Inženiring bakterij Escherichia coli odzivnih na svetlobo - Revision history

Karmenzbogar: /* Testiranje aktivnosti fitokromov */

2019-01-09T21:29:37Z

Testiranje aktivnosti fitokromov

← Older revision		Revision as of 21:29, 9 January 2019
Line 21:		Line 21:
	Za pregledovanje aktivnosti fotoreceptorjev so uporabili ''E. coli'' RU1012 [MC4100 ara + Φ(OmpC-''lacZ'') 10-25 Δ''envZ'' :: KanR]. Sev ima v kromosomu zapis za promotor ''ompC'', fuziran z ''lacZ'' reporterjem.		Za pregledovanje aktivnosti fotoreceptorjev so uporabili ''E. coli'' RU1012 [MC4100 ara + Φ(OmpC-''lacZ'') 10-25 Δ''envZ'' :: KanR]. Sev ima v kromosomu zapis za promotor ''ompC'', fuziran z ''lacZ'' reporterjem.

	Iz cianobakterije Synechocystis so izolirali fitokrom Cph1. Pred tem so izvedli poravnavo CLUSTALW različnih fitokromov z EnvZ. Izdelali so knjižnico s spreminjanjem števila aminokislin Cph1 (+/- 9 aminokislin). S spreminjanjem števila aminokislin Cph1 so konstruirali vrsto himer z variabilno dolžino dela, ki povezuje fotoreceptor z znotrajceličnim regulatorjem, saj dolžina in sestava peptida lahko vpliva na signalno transdukcijo. Število aminokislin pri EnvZ je bilo ohranjeno in sicer zadnjih 229 aminokislin.		Iz cianobakterije Synechocystis so izolirali fitokrom Cph1. Pred tem so izvedli poravnavo CLUSTALW različnih fitokromov Cph1 z EnvZ. Izdelali so knjižnico s spreminjanjem števila aminokislin Cph1 (+/- 9 aminokislin). S spreminjanjem števila aminokislin Cph1 so konstruirali vrsto himer z variabilno dolžino dela, ki povezuje fotoreceptor z znotrajceličnim regulatorjem, saj dolžina in sestava peptida lahko vpliva na signalno transdukcijo. Število aminokislin pri EnvZ je bilo ohranjeno in sicer zadnjih 229 aminokislin.
	Himerne fitokrome so ligirali v plazmid pPOROTet. Plazmid vsebuje tetraciklinski promotor, odpornost na kloramfenikol in mesto začetka replikacije ColE1. Najprej je bila histidin kinazna domena ''envZ'' ligirana v ogrodje pPROTet in s tem so tvorili plazmid pPRO-HK. Fragment ''envZ'' so pomnožili s pomočjo reakcije PCR z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki so vsebovali restrikcijska mesta ''Nde''I in ''Xba''I. Sledila je ligacija preko teh restrikcijskih mest v ogrodje. Fragmente fitokromov so nato vstavili preko ''Kpn''I in ''Nde''I restrikcisjkih mest [1].		Himerne fitokrome so ligirali v plazmid pPOROTet. Plazmid vsebuje tetraciklinski promotor, odpornost na kloramfenikol in mesto začetka replikacije ColE1. Najprej je bila histidin kinazna domena ''envZ'' ligirana v ogrodje pPROTet in s tem so tvorili plazmid pPRO-HK. Fragment ''envZ'' so pomnožili s pomočjo reakcije PCR z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki so vsebovali restrikcijska mesta ''Nde''I in ''Xba''I. Sledila je ligacija preko teh restrikcijskih mest v ogrodje. Fragmente fitokromov so nato vstavili preko ''Kpn''I in ''Nde''I restrikcisjkih mest [1].

