Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid - Revision history

Urska.PStrnad at 19:44, 4 May 2021

2021-05-04T19:44:15Z

Urska.PStrnad at 19:41, 4 May 2021

2021-05-04T19:41:55Z

Urska.PStrnad at 19:34, 4 May 2021

2021-05-04T19:34:28Z

Urska.PStrnad at 19:31, 4 May 2021

2021-05-04T19:31:52Z

← Older revision		Revision as of 19:31, 4 May 2021
Line 56:		Line 56:
	''' Zapolnitev odprtine in tvorba nove hibridne kapside '''		''' Zapolnitev odprtine in tvorba nove hibridne kapside '''

	Odprtino v luknjasti kapsidi lahko zapolnimo z željenim homodimerom. To zmožnost so testirali tako, da so luknjastim kapsidam dodali homodimer Cp150Bo, ki ima na cisteinski ostanek na mestu 150 vezan fluorofor BODIPY. ~~Pri vzbujevalni~~ valovni dolžini 504 nm so nato merili emitirano svetlobo pri 512 nm in potrdili, da so homodimeri Cp150Bo zapolnili odprtino v kapsidi. [1]		Odprtino v luknjasti kapsidi lahko zapolnimo z željenim homodimerom. To zmožnost so testirali tako, da so luknjastim kapsidam dodali homodimer Cp150Bo, ki ima na cisteinski ostanek na mestu 150 vezan fluorofor BODIPY. Vzorce so vzbujali pri valovni dolžini 504 nm in nato merili emitirano svetlobo pri 512 nm ter potrdili, da so homodimeri Cp150Bo zapolnili odprtino v kapsidi. [1]
	=='''Zaključek''' ==		=='''Zaključek''' ==

Urska.PStrnad at 19:27, 4 May 2021

2021-05-04T19:27:55Z

← Older revision		Revision as of 19:27, 4 May 2021
Line 18:		Line 18:
	'''Elongacija'''		'''Elongacija'''

	Heksameri nato služijo kot nukleacijska jedra za nadaljnje sestavljanje z dimeri druge vrste (Cp150) pri visoki ionski moči (po dodatku NaCl). Nastane hibridna kapsida, ki ima heksamerno ~~komponentno~~ in homodimerno komponento.		Heksameri nato služijo kot nukleacijska jedra za nadaljnje sestavljanje z dimeri druge vrste (Cp150) pri visoki ionski moči (po dodatku NaCl). Nastane hibridna kapsida, ki ima heksamerno komponento in homodimerno komponento.

	'''Kapsidno telo s prečnimi povezavami'''		'''Kapsidno telo s prečnimi povezavami'''
Line 52:		Line 52:
	''' Krio-EM rekonstrukcija luknjastih kapsid '''		''' Krio-EM rekonstrukcija luknjastih kapsid '''

	Nastanek luknjastih kapsid so potrdili s krio-elektronsko mikroskopijo. Prve mikrografije so pokazale mešanico celotnih in kapsid in luknjastih kapsid. Nato so izbrali 41.057 delcev in izvedli 3D rekonstrukcijo. Rezultati so pokazali, da so prisotne kapside z dvema različnima velikostma odprtine. Pri nekaterih kapsidah je bila odprtina velika za 9 dimerov (heksamer + 3 dimeri), pri drugih pa za 18 dimerov (dvojni heksamer + pentamer). Za taka opažanja so navedli dve možni razlagi: poleg nuklecijskega heksamera so asociirali še dodatni heterodimeri ali pa so homodimeri na robu odprtine tvorili manj močne prečne povezave in so se zato odcepili skupaj s heksamerom.		Nastanek luknjastih kapsid so potrdili s krio-elektronsko mikroskopijo. Prve mikrografije so pokazale mešanico celotnih kapsid in luknjastih kapsid. Nato so izbrali 41.057 delcev in izvedli 3D rekonstrukcijo. Rezultati so pokazali, da so prisotne kapside z dvema različnima velikostma odprtine. Pri nekaterih kapsidah je bila odprtina velika za 9 dimerov (heksamer + 3 dimeri), pri drugih pa za 18 dimerov (dvojni heksamer + pentamer). Za taka opažanja so navedli dve možni razlagi: poleg nuklecijskega heksamera so asociirali še dodatni heterodimeri ali pa so homodimeri na robu odprtine tvorili manj močne prečne povezave in so se zato odcepili skupaj s heksamerom.

	''' Zapolnitev odprtine in tvorba nove hibridne kapside '''		''' Zapolnitev odprtine in tvorba nove hibridne kapside '''

Urska.PStrnad at 01:39, 4 May 2021

2021-05-04T01:39:14Z

← Older revision		Revision as of 01:39, 4 May 2021
Line 5:		Line 5:

	Simetrični proteinski kompleksi so zelo pogosti v bioloških sistemih. Omogočajo kompartmentizacijo in izvajajo kompleksne naloge. Takšni naravni sistemi služijo kot osnova za razvoj nanotehnologij na področju dostavnih sistemov zdravil, transporta energije in shranjevanja informacij. Uporabna platforma za raziskovanje na tem področju so simetrične virusne kapside in način njihovega (samo)sestavljanja. Številne virusne kapside imajo ikozaedrično simetrično obliko, osnovna gradbena komponenta pa je le ena (kapsida je torej sestavljena iz samih enakih proteinov). Prednost virusnih kapsid je preprosta zgradba, vendar pa simetrične podenote precej omejujejo nadzor nad samim sestavljanjem, s tem pa je omejen tudi razvoj aplikacij, pri katerih bi želeli v kapsido vstaviti določeno informacijo ali 'tovor' (uporabno molekulo/učinkovino). Rešitev tega problema je zasnova nadzorovane poti sestavljanja kapside, ki bi potekala po korakih z vmesnimi 'stop točkami', od katerih bi reakcija potekala dalje le, če bi vsakič zagotovili ustrezne kemijske pogoje. [1]		Simetrični proteinski kompleksi so zelo pogosti v bioloških sistemih. Omogočajo kompartmentizacijo in izvajajo kompleksne naloge. Takšni naravni sistemi služijo kot osnova za razvoj nanotehnologij na področju dostavnih sistemov zdravil, transporta energije in shranjevanja informacij. Uporabna platforma za raziskovanje na tem področju so simetrične virusne kapside in način njihovega (samo)sestavljanja. Številne virusne kapside imajo ikozaedrično simetrično obliko, osnovna gradbena komponenta pa je le ena (kapsida je torej sestavljena iz samih enakih proteinov). Prednost virusnih kapsid je preprosta zgradba, vendar pa simetrične podenote precej omejujejo nadzor nad samim sestavljanjem, s tem pa je omejen tudi razvoj aplikacij, pri katerih bi želeli v kapsido vstaviti določeno informacijo ali 'tovor' (uporabno molekulo/učinkovino). Rešitev tega problema je zasnova nadzorovane poti sestavljanja kapside, ki bi potekala po korakih z vmesnimi 'stop točkami', od katerih bi reakcija potekala dalje le, če bi vsakič zagotovili ustrezne kemijske pogoje. [1]

