Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo - Revision history

Zarja Rožanc 1: /* Faza celične rasti */

2024-04-23T12:11:16Z

Faza celične rasti

← Older revision		Revision as of 12:11, 23 April 2024
Line 33:		Line 33:

	===Faza celične rasti===		===Faza celične rasti===
	Z indukcijo sistema ABA-MYC so dosegli natančen nadzor nad izražanjem genov cMYC in mCherry, tako na ravni transkriptoma, kot na ravni proteinov. Z naraščanjem koncentracije ABA je bistveno naraščala tudi gostota ~~celic~~. Povečano izražanje cMYC je izboljšalo celično viabilnost, vendar je hkrati zmanjšalo sintezo IgG1 in raven celično specifičnih produktivnosti. Z analizo izražanja mRNA težkih in lahkih verig so ocenili, da indukcija cMYC ni vplivala na izražanje rekombinantnih genov, temveč je vzrok bil v posledičnem vplivu na celično proliferacijo.		Z indukcijo sistema ABA-MYC so dosegli natančen nadzor nad izražanjem genov cMYC in mCherry, tako na ravni transkriptoma, kot na ravni proteinov. Z naraščanjem koncentracije ABA je bistveno naraščala tudi celična gostota. Povečano izražanje cMYC je izboljšalo celično viabilnost, vendar je hkrati zmanjšalo sintezo IgG1 in raven celično specifičnih produktivnosti. Z analizo izražanja mRNA težkih in lahkih verig so ocenili, da indukcija cMYC ni vplivala na izražanje rekombinantnih genov, temveč je vzrok bil v posledičnem vplivu na celično proliferacijo.

	===Stacionarna celična faza===		===Stacionarna celična faza===
	Z aktivacijo TET-BLIMP1 sistema, so pridobili natančen nadzor nad genoma BLIMP1 in GFP, tako na ravni mRNA, kot na ravni proteinov. Z naraščajočo koncentracijo TET so opazili postopen upad v celični gostoti. Podobno kot pri sistemu ABA-MYC, je aktivacija TET-BLIMP1 privedla do povečane celične viabilnosti. Večja celična viabilnost je bila posledica manjšega števila celic in potencialno zmanjšanih potreb po substratih za celično rast. Povečano izražanje BLIMP1 je bistveno povečalo produktivnost celic in sintezo IgG1. V količini prepisov za težki in lahki verigi IgG1 ni bilo znatne razlike, zato je povečana sinteza IgG1 najverjetneje posledica vpliva BLIMP1 na proliferacijo celic in njihovo zmožnost proizvajanja/sproščanja večje količine proteinov.		Z aktivacijo TET-BLIMP1 sistema, so pridobili natančen nadzor nad genoma BLIMP1 in GFP, tako na ravni mRNA, kot na ravni proteinov. Z naraščajočo koncentracijo TET so opazili postopen upad v celični gostoti. Podobno kot pri sistemu ABA-MYC, je aktivacija TET-BLIMP1 privedla do povečane celične viabilnosti. Večja celična viabilnost je bila posledica manjšega števila celic in potencialno zmanjšanih potreb po substratih za celično rast. Povečano izražanje BLIMP1 je bistveno povečalo produktivnost celic in sintezo IgG1. V količini prepisov za težki in lahki verigi IgG1 ni bilo znatne razlike, zato je povečana sinteza IgG1 najverjetneje posledica vpliva BLIMP1 na proliferacijo celic in njihovo zmožnost proizvajanja/sproščanja večje količine proteinov.

Zarja Rožanc 1: /* Faza celične smrti */

2024-04-23T12:02:04Z

Faza celične smrti

← Older revision		Revision as of 12:02, 23 April 2024
Line 26:		Line 26:
	==Rezultati==		==Rezultati==
	===Faza celične smrti===		===Faza celične smrti===
	Primerjali so rast in celično viabilnost me SKO in DKO kloni, ter starševskimi celicami CHOK1. Rastna profila celičnih linij SKO in DKO sta bila primerljiva, hkrati pa sta obe kazali izboljšano celično viabilnost v primerjavi s kontrolnimi celicami. Ugotovili so tudi, da je izbitje obeh genov imelo sinergistični učinek na izboljšanje celične viabilnosti, zato je pri DKO klonih celična ~~smrt~~ bila bistveno zmanjšana.		Primerjali so rast in celično viabilnost me SKO in DKO kloni, ter starševskimi celicami CHOK1. Rastna profila celičnih linij SKO in DKO sta bila primerljiva, hkrati pa sta obe kazali izboljšano celično viabilnost v primerjavi s kontrolnimi celicami. Ugotovili so tudi, da je izbitje obeh genov imelo sinergistični učinek na izboljšanje celične viabilnosti, zato je pri DKO klonih celična smrtnost bila bistveno zmanjšana.