Karmenzbogar: /* Testiranje aktivnosti fitokromov */

2019-01-09T21:23:24Z

Testiranje aktivnosti fitokromov

← Older revision		Revision as of 21:23, 9 January 2019
Line 21:		Line 21:
	Za pregledovanje aktivnosti fotoreceptorjev so uporabili ''E. coli'' RU1012 [MC4100 ara + Φ(OmpC-''lacZ'') 10-25 Δ''envZ'' :: KanR]. Sev ima v kromosomu zapis za promotor ''ompC'', fuziran z ''lacZ'' reporterjem.		Za pregledovanje aktivnosti fotoreceptorjev so uporabili ''E. coli'' RU1012 [MC4100 ara + Φ(OmpC-''lacZ'') 10-25 Δ''envZ'' :: KanR]. Sev ima v kromosomu zapis za promotor ''ompC'', fuziran z ''lacZ'' reporterjem.

	Iz cianobakterije Synechocystis so izolirali fitokrom Cph1. Pred tem so izvedli poravnavo CLUSTALW različnih fitokromov ~~Cph1~~ z EnvZ. Izdelali so knjižnico s spreminjanjem števila aminokislin Cph1 (+/- 9 aminokislin). S spreminjanjem števila aminokislin Cph1 so konstruirali vrsto himer z variabilno dolžino dela, ki povezuje fotoreceptor z znotrajceličnim regulatorjem, saj dolžina in sestava peptida lahko vpliva na signalno transdukcijo. Število aminokislin pri EnvZ je bilo ohranjeno in sicer zadnjih 229 aminokislin.		Iz cianobakterije Synechocystis so izolirali fitokrom Cph1. Pred tem so izvedli poravnavo CLUSTALW različnih fitokromov z EnvZ. Izdelali so knjižnico s spreminjanjem števila aminokislin Cph1 (+/- 9 aminokislin). S spreminjanjem števila aminokislin Cph1 so konstruirali vrsto himer z variabilno dolžino dela, ki povezuje fotoreceptor z znotrajceličnim regulatorjem, saj dolžina in sestava peptida lahko vpliva na signalno transdukcijo. Število aminokislin pri EnvZ je bilo ohranjeno in sicer zadnjih 229 aminokislin.
	Himerne fitokrome so ligirali v plazmid pPOROTet. Plazmid vsebuje tetraciklinski promotor, odpornost na kloramfenikol in mesto začetka replikacije ColE1. Najprej je bila histidin kinazna domena ''envZ'' ligirana v ogrodje pPROTet in s tem so tvorili plazmid pPRO-HK. Fragment ''envZ'' so pomnožili s pomočjo reakcije PCR z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki so vsebovali restrikcijska mesta ''Nde''I in ''Xba''I. Sledila je ligacija preko teh restrikcijskih mest v ogrodje. Fragmente fitokromov so nato vstavili preko ''Kpn''I in ''Nde''I restrikcisjkih mest [1].		Himerne fitokrome so ligirali v plazmid pPOROTet. Plazmid vsebuje tetraciklinski promotor, odpornost na kloramfenikol in mesto začetka replikacije ColE1. Najprej je bila histidin kinazna domena ''envZ'' ligirana v ogrodje pPROTet in s tem so tvorili plazmid pPRO-HK. Fragment ''envZ'' so pomnožili s pomočjo reakcije PCR z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki so vsebovali restrikcijska mesta ''Nde''I in ''Xba''I. Sledila je ligacija preko teh restrikcijskih mest v ogrodje. Fragmente fitokromov so nato vstavili preko ''Kpn''I in ''Nde''I restrikcisjkih mest [1].

