Pleurotus ostreatus Using Promoter Swapping UVOD β-glukani so glavne strukturne komponente glivnih celičnih sten....

New page

β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in Pleurotus ostreatus Using Promoter Swapping

UVOD
β-glukani so glavne strukturne komponente glivnih celičnih sten. Delujejo kot antioksidanti, uporabljajo pa se tudi kot imunološki stimulatorji zaradi antitumorskega, antibakterijskega, antivirusnega, antihiperholesterolemičnega, antidiabetičnega efekta in lovljenja prostih radikalov. Produkcija glivnih β-glukanov po naravi zelo nizka, zato se za izboljšanje uporablja genetski inženiring. Za sintezo glivnih β-glukanov je odgovorna β-1,3-glukan sintaza (GLS). GLS kompleks je sestavljen iz katalitične (FKS) in regulatorne podenote (RHO). V glivnih genomih sta FKS in RHO zelo ohranjena in imata ponavadi samo kopijo ali dve v celici. Pleurotus ostreatus je uporabna zaradi velike prilagodljivosti, produktivnosti in kratkega časa rasti. V tej študiji so s homologno rekominacijo so zamenjali promoter za gen GLS iz P. ostreatus za promoter za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (Pgpd) iz Aspergillus nidulans.

MATERIALI IN METODE
Homologni rekombinantni fragment (HRF) za zamenjavo promoterja za GLS so sestavili iz petih DNA segmentov: UH, Pgpd 1035, hph, Pgpd in GLS 1025. 1015 bp dolga upstream homologna sekvenca UH je odgovarjala 3΄ koncu delne sekvence za promoter za GLS. 1035 bp dolg Pgdb 1035 je služil kot upstream FLP prepoznavna regija. To je promoter gena gpd iz Aspergillus nidulans. 2822 bp dolgo zaporedje hph je zapis za higromicin B iz ekspresijske kasete E. coli in je predstavljalo selektivni marker. 2206 bp dolgo zaporedje Pgpd so pomnožili s pomočjo plazmida pAN7-1. 1025 bp dolga downstream homologna sekvenca GLS 1025 se je vezala na 5΄konec delne sekvence P. ostreatus GLS.

TD-OE PCR
Za fuzijo petih DNA segmentov, ki so tvorili HRF, so izvedli dva cikla kombiniranega touchdown in prekrivnega PCR. V prvem delu so izvedli fuzijo treh segmentov: hph, Pgpd, in GLS 1025. Nastal je dolg fuzijski segment hPG. V drugem delu TD-OE PCR so izvedli fuzijo ostalih treh DNA segmentov: UH, Pgpd 1035 in prej pridobljenega hPG.
Značilno za touchdown PCR je, da se temperatura naleganja primerjev postopno znižuje v naslednjih ciklih. Temperatura začetnih ciklov je 3-5˚C višja od Tm uporabljenih primerjev, kasneje se zniža za ravno toliko napram Tm. Višja začetna temperatura naleganja omogoča večjo specifičnost za vezanje, medtem ko se z nižanjem temperature poveča učinkovitost podaljševanja.

TRANSFORMACIJA GLIVNEGA PROTOPLASTA P. ostreatus TD 300 Z HRF, POSREDOVANA Z PEG/CaCl2
Protoplaste P. ostreatus TD 300 so suspendirali v MTC pufru. 100μl suspenzije so zmešali z 10μg DNA fragmenta. Transformante so gojili na gojišču PDA z in brez dodatka higromicina B. Za preveritev zamenjave promoterja za GLS z narejenim HRF so uporabili dve PCR reakcijski mešanici z genomsko DNA transformant kot predlogo.

SEMIKVANTITATIVNI RT-PCR
Za analizo izražanja GLS v transformantah so uporabili semikvanitativni RT-PCR z manjšimi odstopanji. Celotno RNA so izolirali iz transformant. Za reverzno transkripcijo in amplifikacijo GLS so uporabili primerje GLS-F in GLS-R, za reverzno transkripcijo in amplifikacijo gospodinjskega gena β-aktina pa so uporabili primerje AC-1 in AC-2.

ANALIZA VSEBINE β-GLUKANA IN INFRARDEČI SPEKTER
Vsebnost polisaharidov (β-glukanov) so določevali z fenol-žveplovo kislinsko metodo, značilnosti pa karakterizirali z infrardečo spektroskopijo.

REZULTATI

DNA segmenti HRF so se uspešno zlepili skupaj, njegova velikost je obsegala 8103 bp. Samo integracijo in zamenjavo promoterjev so preverili s PCR. Naključno so izbrali šest transformant. Pričakovane pomnožitve PCR so pridobili iz druge generacije in iz pete generacije transformant. Rezultat je pokazal, da se je hph gen v HRF zbrisal v tretji generaciji. Predstavljeni Pgpd je zamenjal GLS promoter in ostal genetsko stabilen. Z RT PCR so ugotovili, da je izražanje GLS dva do štirikrat večje kot pri divjem tipu. Polisaharidni donos šestih transformant je bil ocenjen na 32% do 131% višji kot pri divjem tipu.

ZAKLJUČEK

Glavna strategija za metabolni inženiring je inženiring promoterjev. Obsega spreminjanje promoterjev za čim večjo ekspresijo ključnih genov. Uspešno se uporablja pri bakterijah in glivah. Pgpd je konstitutivni promoter, ki ga uporabljajo za različne glivne vrste in zagotavlja visoko raven konstitutivnega izražanja genov. Za izgradnjo HRF je potrebna fuzija petih do šestih DNA segmentov. Fuzije večih segmentov ponavadi izvajamo z OE PCR, vendar ta ne zmore zliti skupaj več kot dveh segmentov hkrati. V tej študiji so uporabili kombinirani metodi PCR (TD in OE) samo v dveh ciklih za fuzijo petih segmentov fragmenta, kar jim je omogočilo narediti HRF za zamenjavo GLS promoterja brez prilagoditve temperature naleganja primerjev.