	Sinteza IgG1, kot tudi celično specifična produktivnost, je bila v primerjavi s kontrolo, pri DKO klonih povišana. V izražanju mRNA težkih in lahkih verig IgG1 ni bilo posebnih razlik, na podlagi česar lahko sklepamo, da je izboljšana proizvodnja IgG1 rezultat daljše življenjske dobe kulture in ne razlik v razvoju celičnih linij.		Sinteza IgG1, kot tudi celično specifična produktivnost, je bila v primerjavi s kontrolo, pri DKO klonih povišana. V izražanju mRNA težkih in lahkih verig IgG1 ni bilo posebnih razlik, na podlagi česar lahko sklepamo, da je izboljšana proizvodnja IgG1 rezultat daljše življenjske dobe kulture in ne razlik v razvoju celičnih linij.

Zarja Rožanc 1: /* Stacionarna celična faza */

2024-04-23T12:01:51Z

Stacionarna celična faza

← Older revision		Revision as of 12:01, 23 April 2024
Line 35:		Line 35:
	Z indukcijo sistema ABA-MYC so dosegli natančen nadzor nad izražanjem genov cMYC in mCherry, tako na ravni transkriptoma, kot na ravni proteinov. Z naraščanjem koncentracije ABA je bistveno naraščala tudi gostota celic. Povečano izražanje cMYC je izboljšalo celično viabilnost, vendar je hkrati zmanjšalo sintezo IgG1 in raven celično specifičnih produktivnosti. Z analizo izražanja mRNA težkih in lahkih verig so ocenili, da indukcija cMYC ni vplivala na izražanje rekombinantnih genov, temveč je vzrok bil v posledičnem vplivu na celično proliferacijo.		Z indukcijo sistema ABA-MYC so dosegli natančen nadzor nad izražanjem genov cMYC in mCherry, tako na ravni transkriptoma, kot na ravni proteinov. Z naraščanjem koncentracije ABA je bistveno naraščala tudi gostota celic. Povečano izražanje cMYC je izboljšalo celično viabilnost, vendar je hkrati zmanjšalo sintezo IgG1 in raven celično specifičnih produktivnosti. Z analizo izražanja mRNA težkih in lahkih verig so ocenili, da indukcija cMYC ni vplivala na izražanje rekombinantnih genov, temveč je vzrok bil v posledičnem vplivu na celično proliferacijo.
	===Stacionarna celična faza===		===Stacionarna celična faza===
	Z aktivacijo TET-BLIMP1 sistema, so pridobili natančen nadzor nad genoma BLIMP1 in GFP, tako na ravni mRNA, kot na ravni proteinov. Z naraščajočo koncentracijo TET so opazili postopen upad v celični gostoti. Podobno kot pri sistemu ABA-MYC, je aktivacija TET-BLIMP1 privedla do povečane celične viabilnosti. Večja celična viabilnost je bila posledica manjšega števila celic in potencialno zmanjšanih potreb po substratih za celično rast. Povečano izražanje BLIMP1 je bistveno povečalo produktivnost celic in sintezo IgG1. V količini prepisov za težki in lahki verigi IgG1 ni bilo znatne razlike, zato je povečana sinteza IgG1 najverjetneje posledica vpliva BLIMP1 na proliferacijo celic in njihovo zmožnost proizvajanja/sproščanja večje količine proteinov.		Z aktivacijo TET-BLIMP1 sistema, so pridobili natančen nadzor nad genoma BLIMP1 in GFP, tako na ravni mRNA, kot na ravni proteinov. Z naraščajočo koncentracijo TET so opazili postopen upad v celični gostoti. Podobno kot pri sistemu ABA-MYC, je aktivacija TET-BLIMP1 privedla do povečane celične viabilnosti. Večja celična viabilnost je bila posledica manjšega števila celic in potencialno zmanjšanih potreb po substratih za celično rast. Povečano izražanje BLIMP1 je bistveno povečalo produktivnost celic in sintezo IgG1. V količini prepisov za težki in lahki verigi IgG1 ni bilo znatne razlike, zato je povečana sinteza IgG1 najverjetneje posledica vpliva BLIMP1 na proliferacijo celic in njihovo zmožnost proizvajanja/sproščanja večje količine proteinov.