Karmenzbogar at 22:48, 8 January 2019

2019-01-08T22:48:11Z

← Older revision		Revision as of 22:48, 8 January 2019
Line 1:		Line 1:
	Izvorni članek: Levskaya, A. et al. Engineering Escherichia coli to see light, Nature, 438, 441–442 (2005). [https://www.nature.com/articles/nature04405]		Izvorni članek: Levskaya, A. et al. Engineering ''Escherichia coli'' to see light, Nature, 438, 441–442 (2005). [https://www.nature.com/articles/nature04405]

Karmenzbogar: /* Testiranje aktivnosti fitokromov */

2019-01-08T22:47:05Z

Testiranje aktivnosti fitokromov

← Older revision		Revision as of 22:47, 8 January 2019
Line 22:		Line 22:

	Iz cianobakterije Synechocystis so izolirali fitokrom Cph1. Pred tem so izvedli poravnavo CLUSTALW različnih fitokromov Cph1 z EnvZ. Izdelali so knjižnico s spreminjanjem števila aminokislin Cph1 (+/- 9 aminokislin). S spreminjanjem števila aminokislin Cph1 so konstruirali vrsto himer z variabilno dolžino dela, ki povezuje fotoreceptor z znotrajceličnim regulatorjem, saj dolžina in sestava peptida lahko vpliva na signalno transdukcijo. Število aminokislin pri EnvZ je bilo ohranjeno in sicer zadnjih 229 aminokislin.		Iz cianobakterije Synechocystis so izolirali fitokrom Cph1. Pred tem so izvedli poravnavo CLUSTALW različnih fitokromov Cph1 z EnvZ. Izdelali so knjižnico s spreminjanjem števila aminokislin Cph1 (+/- 9 aminokislin). S spreminjanjem števila aminokislin Cph1 so konstruirali vrsto himer z variabilno dolžino dela, ki povezuje fotoreceptor z znotrajceličnim regulatorjem, saj dolžina in sestava peptida lahko vpliva na signalno transdukcijo. Število aminokislin pri EnvZ je bilo ohranjeno in sicer zadnjih 229 aminokislin.
	Himerne fitokrome so ligirali v plazmid pPOROTet. Plazmid vsebuje tetraciklinski promotor, odpornost na kloramfenikol in mesto začetka replikacije ColE1. Najprej je bila histidin kinazna domena ''envZ'' ligirana v ogrodje pPROTet in s tem so tvorili plazmid pPRO-HK. Fragment envZ so pomnožili s pomočjo reakcije PCR z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki so vsebovali restrikcijska mesta ''Nde''I in ''Xba''I. Sledila je ligacija preko teh restrikcijskih mest v ogrodje. Fragmente fitokromov so nato vstavili preko ''Kpn''I in ''Nde''I restrikcisjkih mest [1].		Himerne fitokrome so ligirali v plazmid pPOROTet. Plazmid vsebuje tetraciklinski promotor, odpornost na kloramfenikol in mesto začetka replikacije ColE1. Najprej je bila histidin kinazna domena ''envZ'' ligirana v ogrodje pPROTet in s tem so tvorili plazmid pPRO-HK. Fragment ''envZ'' so pomnožili s pomočjo reakcije PCR z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki so vsebovali restrikcijska mesta ''Nde''I in ''Xba''I. Sledila je ligacija preko teh restrikcijskih mest v ogrodje. Fragmente fitokromov so nato vstavili preko ''Kpn''I in ''Nde''I restrikcisjkih mest [1].

	=== Millerjev poskus ===		=== Millerjev poskus ===

Karmenzbogar: /* Testiranje aktivnosti fitokromov */

2019-01-08T22:46:10Z

Testiranje aktivnosti fitokromov

← Older revision		Revision as of 22:46, 8 January 2019
Line 19:		Line 19:

	== Testiranje aktivnosti fitokromov ==		== Testiranje aktivnosti fitokromov ==
	Za pregledovanje aktivnosti fotoreceptorjev so uporabili E. coli RU1012 [MC4100 ara + Φ(OmpC-''lacZ'') 10-25 Δ''envZ'' :: KanR]. Sev ima v kromosomu zapis za promotor ''ompC'', fuziran z ''lacZ'' reporterjem.		Za pregledovanje aktivnosti fotoreceptorjev so uporabili ''E. coli'' RU1012 [MC4100 ara + Φ(OmpC-''lacZ'') 10-25 Δ''envZ'' :: KanR]. Sev ima v kromosomu zapis za promotor ''ompC'', fuziran z ''lacZ'' reporterjem.