	Sestavljanje kapside poteka v dveh fazah (faza nukleacije in faza elongacije), ne vsebuje pa nobenih vmesnih stopenj, kjer bi se reakcija ustavila in bi lahko poljubno modificirali intermediate sestavljanja. Zhao, Wang in sod. so se problema lotili tako, da so kot modelni sistem uporabili virus hepatitisa B (HBV) in proces spontanega sestavljanja virusne kapside ločili na več nadzorovanih korakov. Kapsido HBV sestavljajo homodimerne podenote. Glede na število dimernih podenot pa ločimo dve različni kapsidi HBV, ena ima 90 dimernih podenot, druga pa 120. Slednja v naravi prevladuje, saj je tudi sestavni del infektivnega viriona. Dimeri interagirajo, ko se konec kontaktnega heliksa enega dimera prilega v utor, ki ga tvori kontaktni heliks sosednjega dimera. Vsak dimer ima torej na vsaki strani en kontaktni heliks. Osnovna ideja je, da vsakega od monomerov (ki skupaj tvorita dimer) zasnujemo različno. Dobimo heterodimer, v katerem različna monomera za povezovanje z drugimi dimeri potrebujeta različne specifične pogoje. Posledično lahko s spreminjanjem pogojev reakcije nadzorujemo sestavljanje kapside. Avtorji članka so dizajnirali heterodimer in ga uporabili za tvorbo manjšega kompleksa, ki služi kot nukleacijski kompleks (jedro), okoli katerega se sestavi virusna kapsida. Tako sestavljena kapsida ima dva ločena dela – heterodimerni in homodimerni – in je analogna Janusovemu delcu. [1] Za Janusov delec je namreč značilno, da ga sestavljata vsaj dva dela, ki se razlikujeta v fizikalnih in kemijskih lastnostih. [2] Različne kemijske lastnosti dveh različnih delov omogočajo nadaljnje modifikacije, razstavljanje in ponovno sestavljanje kapside. [1]		Sestavljanje kapside poteka v dveh fazah (faza nukleacije in faza elongacije), ne vsebuje pa nobenih vmesnih stopenj, kjer bi se reakcija ustavila in bi lahko poljubno modificirali intermediate sestavljanja. Zhao, Wang in sod. so se problema lotili tako, da so kot modelni sistem uporabili virus hepatitisa B (HBV) in proces spontanega sestavljanja virusne kapside ločili na več nadzorovanih korakov. Kapsido HBV sestavljajo homodimerne podenote. Glede na število dimernih podenot pa ločimo dve različni kapsidi HBV, ena ima 90 dimernih podenot, druga pa 120. Slednja v naravi prevladuje, saj je tudi sestavni del infektivnega viriona. Dimeri interagirajo, ko se konec kontaktnega heliksa enega dimera prilega v utor, ki ga tvori kontaktni heliks sosednjega dimera. Vsak dimer ima torej na vsaki strani en kontaktni heliks. Osnovna ideja je, da vsakega od monomerov (ki skupaj tvorita dimer) zasnujemo različno. Dobimo heterodimer, v katerem različna monomera za povezovanje z drugimi dimeri potrebujeta različne specifične pogoje. Posledično lahko s spreminjanjem pogojev reakcije nadzorujemo sestavljanje kapside. Avtorji članka so dizajnirali heterodimer in ga uporabili za tvorbo manjšega kompleksa, ki služi kot nukleacijski kompleks (jedro), okoli katerega se sestavi virusna kapsida. Tako sestavljena kapsida ima dva ločena dela – heterodimerni in homodimerni – in je analogna Janusovemu delcu. [1] Za Janusov delec je namreč značilno, da ga sestavljata vsaj dva dela, ki se razlikujeta v fizikalnih in kemijskih lastnostih. [2] Različne kemijske lastnosti dveh različnih delov omogočajo nadaljnje modifikacije, razstavljanje in ponovno sestavljanje kapside. [1]

Urska.PStrnad at 01:38, 4 May 2021

2021-05-04T01:38:45Z

← Older revision		Revision as of 01:38, 4 May 2021
Line 29:		Line 29:
	'''Modificiranje, ponovna zapolnitev površine'''		'''Modificiranje, ponovna zapolnitev površine'''

	Takšno kapsido lahko dodatno modificiramo in/ali ponovno zapolnimo odprtino z drugačnimi podenotami, ki imajo za nas uporabne lastnosti.[1]		Takšno kapsido lahko dodatno modificiramo in/ali ponovno zapolnimo odprtino z drugačnimi podenotami, ki imajo za nas uporabne lastnosti. [1]

	==''' Izvedba eksperimenta '''==		==''' Izvedba eksperimenta '''==

Urska.PStrnad: New page: ''Povzeto po članku:'' Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (...

2021-05-04T01:30:06Z

New page: ''Povzeto po članku:'' Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (...

New page

''Povzeto po članku:'' Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20862-1

== '''Uvod''' ==

Simetrični proteinski kompleksi so zelo pogosti v bioloških sistemih. Omogočajo kompartmentizacijo in izvajajo kompleksne naloge. Takšni naravni sistemi služijo kot osnova za razvoj nanotehnologij na področju dostavnih sistemov zdravil, transporta energije in shranjevanja informacij. Uporabna platforma za raziskovanje na tem področju so simetrične virusne kapside in način njihovega (samo)sestavljanja. Številne virusne kapside imajo ikozaedrično simetrično obliko, osnovna gradbena komponenta pa je le ena (kapsida je torej sestavljena iz samih enakih proteinov). Prednost virusnih kapsid je preprosta zgradba, vendar pa simetrične podenote precej omejujejo nadzor nad samim sestavljanjem, s tem pa je omejen tudi razvoj aplikacij, pri katerih bi želeli v kapsido vstaviti določeno informacijo ali 'tovor' (uporabno molekulo/učinkovino). Rešitev tega problema je zasnova nadzorovane poti sestavljanja kapside, ki bi potekala po korakih z vmesnimi 'stop točkami', od katerih bi reakcija potekala dalje le, če bi vsakič zagotovili ustrezne kemijske pogoje. [1]
Sestavljanje kapside poteka v dveh fazah (faza nukleacije in faza elongacije), ne vsebuje pa nobenih vmesnih stopenj, kjer bi se reakcija ustavila in bi lahko poljubno modificirali intermediate sestavljanja. Zhao, Wang in sod. so se problema lotili tako, da so kot modelni sistem uporabili virus hepatitisa B (HBV) in proces spontanega sestavljanja virusne kapside ločili na več nadzorovanih korakov. Kapsido HBV sestavljajo homodimerne podenote. Glede na število dimernih podenot pa ločimo dve različni kapsidi HBV, ena ima 90 dimernih podenot, druga pa 120. Slednja v naravi prevladuje, saj je tudi sestavni del infektivnega viriona. Dimeri interagirajo, ko se konec kontaktnega heliksa enega dimera prilega v utor, ki ga tvori kontaktni heliks sosednjega dimera. Vsak dimer ima torej na vsaki strani en kontaktni heliks. Osnovna ideja je, da vsakega od monomerov (ki skupaj tvorita dimer) zasnujemo različno. Dobimo heterodimer, v katerem različna monomera za povezovanje z drugimi dimeri potrebujeta različne specifične pogoje. Posledično lahko s spreminjanjem pogojev reakcije nadzorujemo sestavljanje kapside. Avtorji članka so dizajnirali heterodimer in ga uporabili za tvorbo manjšega kompleksa, ki služi kot nukleacijski kompleks (jedro), okoli katerega se sestavi virusna kapsida. Tako sestavljena kapsida ima dva ločena dela – heterodimerni in homodimerni – in je analogna Janusovemu delcu. [1] Za Janusov delec je namreč značilno, da ga sestavljata vsaj dva dela, ki se razlikujeta v fizikalnih in kemijskih lastnostih. [2] Različne kemijske lastnosti dveh različnih delov omogočajo nadaljnje modifikacije, razstavljanje in ponovno sestavljanje kapside. [1]