	===Dualni kontrolni sistem===		===Dualni kontrolni sistem===
	Aktivacija posameznih genetskih vezij znotraj dualnega sistema je pri celicah sprožila enake spremembe, kot pri tistih z integriranim le enim izmed vezij. Celice so bile zmožne izražati tako ABA-MYC kot TET-BLIMP1 sistem, brez oslabljenega izražanja.		Aktivacija posameznih genetskih vezij znotraj dualnega sistema je pri celicah sprožila enake spremembe, kot pri tistih z integriranim le enim izmed vezij. Celice so bile zmožne izražati tako ABA-MYC kot TET-BLIMP1 sistem, brez oslabljenega izražanja.

Zarja Rožanc 1: /* Inducibilni sistem za regulacijo izražanja BLIMP1 */

2024-04-23T11:52:15Z

Inducibilni sistem za regulacijo izražanja BLIMP1

← Older revision		Revision as of 11:52, 23 April 2024
Line 19:		Line 19:

	===Inducibilni sistem za regulacijo izražanja BLIMP1===		===Inducibilni sistem za regulacijo izražanja BLIMP1===
	V stacionarni fazi celice prenehajo rasti in njihova gostota ostane konstantna. Čeprav je, zaradi povečane produktivnosti, takšno stanje v bioprocesiranju zaželjeno, je običajno posledica nezaželenega okolja (pomanjkanje hranil, prekomerni stres itd.). V raziskavi so oblikovali sistem, ki lahko inducira stacionarno fazo brez vnašanja nezaželenih sprememb v okolje kulture. Sistem temelji na izražanju gena BLIMP1, pomembnega regulatorja celičnega cikla in diferenciacije. Aktivnost sistema je odvisna od prisotnosti tetraciklina (TET). V odsotnosti TET je izražanje tarčnih genov aktivno zatrto preko tTS proteina, ki je fuzijski protein sestavljen iz tetraciklinskega represorja (TetR) in KRAB-AB (transkripcijsko-represorske domene proteinov Kid1). tTS zatre izražanje gena preko vezave na promotor TRE. Ko je prisoten TET, ~~se na promotor~~ TRE ~~veže~~ rtTA ~~protein~~, fuzijski protein mutanta TetR (rTetR) in VP16, ~~ga aktivira in~~ poveča izražanje tako gena BLIMP1, kot tudi reporterskega proteina GFP.		V stacionarni fazi celice prenehajo rasti in njihova gostota ostane konstantna. Čeprav je, zaradi povečane produktivnosti, takšno stanje v bioprocesiranju zaželjeno, je običajno posledica nezaželenega okolja (pomanjkanje hranil, prekomerni stres itd.). V raziskavi so oblikovali sistem, ki lahko inducira stacionarno fazo brez vnašanja nezaželenih sprememb v okolje kulture. Sistem temelji na izražanju gena BLIMP1, pomembnega regulatorja celičnega cikla in diferenciacije. Aktivnost sistema je odvisna od prisotnosti tetraciklina (TET). V odsotnosti TET je izražanje tarčnih genov aktivno zatrto preko tTS proteina, ki je fuzijski protein sestavljen iz tetraciklinskega represorja (TetR) in KRAB-AB (transkripcijsko-represorske domene proteinov Kid1). tTS zatre izražanje gena preko vezave na promotor TRE. Ko je prisoten TET, pride do aktivacije promotorja TRE iz strani rtTA, ki je fuzijski protein mutanta TetR (rTetR) in VP16, kar poveča izražanje tako gena BLIMP1, kot tudi reporterskega proteina GFP.

	===Dualni sistem ABA-MYC in TET-BLIMP1===		===Dualni sistem ABA-MYC in TET-BLIMP1===
	Bioprocesiranje zahteva poleg samostojne regulacije posameznih faz, tudi dinamično uravnavanje le-teh, za optimalni izkoristek. Za nadzorom nad fazo rasti in stacionarno fazo hkrati, so oblikovali dualni sistem, ki združuje sistema ABA-MYC in TET-BLIMP1. Celično linijo z dualnim sistemom so razvili tako, da so celice z integriranim sistemom ABA-MYC transficirali s TET-BLIMP1. Funkcionalnost celic s tovrstnim sistemom so preverjali z bi-fazno strategijo, kjer so najprej aktivirali fazo rasti preko aktivacije ABA-MYC, temu pa je sledila zaustavitev rasti preko aktivacije TET-BLIMP1.		Bioprocesiranje zahteva poleg samostojne regulacije posameznih faz, tudi dinamično uravnavanje le-teh, za optimalni izkoristek. Za nadzorom nad fazo rasti in stacionarno fazo hkrati, so oblikovali dualni sistem, ki združuje sistema ABA-MYC in TET-BLIMP1. Celično linijo z dualnim sistemom so razvili tako, da so celice z integriranim sistemom ABA-MYC transficirali s TET-BLIMP1. Funkcionalnost celic s tovrstnim sistemom so preverjali z bi-fazno strategijo, kjer so najprej aktivirali fazo rasti preko aktivacije ABA-MYC, temu pa je sledila zaustavitev rasti preko aktivacije TET-BLIMP1.