	Iz cianobakterije Synechocystis so izolirali fitokrom Cph1. Pred tem so izvedli poravnavo CLUSTALW različnih fitokromov Cph1 z EnvZ. Izdelali so knjižnico s spreminjanjem števila aminokislin Cph1 (+/- 9 aminokislin). S spreminjanjem števila aminokislin Cph1 so konstruirali vrsto himer z variabilno dolžino dela, ki povezuje fotoreceptor z znotrajceličnim regulatorjem, saj dolžina in sestava peptida lahko vpliva na signalno transdukcijo. Število aminokislin pri EnvZ je bilo ohranjeno in sicer zadnjih 229 aminokislin.		Iz cianobakterije Synechocystis so izolirali fitokrom Cph1. Pred tem so izvedli poravnavo CLUSTALW različnih fitokromov Cph1 z EnvZ. Izdelali so knjižnico s spreminjanjem števila aminokislin Cph1 (+/- 9 aminokislin). S spreminjanjem števila aminokislin Cph1 so konstruirali vrsto himer z variabilno dolžino dela, ki povezuje fotoreceptor z znotrajceličnim regulatorjem, saj dolžina in sestava peptida lahko vpliva na signalno transdukcijo. Število aminokislin pri EnvZ je bilo ohranjeno in sicer zadnjih 229 aminokislin.

Karmenzbogar: /* Napredki v bakterijski fotografiji */

2019-01-08T22:45:23Z

Napredki v bakterijski fotografiji

← Older revision		Revision as of 22:45, 8 January 2019
Line 37:		Line 37:
	== Napredki v bakterijski fotografiji ==		== Napredki v bakterijski fotografiji ==
	Leta 2017 je Christopher A. Voigt s sodelavci objavil publikacijo v kateri opisujejo gensko kodiran sistem, ki daje ''E. coli'' zmožnost razlikovanja med rdečo, zeleno in modro (RGB) svetlobo ter se odziva s spreminjanjem izražanja genov. Ta sistem so uporabili za izdelavo barvnih fotografij na ploščah bakterijske kulture z nadzorovanjem proizvodnje pigmentov.		Leta 2017 je Christopher A. Voigt s sodelavci objavil publikacijo v kateri opisujejo gensko kodiran sistem, ki daje ''E. coli'' zmožnost razlikovanja med rdečo, zeleno in modro (RGB) svetlobo ter se odziva s spreminjanjem izražanja genov. Ta sistem so uporabili za izdelavo barvnih fotografij na ploščah bakterijske kulture z nadzorovanjem proizvodnje pigmentov.
	Barvno fotografijo so dosegli z združitvijo svetlobnih senzorjev, ki se odzivajo na različne valovne dolžine. Rdeči in zeleni senzorji temeljijo na fitokromih s fikocianobilinom (PCB). Rdeča svetloba je zaznana s Cph8, ki jo vklopi infrardeča (705 nm) svetloba in izključena z rdečo (650 nm) svetlobo. Ta senzor je bil prej uporabljen za ustvarjanje črno-belih bakterijskih fotografij (opisano zgoraj). Senzor zelene svetlobe temelji na Synechocystis CcaSR, ki se vklopi z zeleno (535 nm) svetlobo in izklopi pri daljno rdeči (672 nm) svetlobi. Senzor modre svetlobe uporablja himerno histidin kinazo (YF1), ki vsebuje flavin mononukleotid (FMN). Izklopi se s svetlobo pri 470 nm in je vklopljen v njeni odsotnosti. Šlo pa je za sistem kjer pride do izražanja encimov, ki so ustvarjajo barvne pigmente na ploščici. Rdeče, zelene in modre barve so proizvedli z izražanjem glukuronidaze (GusA), β-galaktozidaze (LacZ) in monooksigenaze (bFMO) in dodatkom IPTG ter Rose-gluc, X-Gal, ali triptofana (Trp) [5] .		Barvno fotografijo so dosegli z združitvijo svetlobnih senzorjev, ki se odzivajo na različne valovne dolžine. Rdeči in zeleni senzorji temeljijo na fitokromih s fikocianobilinom (PCB). Rdeča svetloba je zaznana s Cph8, ki jo vklopi infrardeča (705 nm) svetloba in izključena z rdečo (650 nm) svetlobo. Ta senzor je bil prej uporabljen za ustvarjanje črno-belih bakterijskih fotografij (opisano zgoraj). Senzor zelene svetlobe temelji na ''Synechocystis'' CcaSR, ki se vklopi z zeleno (535 nm) svetlobo in izklopi pri daljno rdeči (672 nm) svetlobi. Senzor modre svetlobe uporablja himerno histidin kinazo (YF1), ki vsebuje flavin mononukleotid (FMN). Izklopi se s svetlobo pri 470 nm in je vklopljen v njeni odsotnosti. Šlo pa je za sistem kjer pride do izražanja encimov, ki so ustvarjajo barvne pigmente na ploščici. Rdeče, zelene in modre barve so proizvedli z izražanjem glukuronidaze (GusA), β-galaktozidaze (LacZ) in monooksigenaze (bFMO) in dodatkom IPTG ter Rose-gluc, X-Gal, ali triptofana (Trp) [5] .
	Več podrobnosti najdete v publikaciji na spletni strani revije Nature: https://www.nature.com/articles/nchembio.2390		Več podrobnosti najdete v publikaciji na spletni strani revije Nature: https://www.nature.com/articles/nchembio.2390