== '''Načrtovanje poti sestavljanja asimetrične kapside''' ==

Za nadzorovano pot sestavljanja potrebujemo način za iniciacijo sestavljanja oz. povezovanja določenih komponent in način za ustavitev (in morebitni ponovni zagon) sestavljanja na določeni stopnji reakcije. Avtorji so zasnovali asimetrično pot sestavljanja, ki vodi od posameznih asimetričnih podenot (heterodimerov) do asimetrične luknjaste kapside in na koncu do asimetrične celotne kapside (z zapolnjeno luknjo). Kot že omenjeno, so uporabili model kapside virusa hepatitisa B. [1] Osnovna gradbena komponenta njegove kapside je protein kapside, ki vsebuje 183 aminokislinskih ostankov. 149 aminokislinskih ostankov na N-koncu predstavlja domeno Cp149, ki je odgovorna za sestavljanje (t.i. assembly domain). Aminokislinski ostanki na C-koncu (od 150 do 183) pa so bogati z argininom in imajo sposobnost vezave na nukleinsko kislino. [3] Uporabili so samo domeno Cp149, ki so jo modificirali tako, da so iz homodimerne podenote dobili heterodimerno podenoto Cp149HisCp149Y132A. Prvi monomer ima vezano oznako His-Tag. Tako kot dimer divjega tipa ima sposobnost sestavljanja v odvisnosti od ionske moči, poleg tega je zaradi histidinske oznake občutljiv na Ni2+ ione. Drugi monomer ima mutacijo tirozina v alanin na mestu 132. Mutacija inhibira sposobnost sestavljanja, saj povzroči izgubo hidrofobne površine, ki je potrebna za ustrezno interakcijo z drugimi podenotami. Kljub temu, pa se lahko vseeno povezuje z dimeri divjega tipa v manj stabilne kapside.

'''Nukleacija'''

Pot je zasnovana tako, da se asimetrični dimeri začnejo sestavljati ob dodatku Ni2+ ionov. Nastanejo heksameri, ki pa se ne sestavljajo več naprej, zaradi vpliva mutacije Y132A.

'''Elongacija'''

Heksameri nato služijo kot nukleacijska jedra za nadaljnje sestavljanje z dimeri druge vrste (Cp150) pri visoki ionski moči (po dodatku NaCl). Nastane hibridna kapsida, ki ima heksamerno komponentno in homodimerno komponento.

'''Kapsidno telo s prečnimi povezavami'''

Homodimerna komponenta je ločeno stabilizirana, saj so uporabili homodimere (Cp150), ki spontano tvorijo prečne povezave. Protein Cp150 je različica Cp149, ki na C-koncu vsebuje dodatni cisteinski ostanek in omogoča disulfidne prečne povezave med homodimeri Cp150. Tak homodimerni del hibridne kapside je stabilen ob nizki ionski jakosti in tretiranju s sečnino.

'''Odstranitev nukleacijskega jedra'''

Heterodimerni del kapside ne vsebuje dodatnega cisteinskega ostanka in ne more tvoriti prečnih povezav, zato ga lahko nadzorovano odstranimo, ostane pa luknjasta kapsida.

'''Modificiranje, ponovna zapolnitev površine'''

Takšno kapsido lahko dodatno modificiramo in/ali ponovno zapolnimo odprtino z drugačnimi podenotami, ki imajo za nas uporabne lastnosti.[1]

==''' Izvedba eksperimenta '''==

'''Čiščenje in karakterizacija heterodimera Cp149HisCp149Y132A '''

Za sintezo željenega heterodimera so zasnovali bicistronski ekspresijski plazmid, ki je vseboval en promotor, ki sta mu sledila gena za vsak monomer posebej (Cp149His in Cp149Y132A). Vsak gen je imel tudi svojo ribosom vezavno domeno. Po ekspresiji v celicah E. coli so izvedli velikostno izključitveno kromatografijo, da so odstranili Cp149His homodimere in nikljevo afinitetno kromatografijo, da so odstranili Cp149Y132A homodimere. Izvedli so tudi poliakrilamidno gelsko elektroforezo in masno spektrometrijo, da so preverili dobljen produkt.

''' Sestavljanje heterodimerov Cp149HisCp149Y132A v heksamer '''

Da bi ugotovili karakteristike sestavljanja modificiranih heterodimerov, so najprej primerjali sestavljanje modificiranih heterodimerov in homodimerov divjega tipa pri visoki ionski moči. Kot je pričakovano, so ugotovili, da heterodimer v takšnih pogojih ne tvori kapside in drugih stabilnih intermedatov, medtem ko se nativni homodimeri uspešno sestavijo v kapsido. Nato so preizkusili še sestavljanje modificiranih heterodimerov v odvisnosti od Ni2+ ionov pri nizki ionski moči. Z velikostno izključitveno kromatografijo so ugotovili, da se heterodimeri združujejo v komplekse, večje od dimerov. Najbolj zastopani kompleksi so bili prosti dimeri, dimeri dimerov, heksameri in samo nekaj domnevnih dvojnih heksamerov. Večje komplekse so izolirali in ustreznost potrdili z elektronsko mikroskopijo z negativnim kontrastiranjem.

''' Sestavljanje Cp149HisCp149Y132A heksamerov s homodimeri Cp150 '''

Čeprav mutacija kontaktnega heliksa Y132A onemogoča samostojno sestavljanje, je možno sestavljanje s homodimeri Cp150. Vsak homodimer naj bi z nukleacijskim heksamernim kompleksov tvoril dva kontakta, od katerih je le eden onemogočen zaradi mutacije Y132A. Mutacija torej oslabi začetne korake nadaljnjega sestavljanja, vendar ga ne prepreči.

''' Pretvorba hibridne kapside v luknjasto kapsido '''

Avtorji so postavili hipotezo, da bo homodimerni del kapside ostal nespremenjen tudi po odstranitvi heterodimernega heksamera. To so preverili tako, da so heterodimerne heksamere odstranili z mešanico 100 µM EDTA in 3M sečnine. EDTA prekine z Ni2+ ioni posredovane interakcije med histidinskimi oznakami, sečnina pa oslabi interakcije med posameznimi heterodimeri, zato Cp149HisCp149Y132A dimeri disociirajo od hibridne kapside.

''' Krio-EM rekonstrukcija luknjastih kapsid '''

Nastanek luknjastih kapsid so potrdili s krio-elektronsko mikroskopijo. Prve mikrografije so pokazale mešanico celotnih in kapsid in luknjastih kapsid. Nato so izbrali 41.057 delcev in izvedli 3D rekonstrukcijo. Rezultati so pokazali, da so prisotne kapside z dvema različnima velikostma odprtine. Pri nekaterih kapsidah je bila odprtina velika za 9 dimerov (heksamer + 3 dimeri), pri drugih pa za 18 dimerov (dvojni heksamer + pentamer). Za taka opažanja so navedli dve možni razlagi: poleg nuklecijskega heksamera so asociirali še dodatni heterodimeri ali pa so homodimeri na robu odprtine tvorili manj močne prečne povezave in so se zato odcepili skupaj s heksamerom.