Zarja Rožanc 1: /* Inducibilni sistem za regulacijo izražanja cMYC */

2024-04-23T10:55:15Z

Inducibilni sistem za regulacijo izražanja cMYC

← Older revision		Revision as of 10:55, 23 April 2024
Line 16:		Line 16:
	Za preverjanje njihove sintezne sposobnosti, so celice transficirali z ekspresijskim vektorjem, ki so mu vgradili zaporedje za lahki in težki verigi človeškega protitelesa IgG1.		Za preverjanje njihove sintezne sposobnosti, so celice transficirali z ekspresijskim vektorjem, ki so mu vgradili zaporedje za lahki in težki verigi človeškega protitelesa IgG1.
	===Inducibilni sistem za regulacijo izražanja cMYC===		===Inducibilni sistem za regulacijo izražanja cMYC===
	Za zmožnost pospeševanja celične rasti brez, da bi le-to vodilo v genotipsko/fenotipske spremembe in apoptotske dogodke, je potreben sistem z visoko stopnjo nadzora. Da bi dosegli natančen nadzor nad rastjo celic, so oblikovali genomsko integriran sistem zasnovan na reguliranem izražanju gena cMYC, ki je znan po tem, da inducira celično proliferacijo. Oblikovali so inducibilno genetsko vezje, ki ga aktivira prisotnost abscizinske kisline (ABA) v mediju. Sistem ABA-MYC temelji na reverzibilni dimerizaciji domen PYL1 in ABI v prisotnosti ABA. Tovrstna dimerizacija privede do rekrutacije transkripcijsko-aktivacijske domene VP16 združene s PYL1, k DNA-vezavni domeni PhIF represorja združenega z ABI. Da bi preprečili nenamerno aktivacijo sistema, so med DNA-vezavno domeno PhIF in ABI vstavili signal jedrnega izvoza (NES), VP16-PYL1 pa so dodali signal jedrne lokalizacije (NLS). Prepletanje teh molekularnih elementov privede do vstopa dimeriziranih PhIF-NES-ABI in NLS-VP16-PYL1 v jedro, kjer sprožijo izražanje gena cMYC in reporterskega proteina mCherry.		Za zmožnost pospeševanja celične rasti brez, da bi le-to vodilo v genotipsko/fenotipske spremembe in apoptotske dogodke, je potreben sistem z visoko stopnjo nadzora. Da bi dosegli natančen nadzor nad rastjo celic, so oblikovali genomsko integriran sistem zasnovan na reguliranem izražanju gena cMYC, ki je znan po tem, da inducira celično proliferacijo. Oblikovali so inducibilno genetsko vezje, ki ga aktivira prisotnost abscizinske kisline (ABA) v mediju. Sistem ABA-MYC temelji na reverzibilni dimerizaciji domen proteinov PYL1 in ABI v prisotnosti ABA. Tovrstna dimerizacija privede do rekrutacije transkripcijsko-aktivacijske domene VP16 združene s PYL1, k DNA-vezavni domeni PhIF represorja združenega z ABI. Da bi preprečili nenamerno aktivacijo sistema, so med DNA-vezavno domeno PhIF in ABI vstavili signal jedrnega izvoza (NES), VP16-PYL1 pa so dodali signal jedrne lokalizacije (NLS). Prepletanje teh molekularnih elementov privede do vstopa dimeriziranih PhIF-NES-ABI in NLS-VP16-PYL1 v jedro, kjer sprožijo izražanje gena cMYC in reporterskega proteina mCherry.