Karmenzbogar: /* Napredki v bakterijski fotografiji */

2019-01-08T22:44:10Z

Napredki v bakterijski fotografiji

← Older revision		Revision as of 22:44, 8 January 2019
Line 36:		Line 36:

	== Napredki v bakterijski fotografiji ==		== Napredki v bakterijski fotografiji ==
	Leta 2017 je Christopher A. Voigt s sodelavci objavil publikacijo v kateri opisujejo gensko kodiran sistem, ki daje E. coli zmožnost razlikovanja med rdečo, zeleno in modro (RGB) svetlobo ter se odziva s spreminjanjem izražanja genov. Ta sistem so uporabili za izdelavo barvnih fotografij na ploščah bakterijske kulture z nadzorovanjem proizvodnje pigmentov.		Leta 2017 je Christopher A. Voigt s sodelavci objavil publikacijo v kateri opisujejo gensko kodiran sistem, ki daje ''E. coli'' zmožnost razlikovanja med rdečo, zeleno in modro (RGB) svetlobo ter se odziva s spreminjanjem izražanja genov. Ta sistem so uporabili za izdelavo barvnih fotografij na ploščah bakterijske kulture z nadzorovanjem proizvodnje pigmentov.
	Barvno fotografijo so dosegli z združitvijo svetlobnih senzorjev, ki se odzivajo na različne valovne dolžine. Rdeči in zeleni senzorji temeljijo na fitokromih s fikocianobilinom (PCB). Rdeča svetloba je zaznana s Cph8, ki jo vklopi infrardeča (705 nm) svetloba in izključena z rdečo (650 nm) svetlobo. Ta senzor je bil prej uporabljen za ustvarjanje črno-belih bakterijskih fotografij (opisano zgoraj). Senzor zelene svetlobe temelji na Synechocystis CcaSR, ki se vklopi z zeleno (535 nm) svetlobo in izklopi pri daljno rdeči (672 nm) svetlobi. Senzor modre svetlobe uporablja himerno histidin kinazo (YF1), ki vsebuje flavin mononukleotid (FMN). Izklopi se s svetlobo pri 470 nm in je vklopljen v njeni odsotnosti. Šlo pa je za sistem kjer pride do izražanja encimov, ki so ustvarjajo barvne pigmente na ploščici. Rdeče, zelene in modre barve so proizvedli z izražanjem glukuronidaze (GusA), β-galaktozidaze (LacZ) in monooksigenaze (bFMO) in dodatkom IPTG ter Rose-gluc, X-Gal, ali triptofana (Trp) [5] .		