''' Zapolnitev odprtine in tvorba nove hibridne kapside '''

Odprtino v luknjasti kapsidi lahko zapolnimo z željenim homodimerom. To zmožnost so testirali tako, da so luknjastim kapsidam dodali homodimer Cp150Bo, ki ima na cisteinski ostanek na mestu 150 vezan fluorofor BODIPY. Pri vzbujevalni valovni dolžini 504 nm so nato merili emitirano svetlobo pri 512 nm in potrdili, da so homodimeri Cp150Bo zapolnili odprtino v kapsidi. [1]
=='''Zaključek''' ==

Simetrične podenote se pogosto spontano sestavijo v simetrične kapside, brez vmesnih stopenj. Avtorji članka so predstavili pot sestavljanja, ki so jo razdelili na ločene reakcije, ki jih lahko nadzorujemo. Tak proces bi lahko uporabili v mnogih uporabnih aplikacijah, npr. pakiranje učinkovin v luknjaste kapside, ki bi jih uporabili kot dostavni sistem za zdravila, ali pa bi odprtine v kapsidi zapolnili z dimeri z uporabnimi površinskimi/kemijskimi lastnostmi. Asimetrične kapside tako lahko odprejo vrata sintezi organiziranih, multi-funkcionalnih delcev.

==''' Viri '''==
[1] Zhao, Z., Wang, J.CY., Zhang, M. et al. Asymmetrizing an icosahedral virus capsid by hierarchical assembly of subunits with designed asymmetry. Nat Commun 12, 589 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20862-1

[2] H. Su, C. A. Hurd Price, L. Jing, Q. Tian, J. Liu, and K. Qian, “Janus particles: design, preparation, and biomedical applications,” Mater. Today Bio, vol. 4, no. July, 2019, doi: 10.1016/j.mtbio.2019.100033.

[3] Z. Tan, K. Pionek, N. Unchwaniwala, M. L. Maguire, D. D. Loeb, and A. Zlotnick, “The Interface between Hepatitis B Virus Capsid Proteins Affects Self-Assembly, Pregenomic RNA Packaging, and Reverse Transcription,” J. Virol., vol. 89, no. 6, pp. 3275–3284, 2015, doi: 10.1128/jvi.03545-14.

← Older revision		Revision as of 19:44, 4 May 2021
Line 10:		Line 10:
	== '''Načrtovanje poti sestavljanja asimetrične kapside''' ==		== '''Načrtovanje poti sestavljanja asimetrične kapside''' ==

	Za nadzorovano pot sestavljanja potrebujemo način za iniciacijo sestavljanja oz. povezovanja določenih komponent in način za ustavitev (in morebitni ponovni zagon) sestavljanja na določeni stopnji reakcije. Avtorji so zasnovali asimetrično pot sestavljanja, ki vodi od posameznih asimetričnih podenot (heterodimerov) do asimetrične luknjaste kapside in na koncu do asimetrične celotne kapside (z zapolnjeno luknjo). Kot že omenjeno, so uporabili model kapside virusa hepatitisa B. [1] Osnovna gradbena komponenta njegove kapside je protein kapside, ki vsebuje 183 aminokislinskih ostankov. 149 aminokislinskih ostankov na N-koncu predstavlja domeno Cp149, ki je odgovorna za sestavljanje (t.i. assembly domain). Aminokislinski ostanki na C-koncu (od 150 do 183) pa so bogati z argininom in imajo sposobnost vezave na nukleinsko kislino. [3] Uporabili so samo domeno Cp149, ki so jo modificirali tako, da so iz homodimerne podenote dobili heterodimerno podenoto Cp149<sub>His</sub>Cp149<sub>Y132A</sub>. Prvi monomer ima vezano oznako His-Tag. Tako kot dimer divjega tipa ima sposobnost sestavljanja v odvisnosti od ionske moči, poleg tega je zaradi histidinske oznake občutljiv na ~~Ni2~~+ ione. Drugi monomer ima mutacijo tirozina v alanin na mestu 132. Mutacija inhibira sposobnost sestavljanja, saj povzroči izgubo hidrofobne površine, ki je potrebna za ustrezno interakcijo z drugimi podenotami. Kljub temu, pa se lahko vseeno povezuje z dimeri divjega tipa v manj stabilne kapside.		Za nadzorovano pot sestavljanja potrebujemo način za iniciacijo sestavljanja oz. povezovanja določenih komponent in način za ustavitev (in morebitni ponovni zagon) sestavljanja na določeni stopnji reakcije. Avtorji so zasnovali asimetrično pot sestavljanja, ki vodi od posameznih asimetričnih podenot (heterodimerov) do asimetrične luknjaste kapside in na koncu do asimetrične celotne kapside (z zapolnjeno luknjo). Kot že omenjeno, so uporabili model kapside virusa hepatitisa B. [1] Osnovna gradbena komponenta njegove kapside je protein kapside, ki vsebuje 183 aminokislinskih ostankov. 149 aminokislinskih ostankov na N-koncu predstavlja domeno Cp149, ki je odgovorna za sestavljanje (t.i. assembly domain). Aminokislinski ostanki na C-koncu (od 150 do 183) pa so bogati z argininom in imajo sposobnost vezave na nukleinsko kislino. [3] Uporabili so samo domeno Cp149, ki so jo modificirali tako, da so iz homodimerne podenote dobili heterodimerno podenoto Cp149<sub>His</sub>Cp149<sub>Y132A</sub>. Prvi monomer ima vezano oznako His-Tag. Tako kot dimer divjega tipa ima sposobnost sestavljanja v odvisnosti od ionske moči, poleg tega je zaradi histidinske oznake občutljiv na Ni<sup>2+</sup> ione. Drugi monomer ima mutacijo tirozina v alanin na mestu 132. Mutacija inhibira sposobnost sestavljanja, saj povzroči izgubo hidrofobne površine, ki je potrebna za ustrezno interakcijo z drugimi podenotami. Kljub temu, pa se lahko vseeno povezuje z dimeri divjega tipa v manj stabilne kapside.

	'''Nukleacija''' <br>		'''Nukleacija''' <br>
	Pot je zasnovana tako, da se asimetrični dimeri začnejo sestavljati ob dodatku ~~Ni2~~+ ionov. Nastanejo heksameri, ki pa se ne sestavljajo več naprej, zaradi vpliva mutacije Y132A.		Pot je zasnovana tako, da se asimetrični dimeri začnejo sestavljati ob dodatku Ni<sup>2+</sup> ionov. Nastanejo heksameri, ki pa se ne sestavljajo več naprej, zaradi vpliva mutacije Y132A.