	===Inducibilni sistem za regulacijo izražanja BLIMP1===		===Inducibilni sistem za regulacijo izražanja BLIMP1===
	V stacionarni fazi celice prenehajo rasti in njihova gostota ostane konstantna. Čeprav je, zaradi povečane produktivnosti, takšno stanje v bioprocesiranju zaželjeno, je običajno posledica nezaželenega okolja (pomanjkanje hranil, prekomerni stres itd.). V raziskavi so oblikovali sistem, ki lahko inducira stacionarno fazo brez vnašanja nezaželenih sprememb v okolje kulture. Sistem temelji na izražanju gena BLIMP1, pomembnega regulatorja celičnega cikla in diferenciacije. Aktivnost sistema je odvisna od prisotnosti tetraciklina (TET). V odsotnosti TET je izražanje tarčnih genov aktivno zatrto preko tTS proteina, ki je fuzijski protein sestavljen iz tetraciklinskega represorja (TetR) in KRAB-AB (transkripcijsko-represorske domene proteinov Kid1). tTS zatre izražanje gena preko vezave na promotor TRE. Ko je prisoten TET, se na promotor TRE veže rtTA protein, fuzijski protein mutanta TetR (rTetR) in VP16, ga aktivira in poveča izražanje tako gena BLIMP1, kot tudi reporterskega proteina GFP.		V stacionarni fazi celice prenehajo rasti in njihova gostota ostane konstantna. Čeprav je, zaradi povečane produktivnosti, takšno stanje v bioprocesiranju zaželjeno, je običajno posledica nezaželenega okolja (pomanjkanje hranil, prekomerni stres itd.). V raziskavi so oblikovali sistem, ki lahko inducira stacionarno fazo brez vnašanja nezaželenih sprememb v okolje kulture. Sistem temelji na izražanju gena BLIMP1, pomembnega regulatorja celičnega cikla in diferenciacije. Aktivnost sistema je odvisna od prisotnosti tetraciklina (TET). V odsotnosti TET je izražanje tarčnih genov aktivno zatrto preko tTS proteina, ki je fuzijski protein sestavljen iz tetraciklinskega represorja (TetR) in KRAB-AB (transkripcijsko-represorske domene proteinov Kid1). tTS zatre izražanje gena preko vezave na promotor TRE. Ko je prisoten TET, se na promotor TRE veže rtTA protein, fuzijski protein mutanta TetR (rTetR) in VP16, ga aktivira in poveča izražanje tako gena BLIMP1, kot tudi reporterskega proteina GFP.

Zarja Rožanc 1: /* Literatura */

2024-04-23T08:17:37Z

Literatura

← Older revision		Revision as of 08:17, 23 April 2024
Line 44:		Line 44:

	==Literatura==		==Literatura==
	1. Torres, M., Mcconnaughie, D., Akhtar, S., Gaffney, C. E., Fievet, B., Ingham, C., Stockdale, M., Dickson, A. J.: Engineering mammalian cell growth dynamics for biomanufacturing. Metabolic Engineering. 2024, 82, 89-99.		1. Torres, M., Mcconnaughie, D., Akhtar, S., Gaffney, C. E., Fievet, B., Ingham, C., Stockdale, M., Dickson, A. J.: Engineering mammalian cell growth dynamics for biomanufacturing. Metabolic Engineering. 2024, 82, 89-99. Dostopno na: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717624000120

	2. Latorre, Y., Torres, M., Vergara, M., Berrios, J., Sampayo, M. M., Godecke, N., Wirth, D., Hauser, H., Dickson, A. J., Altamirano, C.: Engineering of Chinese hamster ovary cells for co-overexpressing MYC and XBP1s increased cell proliferation and recombinant EPO production. Scientific Reports. 2023, 13.		2. Latorre, Y., Torres, M., Vergara, M., Berrios, J., Sampayo, M. M., Godecke, N., Wirth, D., Hauser, H., Dickson, A. J., Altamirano, C.: Engineering of Chinese hamster ovary cells for co-overexpressing MYC and XBP1s increased cell proliferation and recombinant EPO production. Scientific Reports. 2023, 13. Dostopno na:
			https://www.nature.com/articles/s41598-023-28622-z

Zarja Rožanc 1: /* Faza celične smrti */

2024-04-22T19:52:00Z

Faza celične smrti

← Older revision		Revision as of 19:52, 22 April 2024
Line 25:		Line 25:
	===Faza celične smrti===		===Faza celične smrti===
	Primerjali so rast in celično viabilnost me SKO in DKO kloni, ter starševskimi celicami CHOK1. Rastna profila celičnih linij SKO in DKO sta bila primerljiva, hkrati pa sta obe kazali izboljšano celično viabilnost v primerjavi s kontrolnimi celicami. Ugotovili so tudi, da je izbitje obeh genov imelo sinergistični učinek na izboljšanje celične viabilnosti, zato je pri DKO klonih celična smrt bila bistveno zmanjšana.		Primerjali so rast in celično viabilnost me SKO in DKO kloni, ter starševskimi celicami CHOK1. Rastna profila celičnih linij SKO in DKO sta bila primerljiva, hkrati pa sta obe kazali izboljšano celično viabilnost v primerjavi s kontrolnimi celicami. Ugotovili so tudi, da je izbitje obeh genov imelo sinergistični učinek na izboljšanje celične viabilnosti, zato je pri DKO klonih celična smrt bila bistveno zmanjšana.