Barvno fotografijo so dosegli z združitvijo svetlobnih senzorjev, ki se odzivajo na različne valovne dolžine. Rdeči in zeleni senzorji temeljijo na fitokromih s fikocianobilinom (PCB). Rdeča svetloba je zaznana s Cph8, ki jo vklopi infrardeča (705 nm) svetloba in izključena z rdečo (650 nm) svetlobo. Ta senzor je bil prej uporabljen za ustvarjanje črno-belih bakterijskih fotografij (opisano zgoraj). Senzor zelene svetlobe temelji na Synechocystis CcaSR, ki se vklopi z zeleno (535 nm) svetlobo in izklopi pri daljno rdeči (672 nm) svetlobi. Senzor modre svetlobe uporablja himerno histidin kinazo (YF1), ki vsebuje flavin mononukleotid (FMN). Izklopi se s svetlobo pri 470 nm in je vklopljen v njeni odsotnosti. Šlo pa je za sistem kjer pride do izražanja encimov, ki so ustvarjajo barvne pigmente na ploščici. Rdeče, zelene in modre barve so proizvedli z izražanjem glukuronidaze (GusA), β-galaktozidaze (LacZ) in monooksigenaze (bFMO) in dodatkom IPTG ter Rose-gluc, X-Gal, ali triptofana (Trp) [5] .
	Več podrobnosti najdete v publikaciji na spletni strani revije Nature: https://www.nature.com/articles/nchembio.2390		Več podrobnosti najdete v publikaciji na spletni strani revije Nature: https://www.nature.com/articles/nchembio.2390

Karmenzbogar: /* Fikocianobilin */

2019-01-08T22:43:33Z

Fikocianobilin

← Older revision		Revision as of 22:43, 8 January 2019
Line 14:		Line 14:

	=== Fikocianobilin ===		=== Fikocianobilin ===
	Dodatno, fitokromi imajo linearne tetrapirolne prostetične skupine, ki omogočajo absorpcijo vidne svetlobe in se imenujejo bilini. Bilini izhajajo iz od kisika odvisnega odpiranja obroča hema. Cianobakterije Synechocystis imajo zapis za dva encima, ki prispevata k pretvorbi hema v fikocianobilin (PCB). Ta dva encima sta hem oksigenaza (HO1) in fikocianobilin: feredoksin oksidoreduktaza (PcyA), ki katalizirata pretvorbo hema v biliverdin IXa (BV) oziroma BV v PCB. [3]		Dodatno, fitokromi imajo linearne tetrapirolne prostetične skupine, ki omogočajo absorpcijo vidne svetlobe in se imenujejo bilini. Bilini izhajajo iz od kisika odvisnega odpiranja obroča hema. Cianobakterije ''Synechocystis'' imajo zapis za dva encima, ki prispevata k pretvorbi hema v fikocianobilin (PCB). Ta dva encima sta hem oksigenaza (HO1) in fikocianobilin: feredoksin oksidoreduktaza (PcyA), ki katalizirata pretvorbo hema v biliverdin IXa (BV) oziroma BV v PCB. [3]