	'''Elongacija''' <br>		'''Elongacija''' <br>
Line 33:		Line 33:

	''' Sestavljanje heterodimerov Cp149<sub>His</sub>Cp149<sub>Y132A</sub> v heksamer ''' <br>		''' Sestavljanje heterodimerov Cp149<sub>His</sub>Cp149<sub>Y132A</sub> v heksamer ''' <br>
	Da bi ugotovili karakteristike sestavljanja modificiranih heterodimerov, so najprej primerjali sestavljanje modificiranih heterodimerov in homodimerov divjega tipa pri visoki ionski moči. Kot je pričakovano, so ugotovili, da heterodimer v takšnih pogojih ne tvori kapside in drugih stabilnih intermedatov, medtem ko se nativni homodimeri uspešno sestavijo v kapsido. Nato so preizkusili še sestavljanje modificiranih heterodimerov v odvisnosti od ~~Ni2~~+ ionov pri nizki ionski moči. Z velikostno izključitveno kromatografijo so ugotovili, da se heterodimeri združujejo v komplekse, večje od dimerov. Najbolj zastopani kompleksi so bili prosti dimeri, dimeri dimerov, heksameri in samo nekaj domnevnih dvojnih heksamerov. Večje komplekse so izolirali in ustreznost potrdili z elektronsko mikroskopijo z negativnim kontrastiranjem.		Da bi ugotovili karakteristike sestavljanja modificiranih heterodimerov, so najprej primerjali sestavljanje modificiranih heterodimerov in homodimerov divjega tipa pri visoki ionski moči. Kot je pričakovano, so ugotovili, da heterodimer v takšnih pogojih ne tvori kapside in drugih stabilnih intermedatov, medtem ko se nativni homodimeri uspešno sestavijo v kapsido. Nato so preizkusili še sestavljanje modificiranih heterodimerov v odvisnosti od Ni<sup>2+</sup> ionov pri nizki ionski moči. Z velikostno izključitveno kromatografijo so ugotovili, da se heterodimeri združujejo v komplekse, večje od dimerov. Najbolj zastopani kompleksi so bili prosti dimeri, dimeri dimerov, heksameri in samo nekaj domnevnih dvojnih heksamerov. Večje komplekse so izolirali in ustreznost potrdili z elektronsko mikroskopijo z negativnim kontrastiranjem.

	''' Sestavljanje Cp149<sub>His</sub>Cp149<sub>Y132A</sub> heksamerov s homodimeri Cp150 ''' <br>		''' Sestavljanje Cp149<sub>His</sub>Cp149<sub>Y132A</sub> heksamerov s homodimeri Cp150 ''' <br>
Line 39:		Line 39:

	''' Pretvorba hibridne kapside v luknjasto kapsido ''' <br>		''' Pretvorba hibridne kapside v luknjasto kapsido ''' <br>
	Avtorji so postavili hipotezo, da bo homodimerni del kapside ostal nespremenjen tudi po odstranitvi heterodimernega heksamera. To so preverili tako, da so heterodimerne heksamere odstranili z mešanico 100 µM EDTA in 3M sečnine. EDTA prekine z ~~Ni2~~+ ioni posredovane interakcije med histidinskimi oznakami, sečnina pa oslabi interakcije med posameznimi heterodimeri, zato Cp149<sub>His</sub>Cp149<sub>Y132A</sub> dimeri disociirajo od hibridne kapside.		Avtorji so postavili hipotezo, da bo homodimerni del kapside ostal nespremenjen tudi po odstranitvi heterodimernega heksamera. To so preverili tako, da so heterodimerne heksamere odstranili z mešanico 100 µM EDTA in 3M sečnine. EDTA prekine z Ni<sup>2+</sup> ioni posredovane interakcije med histidinskimi oznakami, sečnina pa oslabi interakcije med posameznimi heterodimeri, zato Cp149<sub>His</sub>Cp149<sub>Y132A</sub> dimeri disociirajo od hibridne kapside.

	''' Krio-EM rekonstrukcija luknjastih kapsid ''' <br>		''' Krio-EM rekonstrukcija luknjastih kapsid ''' <br>

← Older revision		Revision as of 19:41, 4 May 2021
Line 10:		Line 10:
	== '''Načrtovanje poti sestavljanja asimetrične kapside''' ==		== '''Načrtovanje poti sestavljanja asimetrične kapside''' ==

	Za nadzorovano pot sestavljanja potrebujemo način za iniciacijo sestavljanja oz. povezovanja določenih komponent in način za ustavitev (in morebitni ponovni zagon) sestavljanja na določeni stopnji reakcije. Avtorji so zasnovali asimetrično pot sestavljanja, ki vodi od posameznih asimetričnih podenot (heterodimerov) do asimetrične luknjaste kapside in na koncu do asimetrične celotne kapside (z zapolnjeno luknjo). Kot že omenjeno, so uporabili model kapside virusa hepatitisa B. [1] Osnovna gradbena komponenta njegove kapside je protein kapside, ki vsebuje 183 aminokislinskih ostankov. 149 aminokislinskih ostankov na N-koncu predstavlja domeno Cp149, ki je odgovorna za sestavljanje (t.i. assembly domain). Aminokislinski ostanki na C-koncu (od 150 do 183) pa so bogati z argininom in imajo sposobnost vezave na nukleinsko kislino. [3] Uporabili so samo domeno Cp149, ki so jo modificirali tako, da so iz homodimerne podenote dobili heterodimerno podenoto ~~Cp149HisCp149Y132A~~. Prvi monomer ima vezano oznako His-Tag. Tako kot dimer divjega tipa ima sposobnost sestavljanja v odvisnosti od ionske moči, poleg tega je zaradi histidinske oznake občutljiv na Ni2+ ione. Drugi monomer ima mutacijo tirozina v alanin na mestu 132. Mutacija inhibira sposobnost sestavljanja, saj povzroči izgubo hidrofobne površine, ki je potrebna za ustrezno interakcijo z drugimi podenotami. Kljub temu, pa se lahko vseeno povezuje z dimeri divjega tipa v manj stabilne kapside.		Za nadzorovano pot sestavljanja potrebujemo način za iniciacijo sestavljanja oz. povezovanja določenih komponent in način za ustavitev (in morebitni ponovni zagon) sestavljanja na določeni stopnji reakcije. Avtorji so zasnovali asimetrično pot sestavljanja, ki vodi od posameznih asimetričnih podenot (heterodimerov) do asimetrične luknjaste kapside in na koncu do asimetrične celotne kapside (z zapolnjeno luknjo). Kot že omenjeno, so uporabili model kapside virusa hepatitisa B. [1] Osnovna gradbena komponenta njegove kapside je protein kapside, ki vsebuje 183 aminokislinskih ostankov. 149 aminokislinskih ostankov na N-koncu predstavlja domeno Cp149, ki je odgovorna za sestavljanje (t.i. assembly domain). Aminokislinski ostanki na C-koncu (od 150 do 183) pa so bogati z argininom in imajo sposobnost vezave na nukleinsko kislino. [3] Uporabili so samo domeno Cp149, ki so jo modificirali tako, da so iz homodimerne podenote dobili heterodimerno podenoto Cp149<sub>His</sub>Cp149<sub>Y132A</sub>. Prvi monomer ima vezano oznako His-Tag. Tako kot dimer divjega tipa ima sposobnost sestavljanja v odvisnosti od ionske moči, poleg tega je zaradi histidinske oznake občutljiv na Ni2+ ione. Drugi monomer ima mutacijo tirozina v alanin na mestu 132. Mutacija inhibira sposobnost sestavljanja, saj povzroči izgubo hidrofobne površine, ki je potrebna za ustrezno interakcijo z drugimi podenotami. Kljub temu, pa se lahko vseeno povezuje z dimeri divjega tipa v manj stabilne kapside.