	Sinteza IgG1, kot tudi celično specifična produktivnost, je bila v primerjavi s kontrolo, pri DKO klonih povišana. V izražanju mRNA težkih in lahkih verig IgG1 ni bilo posebnih razlik, na podlagi česar lahko sklepamo, da je izboljšana proizvodnja IgG1 rezultat daljše življenjske dobe kulture in ne razlik v razvoju celičnih linij.		Sinteza IgG1, kot tudi celično specifična produktivnost, je bila v primerjavi s kontrolo, pri DKO klonih povišana. V izražanju mRNA težkih in lahkih verig IgG1 ni bilo posebnih razlik, na podlagi česar lahko sklepamo, da je izboljšana proizvodnja IgG1 rezultat daljše življenjske dobe kulture in ne razlik v razvoju celičnih linij.
	Pobliže so raziskali tudi razlike v apoptotičnih signalnih poteh proteinov Bax in Bak in odkrili bistveno manjše izražanje z njima povezanih efektorjev. Zmanjšano izražanje je koreliralo z bistvenim zmanjšanjem apoptotične populacije, kar je nakazovalo na učinkovitost Bax in Bak DKO celične linije pri zmanjšanju apoptoze preko vpliva na njuno kaskado signalnih proteinov.
			Pobliže so raziskali tudi razlike v apoptotičnih signalnih poteh proteinov Bax in Bak in odkrili bistveno manjše izražanje z njima povezanih efektorjev. Zmanjšano izražanje je koreliralo z bistvenim zmanjšanjem apoptotične populacije, kar je nakazovalo na učinkovitost Bax in Bak DKO celične linije pri zmanjšanju apoptoze preko vpliva na njuno kaskado signalnih proteinov.

	===Faza celične rasti===		===Faza celične rasti===
	Z indukcijo sistema ABA-MYC so dosegli natančen nadzor nad izražanjem genov cMYC in mCherry, tako na ravni transkriptoma, kot na ravni proteinov. Z naraščanjem koncentracije ABA je bistveno naraščala tudi gostota celic. Povečano izražanje cMYC je izboljšalo celično viabilnost, vendar je hkrati zmanjšalo sintezo IgG1 in raven celično specifičnih produktivnosti. Z analizo izražanja mRNA težkih in lahkih verig so ocenili, da indukcija cMYC ni vplivala na izražanje rekombinantnih genov, temveč je vzrok bil v posledičnem vplivu na celično proliferacijo.		Z indukcijo sistema ABA-MYC so dosegli natančen nadzor nad izražanjem genov cMYC in mCherry, tako na ravni transkriptoma, kot na ravni proteinov. Z naraščanjem koncentracije ABA je bistveno naraščala tudi gostota celic. Povečano izražanje cMYC je izboljšalo celično viabilnost, vendar je hkrati zmanjšalo sintezo IgG1 in raven celično specifičnih produktivnosti. Z analizo izražanja mRNA težkih in lahkih verig so ocenili, da indukcija cMYC ni vplivala na izražanje rekombinantnih genov, temveč je vzrok bil v posledičnem vplivu na celično proliferacijo.

Zarja Rožanc 1: /* Zaključek */

2024-04-22T19:51:40Z

Zaključek

← Older revision		Revision as of 19:51, 22 April 2024
Line 35:		Line 35:
	==Zaključek==		==Zaključek==
	Študija predstavlja nov pristop k optimiziranju zmogljivosti bioprocesiranja z večplastnim inženiringom sesalskih celic, ki omogoča natančen nadzor nad vsemi tremi fazami celičnih kultur hkrati. Pristop, združuje zmanjšanje celične smrti z izbitjem pro-apoptotskih genov s pomočjo tehnologije CRISPR-Cas9, ter nadzor nad celično rastjo preko inducibilnih sistemov za izražanje genov cMYC in BLIMP1. Slednji ima velik potencial za povečanje natančnosti tako pri času, kot pri obsegu proizvodnje komercialno pomembnih rekombinantnih proteinov.		Študija predstavlja nov pristop k optimiziranju zmogljivosti bioprocesiranja z večplastnim inženiringom sesalskih celic, ki omogoča natančen nadzor nad vsemi tremi fazami celičnih kultur hkrati. Pristop, združuje zmanjšanje celične smrti z izbitjem pro-apoptotskih genov s pomočjo tehnologije CRISPR-Cas9, ter nadzor nad celično rastjo preko inducibilnih sistemov za izražanje genov cMYC in BLIMP1. Slednji ima velik potencial za povečanje natančnosti tako pri času, kot pri obsegu proizvodnje komercialno pomembnih rekombinantnih proteinov.