	V E. coli PCB ni naravno sintetiziran, zato je bila njegova biosintezna pot uvedena preko plazmida pPL-PCB, ki je bil pridobljen od J. C. Lagarias in je bil predhodno pripravljen za biosintezo fitokroma v bakterijah. Plazmid vsebuje mesto začetka replikacije p15a in vsebuje gena ''ho1'' in ''pcyA'', za pretvorbo hema v PCB, pod kontrolo promotorja Para/lac. Zamenjali so le odpornost na kanamicin z odpornostjo na ampicilin [1].		V ''E. coli'' PCB ni naravno sintetiziran, zato je bila njegova biosintezna pot uvedena preko plazmida pPL-PCB, ki je bil pridobljen od J. C. Lagarias in je bil predhodno pripravljen za biosintezo fitokroma v bakterijah. Plazmid vsebuje mesto začetka replikacije p15a in vsebuje gena ''ho1'' in ''pcyA'', za pretvorbo hema v PCB, pod kontrolo promotorja Para/lac. Zamenjali so le odpornost na kanamicin z odpornostjo na ampicilin [1].

	== Testiranje aktivnosti fitokromov ==		== Testiranje aktivnosti fitokromov ==

Karmenzbogar: /* Snemanje bakterijskih fotografij */

2019-01-08T22:41:50Z

Snemanje bakterijskih fotografij

← Older revision		Revision as of 22:41, 8 January 2019
Line 30:		Line 30:

	== Snemanje bakterijskih fotografij ==		== Snemanje bakterijskih fotografij ==
	Vse bakterijske slike so bile posnete z uporabo E. coli, seva CP919, ki je izpeljan iz RU1012 in nosi dodaten transpozon. Transpozon povzroči inaktivacijo genov rbsK in rbsB, ki zapisujeta za ribokinazo ter protein, ki veže ribozo. Sev je bil transformiran s pPCB in pCPH8, kar je ustvarilo svetlobno občutljiv sev za poskuse bakterijske fotografije. Bakterije so gojili na agarnih ploščah. Ob aktivaciji s svetlobo je prišlo do izražanja LacZ, ki pa katalizira tvorbo stabilne črne oborine iz S-gal (3,4-cikloheksenoskuletin-β-D-galaktopiranozid). Rdeča svetloba poganja senzor v stanje, v katerem je avtofosforilacija EnvZ inhibirana, kar zavre izražanje genov in tako ne pride do tvorbe črne spojine. Na območju svetlobe se zato pojavijo svetli deli, na temnih območjih pa temni deli slike. Z naraščajočo intenzivnostjo svetlobe so pokazali tudi stopenjski odziv sistema. Aktivnost pri najbolj intenzivni svetlobi je bila minimalna [1].		Vse bakterijske slike so bile posnete z uporabo ''E. coli'', seva CP919, ki je izpeljan iz RU1012 in nosi dodaten transpozon. Transpozon povzroči inaktivacijo genov ''rbsK'' in ''rbsB'', ki zapisujeta za ribokinazo ter protein, ki veže ribozo. Sev je bil transformiran s pPCB in pCPH8, kar je ustvarilo svetlobno občutljiv sev za poskuse bakterijske fotografije. Bakterije so gojili na agarnih ploščah. Ob aktivaciji s svetlobo je prišlo do izražanja LacZ, ki pa katalizira tvorbo stabilne črne oborine iz S-gal (3,4-cikloheksenoskuletin-β-D-galaktopiranozid). Rdeča svetloba poganja senzor v stanje, v katerem je avtofosforilacija EnvZ inhibirana, kar zavre izražanje genov in tako ne pride do tvorbe črne spojine. Na območju svetlobe se zato pojavijo svetli deli, na temnih območjih pa temni deli slike. Z naraščajočo intenzivnostjo svetlobe so pokazali tudi stopenjski odziv sistema. Aktivnost pri najbolj intenzivni svetlobi je bila minimalna [1].