	'''Nukleacija''' <br>		'''Nukleacija''' <br>
Line 29:		Line 29:
	==''' Izvedba eksperimenta '''==		==''' Izvedba eksperimenta '''==

	'''Čiščenje in karakterizacija heterodimera ~~Cp149HisCp149Y132A~~ ''' <br>		'''Čiščenje in karakterizacija heterodimera Cp149<sub>His</sub>Cp149<sub>Y132A</sub> ''' <br>
	Za sintezo željenega heterodimera so zasnovali bicistronski ekspresijski plazmid, ki je vseboval en promotor, ki sta mu sledila gena za vsak monomer posebej (~~Cp149His~~ in ~~Cp149Y132A~~). Vsak gen je imel tudi svojo ribosom vezavno domeno. Po ekspresiji v celicah E. coli so izvedli velikostno izključitveno kromatografijo, da so odstranili ~~Cp149His~~ homodimere in nikljevo afinitetno kromatografijo, da so odstranili ~~Cp149Y132A~~ homodimere. Izvedli so tudi poliakrilamidno gelsko elektroforezo in masno spektrometrijo, da so preverili dobljen produkt.		Za sintezo željenega heterodimera so zasnovali bicistronski ekspresijski plazmid, ki je vseboval en promotor, ki sta mu sledila gena za vsak monomer posebej (Cp149<sub>His</sub> in Cp149<sub>Y132A</sub>). Vsak gen je imel tudi svojo ribosom vezavno domeno. Po ekspresiji v celicah E. coli so izvedli velikostno izključitveno kromatografijo, da so odstranili Cp149<sub>His</sub> homodimere in nikljevo afinitetno kromatografijo, da so odstranili Cp149<sub>Y132A</sub> homodimere. Izvedli so tudi poliakrilamidno gelsko elektroforezo in masno spektrometrijo, da so preverili dobljen produkt.

	''' Sestavljanje heterodimerov ~~Cp149HisCp149Y132A~~ v heksamer ''' <br>		''' Sestavljanje heterodimerov Cp149<sub>His</sub>Cp149<sub>Y132A</sub> v heksamer ''' <br>
	Da bi ugotovili karakteristike sestavljanja modificiranih heterodimerov, so najprej primerjali sestavljanje modificiranih heterodimerov in homodimerov divjega tipa pri visoki ionski moči. Kot je pričakovano, so ugotovili, da heterodimer v takšnih pogojih ne tvori kapside in drugih stabilnih intermedatov, medtem ko se nativni homodimeri uspešno sestavijo v kapsido. Nato so preizkusili še sestavljanje modificiranih heterodimerov v odvisnosti od Ni2+ ionov pri nizki ionski moči. Z velikostno izključitveno kromatografijo so ugotovili, da se heterodimeri združujejo v komplekse, večje od dimerov. Najbolj zastopani kompleksi so bili prosti dimeri, dimeri dimerov, heksameri in samo nekaj domnevnih dvojnih heksamerov. Večje komplekse so izolirali in ustreznost potrdili z elektronsko mikroskopijo z negativnim kontrastiranjem.		Da bi ugotovili karakteristike sestavljanja modificiranih heterodimerov, so najprej primerjali sestavljanje modificiranih heterodimerov in homodimerov divjega tipa pri visoki ionski moči. Kot je pričakovano, so ugotovili, da heterodimer v takšnih pogojih ne tvori kapside in drugih stabilnih intermedatov, medtem ko se nativni homodimeri uspešno sestavijo v kapsido. Nato so preizkusili še sestavljanje modificiranih heterodimerov v odvisnosti od Ni2+ ionov pri nizki ionski moči. Z velikostno izključitveno kromatografijo so ugotovili, da se heterodimeri združujejo v komplekse, večje od dimerov. Najbolj zastopani kompleksi so bili prosti dimeri, dimeri dimerov, heksameri in samo nekaj domnevnih dvojnih heksamerov. Večje komplekse so izolirali in ustreznost potrdili z elektronsko mikroskopijo z negativnim kontrastiranjem.

	''' Sestavljanje ~~Cp149HisCp149Y132A~~ heksamerov s homodimeri Cp150 ''' <br>		''' Sestavljanje Cp149<sub>His</sub>Cp149<sub>Y132A</sub> heksamerov s homodimeri Cp150 ''' <br>
	Čeprav mutacija kontaktnega heliksa Y132A onemogoča samostojno sestavljanje, je možno sestavljanje s homodimeri Cp150. Vsak homodimer naj bi z nukleacijskim heksamernim kompleksov tvoril dva kontakta, od katerih je le eden onemogočen zaradi mutacije Y132A. Mutacija torej oslabi začetne korake nadaljnjega sestavljanja, vendar ga ne prepreči.		Čeprav mutacija kontaktnega heliksa Y132A onemogoča samostojno sestavljanje, je možno sestavljanje s homodimeri Cp150. Vsak homodimer naj bi z nukleacijskim heksamernim kompleksov tvoril dva kontakta, od katerih je le eden onemogočen zaradi mutacije Y132A. Mutacija torej oslabi začetne korake nadaljnjega sestavljanja, vendar ga ne prepreči.

	''' Pretvorba hibridne kapside v luknjasto kapsido ''' <br>		''' Pretvorba hibridne kapside v luknjasto kapsido ''' <br>
	Avtorji so postavili hipotezo, da bo homodimerni del kapside ostal nespremenjen tudi po odstranitvi heterodimernega heksamera. To so preverili tako, da so heterodimerne heksamere odstranili z mešanico 100 µM EDTA in 3M sečnine. EDTA prekine z Ni2+ ioni posredovane interakcije med histidinskimi oznakami, sečnina pa oslabi interakcije med posameznimi heterodimeri, zato ~~Cp149HisCp149Y132A~~ dimeri disociirajo od hibridne kapside.		Avtorji so postavili hipotezo, da bo homodimerni del kapside ostal nespremenjen tudi po odstranitvi heterodimernega heksamera. To so preverili tako, da so heterodimerne heksamere odstranili z mešanico 100 µM EDTA in 3M sečnine. EDTA prekine z Ni2+ ioni posredovane interakcije med histidinskimi oznakami, sečnina pa oslabi interakcije med posameznimi heterodimeri, zato Cp149<sub>His</sub>Cp149<sub>Y132A</sub> dimeri disociirajo od hibridne kapside.