	»Knock out« pro-apoptotskih genov Bax in Bak je deloval kot varnostni ukrep proti morebitni aktivaciji apoptoze ob povečanem izražanju cMYC in/ali BLIMP1. Izbitje genov in posledično manjše izražanje njunih efektorjev, je učinkovito zmanjšalo celično smrt in vodilo v daljšo življenjsko dobo kulture.		»Knock out« pro-apoptotskih genov Bax in Bak je deloval kot varnostni ukrep proti morebitni aktivaciji apoptoze ob povečanem izražanju cMYC in/ali BLIMP1. Izbitje genov in posledično manjše izražanje njunih efektorjev, je učinkovito zmanjšalo celično smrt in vodilo v daljšo življenjsko dobo kulture.
	Razvoj sistemov »plina in zavore« se je izkazalo za visoko učinkovito v modulaciji hitrosti rasti sesalskih celic. cMYC je kot »pedal za plin« učinkovita tarča za pospeševanje rasti, ki v kombinaciji z inducibilnim sistemom omogoča prilagoditve rastnih sposobnosti v sesalskih celicah. Nasprotno ima BLIMP1 velik potencial »zavore«, s sprožanjem zastoja rasti celic in povečanjem njihove produktivnosti. Združen z inducibilnim sistemom omogoča kontrolirano upočasnitev celične rasti, kar vodi do uspešnega dosega zgodnje stacionarne faze in maksimiziranja produktivnosti v sesalskih celicah.
			Razvoj sistemov »plina in zavore« se je izkazalo za visoko učinkovito v modulaciji hitrosti rasti sesalskih celic. cMYC je kot »pedal za plin« učinkovita tarča za pospeševanje rasti, ki v kombinaciji z inducibilnim sistemom omogoča prilagoditve rastnih sposobnosti v sesalskih celicah. Nasprotno ima BLIMP1 velik potencial »zavore«, s sprožanjem zastoja rasti celic in povečanjem njihove produktivnosti. Združen z inducibilnim sistemom omogoča kontrolirano upočasnitev celične rasti, kar vodi do uspešnega dosega zgodnje stacionarne faze in maksimiziranja produktivnosti v sesalskih celicah.

	==Literatura==		==Literatura==

Zarja Rožanc 1: /* Literatura */

2024-04-22T19:51:05Z

Literatura

← Older revision		Revision as of 19:51, 22 April 2024
Line 39:		Line 39:

	==Literatura==		==Literatura==
			1. Torres, M., Mcconnaughie, D., Akhtar, S., Gaffney, C. E., Fievet, B., Ingham, C., Stockdale, M., Dickson, A. J.: Engineering mammalian cell growth dynamics for biomanufacturing. Metabolic Engineering. 2024, 82, 89-99.

			2. Latorre, Y., Torres, M., Vergara, M., Berrios, J., Sampayo, M. M., Godecke, N., Wirth, D., Hauser, H., Dickson, A. J., Altamirano, C.: Engineering of Chinese hamster ovary cells for co-overexpressing MYC and XBP1s increased cell proliferation and recombinant EPO production. Scientific Reports. 2023, 13.