	=== Kamera ===		=== Kamera ===
	Bakterijska kamera, ki se uporablja za snemanje slik je sestavljena iz vira svetlobe, ki je 100W svetilka in slikovnega projektorja z objektivom za ostrenje slike. Slednji je nameščen 75 mm nad 632 nm ozkim optičnim pasovnim filtrom. Pod filtrom je 35-milimetrski diapozitiv, na katerega je posneta fotografija, ki je nameščena na električni pogon, ki se uporablja za nastavitev ostrine. Slika je projicirana 38 cm pod objektiv v inkubator in na veliko ploščo, ki vsebuje biofilm [1].		Bakterijska kamera, ki se uporablja za snemanje slik je sestavljena iz vira svetlobe, ki je 100W svetilka in slikovnega projektorja z objektivom za ostrenje slike. Slednji je nameščen 75 mm nad 632 nm ozkim optičnim pasovnim filtrom. Pod filtrom je 35-milimetrski diapozitiv, na katerega je posneta fotografija, ki je nameščena na električni pogon, ki se uporablja za nastavitev ostrine. Slika je projicirana 38 cm pod objektiv v inkubator in na veliko ploščo, ki vsebuje biofilm [1].

	== Napredki v bakterijski fotografiji ==		== Napredki v bakterijski fotografiji ==

Karmenzbogar: /* Testiranje aktivnosti fitokromov */

2019-01-08T22:38:55Z

Testiranje aktivnosti fitokromov

← Older revision		Revision as of 22:38, 8 January 2019
Line 22:		Line 22:

	Iz cianobakterije Synechocystis so izolirali fitokrom Cph1. Pred tem so izvedli poravnavo CLUSTALW različnih fitokromov Cph1 z EnvZ. Izdelali so knjižnico s spreminjanjem števila aminokislin Cph1 (+/- 9 aminokislin). S spreminjanjem števila aminokislin Cph1 so konstruirali vrsto himer z variabilno dolžino dela, ki povezuje fotoreceptor z znotrajceličnim regulatorjem, saj dolžina in sestava peptida lahko vpliva na signalno transdukcijo. Število aminokislin pri EnvZ je bilo ohranjeno in sicer zadnjih 229 aminokislin.		Iz cianobakterije Synechocystis so izolirali fitokrom Cph1. Pred tem so izvedli poravnavo CLUSTALW različnih fitokromov Cph1 z EnvZ. Izdelali so knjižnico s spreminjanjem števila aminokislin Cph1 (+/- 9 aminokislin). S spreminjanjem števila aminokislin Cph1 so konstruirali vrsto himer z variabilno dolžino dela, ki povezuje fotoreceptor z znotrajceličnim regulatorjem, saj dolžina in sestava peptida lahko vpliva na signalno transdukcijo. Število aminokislin pri EnvZ je bilo ohranjeno in sicer zadnjih 229 aminokislin.
	Himerne fitokrome so ligirali v plazmid pPOROTet. Plazmid vsebuje tetraciklinski promotor, odpornost na kloramfenikol in mesto začetka replikacije ColE1. Najprej je bila histidin kinazna domena ''envZ'' ligirana v ogrodje pPROTet in s tem so tvorili plazmid pPRO-HK. Fragment envZ so pomnožili s pomočjo reakcije PCR z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki so vsebovali restrikcijska mesta ~~NdeI~~ in ~~XbaI~~. Sledila je ligacija preko teh restrikcijskih mest v ogrodje. Fragmente fitokromov so nato vstavili preko ~~KpnI~~ in ~~NdeI~~ restrikcisjkih mest [1].		Himerne fitokrome so ligirali v plazmid pPOROTet. Plazmid vsebuje tetraciklinski promotor, odpornost na kloramfenikol in mesto začetka replikacije ColE1. Najprej je bila histidin kinazna domena ''envZ'' ligirana v ogrodje pPROTet in s tem so tvorili plazmid pPRO-HK. Fragment envZ so pomnožili s pomočjo reakcije PCR z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki so vsebovali restrikcijska mesta ''Nde''I in ''Xba''I. Sledila je ligacija preko teh restrikcijskih mest v ogrodje. Fragmente fitokromov so nato vstavili preko ''Kpn''I in ''Nde''I restrikcisjkih mest [1].

	=== Millerjev poskus ===		=== Millerjev poskus ===