	''' Krio-EM rekonstrukcija luknjastih kapsid ''' <br>		''' Krio-EM rekonstrukcija luknjastih kapsid ''' <br>

← Older revision		Revision as of 19:34, 4 May 2021
Line 12:		Line 12:
	Za nadzorovano pot sestavljanja potrebujemo način za iniciacijo sestavljanja oz. povezovanja določenih komponent in način za ustavitev (in morebitni ponovni zagon) sestavljanja na določeni stopnji reakcije. Avtorji so zasnovali asimetrično pot sestavljanja, ki vodi od posameznih asimetričnih podenot (heterodimerov) do asimetrične luknjaste kapside in na koncu do asimetrične celotne kapside (z zapolnjeno luknjo). Kot že omenjeno, so uporabili model kapside virusa hepatitisa B. [1] Osnovna gradbena komponenta njegove kapside je protein kapside, ki vsebuje 183 aminokislinskih ostankov. 149 aminokislinskih ostankov na N-koncu predstavlja domeno Cp149, ki je odgovorna za sestavljanje (t.i. assembly domain). Aminokislinski ostanki na C-koncu (od 150 do 183) pa so bogati z argininom in imajo sposobnost vezave na nukleinsko kislino. [3] Uporabili so samo domeno Cp149, ki so jo modificirali tako, da so iz homodimerne podenote dobili heterodimerno podenoto Cp149HisCp149Y132A. Prvi monomer ima vezano oznako His-Tag. Tako kot dimer divjega tipa ima sposobnost sestavljanja v odvisnosti od ionske moči, poleg tega je zaradi histidinske oznake občutljiv na Ni2+ ione. Drugi monomer ima mutacijo tirozina v alanin na mestu 132. Mutacija inhibira sposobnost sestavljanja, saj povzroči izgubo hidrofobne površine, ki je potrebna za ustrezno interakcijo z drugimi podenotami. Kljub temu, pa se lahko vseeno povezuje z dimeri divjega tipa v manj stabilne kapside.		Za nadzorovano pot sestavljanja potrebujemo način za iniciacijo sestavljanja oz. povezovanja določenih komponent in način za ustavitev (in morebitni ponovni zagon) sestavljanja na določeni stopnji reakcije. Avtorji so zasnovali asimetrično pot sestavljanja, ki vodi od posameznih asimetričnih podenot (heterodimerov) do asimetrične luknjaste kapside in na koncu do asimetrične celotne kapside (z zapolnjeno luknjo). Kot že omenjeno, so uporabili model kapside virusa hepatitisa B. [1] Osnovna gradbena komponenta njegove kapside je protein kapside, ki vsebuje 183 aminokislinskih ostankov. 149 aminokislinskih ostankov na N-koncu predstavlja domeno Cp149, ki je odgovorna za sestavljanje (t.i. assembly domain). Aminokislinski ostanki na C-koncu (od 150 do 183) pa so bogati z argininom in imajo sposobnost vezave na nukleinsko kislino. [3] Uporabili so samo domeno Cp149, ki so jo modificirali tako, da so iz homodimerne podenote dobili heterodimerno podenoto Cp149HisCp149Y132A. Prvi monomer ima vezano oznako His-Tag. Tako kot dimer divjega tipa ima sposobnost sestavljanja v odvisnosti od ionske moči, poleg tega je zaradi histidinske oznake občutljiv na Ni2+ ione. Drugi monomer ima mutacijo tirozina v alanin na mestu 132. Mutacija inhibira sposobnost sestavljanja, saj povzroči izgubo hidrofobne površine, ki je potrebna za ustrezno interakcijo z drugimi podenotami. Kljub temu, pa se lahko vseeno povezuje z dimeri divjega tipa v manj stabilne kapside.

	'''Nukleacija'''		'''Nukleacija''' <br>

	Pot je zasnovana tako, da se asimetrični dimeri začnejo sestavljati ob dodatku Ni2+ ionov. Nastanejo heksameri, ki pa se ne sestavljajo več naprej, zaradi vpliva mutacije Y132A.		Pot je zasnovana tako, da se asimetrični dimeri začnejo sestavljati ob dodatku Ni2+ ionov. Nastanejo heksameri, ki pa se ne sestavljajo več naprej, zaradi vpliva mutacije Y132A.

	'''Elongacija'''		'''Elongacija''' <br>

	Heksameri nato služijo kot nukleacijska jedra za nadaljnje sestavljanje z dimeri druge vrste (Cp150) pri visoki ionski moči (po dodatku NaCl). Nastane hibridna kapsida, ki ima heksamerno komponento in homodimerno komponento.		Heksameri nato služijo kot nukleacijska jedra za nadaljnje sestavljanje z dimeri druge vrste (Cp150) pri visoki ionski moči (po dodatku NaCl). Nastane hibridna kapsida, ki ima heksamerno komponento in homodimerno komponento.

	'''Kapsidno telo s prečnimi povezavami'''		'''Kapsidno telo s prečnimi povezavami''' <br>

	Homodimerna komponenta je ločeno stabilizirana, saj so uporabili homodimere (Cp150), ki spontano tvorijo prečne povezave. Protein Cp150 je različica Cp149, ki na C-koncu vsebuje dodatni cisteinski ostanek in omogoča disulfidne prečne povezave med homodimeri Cp150. Tak homodimerni del hibridne kapside je stabilen ob nizki ionski jakosti in tretiranju s sečnino.		Homodimerna komponenta je ločeno stabilizirana, saj so uporabili homodimere (Cp150), ki spontano tvorijo prečne povezave. Protein Cp150 je različica Cp149, ki na C-koncu vsebuje dodatni cisteinski ostanek in omogoča disulfidne prečne povezave med homodimeri Cp150. Tak homodimerni del hibridne kapside je stabilen ob nizki ionski jakosti in tretiranju s sečnino.

	'''Odstranitev nukleacijskega jedra'''		'''Odstranitev nukleacijskega jedra''' <br>

	Heterodimerni del kapside ne vsebuje dodatnega cisteinskega ostanka in ne more tvoriti prečnih povezav, zato ga lahko nadzorovano odstranimo, ostane pa luknjasta kapsida.		Heterodimerni del kapside ne vsebuje dodatnega cisteinskega ostanka in ne more tvoriti prečnih povezav, zato ga lahko nadzorovano odstranimo, ostane pa luknjasta kapsida.

	'''Modificiranje, ponovna zapolnitev površine'''		'''Modificiranje, ponovna zapolnitev površine''' <br>

	Takšno kapsido lahko dodatno modificiramo in/ali ponovno zapolnimo odprtino z drugačnimi podenotami, ki imajo za nas uporabne lastnosti. [1]		Takšno kapsido lahko dodatno modificiramo in/ali ponovno zapolnimo odprtino z drugačnimi podenotami, ki imajo za nas uporabne lastnosti. [1]

	==''' Izvedba eksperimenta '''==		==''' Izvedba eksperimenta '''==

	'''Čiščenje in karakterizacija heterodimera Cp149HisCp149Y132A '''		'''Čiščenje in karakterizacija heterodimera Cp149HisCp149Y132A ''' <br>

	Za sintezo željenega heterodimera so zasnovali bicistronski ekspresijski plazmid, ki je vseboval en promotor, ki sta mu sledila gena za vsak monomer posebej (Cp149His in Cp149Y132A). Vsak gen je imel tudi svojo ribosom vezavno domeno. Po ekspresiji v celicah E. coli so izvedli velikostno izključitveno kromatografijo, da so odstranili Cp149His homodimere in nikljevo afinitetno kromatografijo, da so odstranili Cp149Y132A homodimere. Izvedli so tudi poliakrilamidno gelsko elektroforezo in masno spektrometrijo, da so preverili dobljen produkt.		Za sintezo željenega heterodimera so zasnovali bicistronski ekspresijski plazmid, ki je vseboval en promotor, ki sta mu sledila gena za vsak monomer posebej (Cp149His in Cp149Y132A). Vsak gen je imel tudi svojo ribosom vezavno domeno. Po ekspresiji v celicah E. coli so izvedli velikostno izključitveno kromatografijo, da so odstranili Cp149His homodimere in nikljevo afinitetno kromatografijo, da so odstranili Cp149Y132A homodimere. Izvedli so tudi poliakrilamidno gelsko elektroforezo in masno spektrometrijo, da so preverili dobljen produkt.