Zarja Rožanc 1 at 19:43, 22 April 2024

2024-04-22T19:43:16Z

← Older revision		Revision as of 19:43, 22 April 2024
Line 6:		Line 6:
	=="Plin in zavora"==		=="Plin in zavora"==
	Sistem »plin in zavora« bi naj omogočal spremenljivo pospeševanje in zaviranje celične rasti in tvorbe rekombinantnih proteinov. Za izdelavo tovrstnega sistema je potrebna identifikacija specifičnih tarčnih molekul, ki so odgovorne za uravnavanje izražanja genov, ključnih pri celičnem ciklu in metabolizmu. cMYC in BLIMP1 sta globalna regulatorja transkripcije, ki v limfocitih B in plazmatkah delujeta kot »plinu in zavori« podobna dejavnika. cMYC se povečano izraža v zgodnjih B celicah in sodeluje pri uravnavanju proliferacije, preživetja in metabolizma. V procesu diferenciacije B celic v plazmatke, se poveča izražanje BLIMP1, ki zatre cMYC in njegove tarče, kar je ključnega pomena za prehod v končno stanje celice, ki sprošča protitelesa.		Sistem »plin in zavora« bi naj omogočal spremenljivo pospeševanje in zaviranje celične rasti in tvorbe rekombinantnih proteinov. Za izdelavo tovrstnega sistema je potrebna identifikacija specifičnih tarčnih molekul, ki so odgovorne za uravnavanje izražanja genov, ključnih pri celičnem ciklu in metabolizmu. cMYC in BLIMP1 sta globalna regulatorja transkripcije, ki v limfocitih B in plazmatkah delujeta kot »plinu in zavori« podobna dejavnika. cMYC se povečano izraža v zgodnjih B celicah in sodeluje pri uravnavanju proliferacije, preživetja in metabolizma. V procesu diferenciacije B celic v plazmatke, se poveča izražanje BLIMP1, ki zatre cMYC in njegove tarče, kar je ključnega pomena za prehod v končno stanje celice, ki sprošča protitelesa.

	~~==Apoptoza==~~
	Prekomerno izražanje cMYC je skupna lastnost številnih tipov rakavih celic in vodi v pospešeno proliferacijo, medtem ko prekomerno izražanje BLIMP1 zavre celično rast in zaustavi celični cikel v G1/G0 fazi. Manipulacija dinamike rasti sesalskih celic posledično predstavlja tveganje za sproženje apoptoze.
	~~===Sesalske celice odporne na smrt===~~
	Ob visokem izražanju cMYC se poveča sinteza pro-apoptotskih proteinov družine Bcl-2, med drugim proteinov Bax in Bak, kar lahko sproži apoptozo. Izbitje proteinov Bax in Bak omogoča razvoj sesalske celične linije odporne na smrt.

	==Materiali in metode==		==Materiali in metode==
	===Bax in Bak "knock out"===		===Bax in Bak "knock out"===
			Prekomerno izražanje cMYC je skupna lastnost številnih tipov rakavih celic in vodi v pospešeno proliferacijo, medtem ko prekomerno izražanje BLIMP1 zavre celično rast in zaustavi celični cikel v G1/G0 fazi. Manipulacija dinamike rasti sesalskih celic posledično predstavlja tveganje za sproženje apoptoze.

			Ob visokem izražanju cMYC se poveča sinteza pro-apoptotskih proteinov družine Bcl-2, med drugim proteinov Bax in Bak, kar lahko sproži apoptozo. Izbitje proteinov Bax in Bak omogoča razvoj sesalske celične linije odporne na smrt.
	V študiji so uporabili celice CHO-K1 in HEK293. Celice so naredili nesmrtne z uporabo CRISPR/Cas9 tehnologije in single guide RNA plazmida za izbitje genov Bax in Bak. Na osnovi njunih kodirajočih zaporedij so oblikovali tri usmerjevalne RNA (gRNA), katerih cilj je bila delecija različnih eksonov. Na prvi stopnji so pripravili single knock out celice (SKO) z izbitim genom Bax ali Bak, iz klonov pa nato še double knock out celice (DKO) z izbitima obema genoma. Uspešnost CRISPR/Cas9 tehnologije so preverjali na genomski ravni z uporabo TIDE PCR za identifikacijo insercij ali delecij znotraj tarčnih genov, ter na proteinski ravni z uporabo Western blot metode.		V študiji so uporabili celice CHO-K1 in HEK293. Celice so naredili nesmrtne z uporabo CRISPR/Cas9 tehnologije in single guide RNA plazmida za izbitje genov Bax in Bak. Na osnovi njunih kodirajočih zaporedij so oblikovali tri usmerjevalne RNA (gRNA), katerih cilj je bila delecija različnih eksonov. Na prvi stopnji so pripravili single knock out celice (SKO) z izbitim genom Bax ali Bak, iz klonov pa nato še double knock out celice (DKO) z izbitima obema genoma. Uspešnost CRISPR/Cas9 tehnologije so preverjali na genomski ravni z uporabo TIDE PCR za identifikacijo insercij ali delecij znotraj tarčnih genov, ter na proteinski ravni z uporabo Western blot metode.
	===Izražanje rekombinantnega monoklonskega protitelesa IgG1===		===Izražanje rekombinantnega monoklonskega protitelesa IgG1===