	''' Sestavljanje heterodimerov Cp149HisCp149Y132A v heksamer '''		''' Sestavljanje heterodimerov Cp149HisCp149Y132A v heksamer ''' <br>

	Da bi ugotovili karakteristike sestavljanja modificiranih heterodimerov, so najprej primerjali sestavljanje modificiranih heterodimerov in homodimerov divjega tipa pri visoki ionski moči. Kot je pričakovano, so ugotovili, da heterodimer v takšnih pogojih ne tvori kapside in drugih stabilnih intermedatov, medtem ko se nativni homodimeri uspešno sestavijo v kapsido. Nato so preizkusili še sestavljanje modificiranih heterodimerov v odvisnosti od Ni2+ ionov pri nizki ionski moči. Z velikostno izključitveno kromatografijo so ugotovili, da se heterodimeri združujejo v komplekse, večje od dimerov. Najbolj zastopani kompleksi so bili prosti dimeri, dimeri dimerov, heksameri in samo nekaj domnevnih dvojnih heksamerov. Večje komplekse so izolirali in ustreznost potrdili z elektronsko mikroskopijo z negativnim kontrastiranjem.		Da bi ugotovili karakteristike sestavljanja modificiranih heterodimerov, so najprej primerjali sestavljanje modificiranih heterodimerov in homodimerov divjega tipa pri visoki ionski moči. Kot je pričakovano, so ugotovili, da heterodimer v takšnih pogojih ne tvori kapside in drugih stabilnih intermedatov, medtem ko se nativni homodimeri uspešno sestavijo v kapsido. Nato so preizkusili še sestavljanje modificiranih heterodimerov v odvisnosti od Ni2+ ionov pri nizki ionski moči. Z velikostno izključitveno kromatografijo so ugotovili, da se heterodimeri združujejo v komplekse, večje od dimerov. Najbolj zastopani kompleksi so bili prosti dimeri, dimeri dimerov, heksameri in samo nekaj domnevnih dvojnih heksamerov. Večje komplekse so izolirali in ustreznost potrdili z elektronsko mikroskopijo z negativnim kontrastiranjem.

	''' Sestavljanje Cp149HisCp149Y132A heksamerov s homodimeri Cp150 '''		''' Sestavljanje Cp149HisCp149Y132A heksamerov s homodimeri Cp150 ''' <br>

	Čeprav mutacija kontaktnega heliksa Y132A onemogoča samostojno sestavljanje, je možno sestavljanje s homodimeri Cp150. Vsak homodimer naj bi z nukleacijskim heksamernim kompleksov tvoril dva kontakta, od katerih je le eden onemogočen zaradi mutacije Y132A. Mutacija torej oslabi začetne korake nadaljnjega sestavljanja, vendar ga ne prepreči.		Čeprav mutacija kontaktnega heliksa Y132A onemogoča samostojno sestavljanje, je možno sestavljanje s homodimeri Cp150. Vsak homodimer naj bi z nukleacijskim heksamernim kompleksov tvoril dva kontakta, od katerih je le eden onemogočen zaradi mutacije Y132A. Mutacija torej oslabi začetne korake nadaljnjega sestavljanja, vendar ga ne prepreči.

	''' Pretvorba hibridne kapside v luknjasto kapsido '''		''' Pretvorba hibridne kapside v luknjasto kapsido ''' <br>

	Avtorji so postavili hipotezo, da bo homodimerni del kapside ostal nespremenjen tudi po odstranitvi heterodimernega heksamera. To so preverili tako, da so heterodimerne heksamere odstranili z mešanico 100 µM EDTA in 3M sečnine. EDTA prekine z Ni2+ ioni posredovane interakcije med histidinskimi oznakami, sečnina pa oslabi interakcije med posameznimi heterodimeri, zato Cp149HisCp149Y132A dimeri disociirajo od hibridne kapside.		Avtorji so postavili hipotezo, da bo homodimerni del kapside ostal nespremenjen tudi po odstranitvi heterodimernega heksamera. To so preverili tako, da so heterodimerne heksamere odstranili z mešanico 100 µM EDTA in 3M sečnine. EDTA prekine z Ni2+ ioni posredovane interakcije med histidinskimi oznakami, sečnina pa oslabi interakcije med posameznimi heterodimeri, zato Cp149HisCp149Y132A dimeri disociirajo od hibridne kapside.

	''' Krio-EM rekonstrukcija luknjastih kapsid '''		''' Krio-EM rekonstrukcija luknjastih kapsid ''' <br>

	Nastanek luknjastih kapsid so potrdili s krio-elektronsko mikroskopijo. Prve mikrografije so pokazale mešanico celotnih kapsid in luknjastih kapsid. Nato so izbrali 41.057 delcev in izvedli 3D rekonstrukcijo. Rezultati so pokazali, da so prisotne kapside z dvema različnima velikostma odprtine. Pri nekaterih kapsidah je bila odprtina velika za 9 dimerov (heksamer + 3 dimeri), pri drugih pa za 18 dimerov (dvojni heksamer + pentamer). Za taka opažanja so navedli dve možni razlagi: poleg nuklecijskega heksamera so asociirali še dodatni heterodimeri ali pa so homodimeri na robu odprtine tvorili manj močne prečne povezave in so se zato odcepili skupaj s heksamerom.		Nastanek luknjastih kapsid so potrdili s krio-elektronsko mikroskopijo. Prve mikrografije so pokazale mešanico celotnih kapsid in luknjastih kapsid. Nato so izbrali 41.057 delcev in izvedli 3D rekonstrukcijo. Rezultati so pokazali, da so prisotne kapside z dvema različnima velikostma odprtine. Pri nekaterih kapsidah je bila odprtina velika za 9 dimerov (heksamer + 3 dimeri), pri drugih pa za 18 dimerov (dvojni heksamer + pentamer). Za taka opažanja so navedli dve možni razlagi: poleg nuklecijskega heksamera so asociirali še dodatni heterodimeri ali pa so homodimeri na robu odprtine tvorili manj močne prečne povezave in so se zato odcepili skupaj s heksamerom.

	''' Zapolnitev odprtine in tvorba nove hibridne kapside '''		''' Zapolnitev odprtine in tvorba nove hibridne kapside ''' <br>

	Odprtino v luknjasti kapsidi lahko zapolnimo z željenim homodimerom. To zmožnost so testirali tako, da so luknjastim kapsidam dodali homodimer Cp150Bo, ki ima na cisteinski ostanek na mestu 150 vezan fluorofor BODIPY. Vzorce so vzbujali pri valovni dolžini 504 nm in nato merili emitirano svetlobo pri 512 nm ter potrdili, da so homodimeri Cp150Bo zapolnili odprtino v kapsidi. [1]		Odprtino v luknjasti kapsidi lahko zapolnimo z željenim homodimerom. To zmožnost so testirali tako, da so luknjastim kapsidam dodali homodimer Cp150Bo, ki ima na cisteinski ostanek na mestu 150 vezan fluorofor BODIPY. Vzorce so vzbujali pri valovni dolžini 504 nm in nato merili emitirano svetlobo pri 512 nm ter potrdili, da so homodimeri Cp150Bo zapolnili odprtino v kapsidi. [1]
	=='''Zaključek''' ==		=='''Zaključek''' ==