Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi - Revision history

Miljan01: /* Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov */

2025-04-14T22:56:56Z

Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov

← Older revision		Revision as of 22:56, 14 April 2025
Line 35:		Line 35:
	* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja P<sub>trc</sub>,		* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja P<sub>trc</sub>,
	* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,		* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
	* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev P<sub>sh1</sub> in P<sub>sh3</sub> je primerljiva s promotorjem GAP, P<sub>sh7</sub> pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji P<sub>sh3</sub>, P<sub>sh7</sub> in P<sub>sh8</sub> so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS-jev lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS-jev teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev P<sub>sh</sub> v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].		* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev P<sub>sh1</sub> in P<sub>sh3</sub> je primerljiva s promotorjem GAP, P<sub>sh7</sub> pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti.

			Promotorji P<sub>sh3</sub>, P<sub>sh7</sub> in P<sub>sh8</sub> so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS-jev lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS-jev teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev P<sub>sh</sub> v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

	== Zaključek ==		== Zaključek ==

Miljan01: /* Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje */

2025-04-14T21:13:17Z

Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje

← Older revision		Revision as of 21:13, 14 April 2025
Line 20:		Line 20:
	σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost P<sub>bs</sub> na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ<sup>54</sup> iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σ<sup>B</sup> in σ<sup>D</sup> iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega P<sub>bs</sub> [2].		σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost P<sub>bs</sub> na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ<sup>54</sup> iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σ<sup>B</sup> in σ<sup>D</sup> iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega P<sub>bs</sub> [2].

	Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ<sup>54</sup>, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja P<sub>bs</sub>, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σ<sup>B</sup> in σ<sup>D</sup>. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali P<sub>st</sub>. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ<sup>54</sup> v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σ<sup>B</sup> oz. σ<sup>D</sup>. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izhodiščnim P<sub>bs</sub>. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen pri ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicumu'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].		Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ<sup>54</sup>, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja P<sub>bs</sub>, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σ<sup>B</sup> in σ<sup>D</sup>. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali P<sub>st</sub>. Strukturna ureditev le-tega tako združuje prepoznavno zaporedje za σ<sup>54</sup> v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σ<sup>B</sup> oz. σ<sup>D</sup>. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izhodiščnim P<sub>bs</sub>. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen pri ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicumu'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

	=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja P<sub>bs</sub> ===		=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja P<sub>bs</sub> ===

Miljan01: /* Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje */

2025-04-14T20:50:01Z

Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje

← Older revision		Revision as of 20:50, 14 April 2025
Line 20:		Line 20:
	σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost P<sub>bs</sub> na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ<sup>54</sup> iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σ<sup>B</sup> in σ<sup>D</sup> iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega P<sub>bs</sub> [2].		σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost P<sub>bs</sub> na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ<sup>54</sup> iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σ<sup>B</sup> in σ<sup>D</sup> iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega P<sub>bs</sub> [2].

	Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ<sup>54</sup>, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja P<sub>bs</sub>, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σ<sup>B</sup> in σ<sup>D</sup>. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali P<sub>st</sub>. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ<sup>54</sup> v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σ<sup>B</sup> oz. σ<sup>D</sup>. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z ~~izvornim~~ P<sub>bs</sub>. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen pri ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicumu'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].		Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ<sup>54</sup>, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja P<sub>bs</sub>, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σ<sup>B</sup> in σ<sup>D</sup>. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali P<sub>st</sub>. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ<sup>54</sup> v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σ<sup>B</sup> oz. σ<sup>D</sup>. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izhodiščnim P<sub>bs</sub>. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen pri ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicumu'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

	=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja P<sub>bs</sub> ===		=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja P<sub>bs</sub> ===

Miljan01: /* Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje */

2025-04-14T20:49:19Z

Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje

← Older revision		Revision as of 20:49, 14 April 2025
Line 20:		Line 20:
	σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost P<sub>bs</sub> na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ<sup>54</sup> iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σ<sup>B</sup> in σ<sup>D</sup> iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega P<sub>bs</sub> [2].		σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost P<sub>bs</sub> na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ<sup>54</sup> iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σ<sup>B</sup> in σ<sup>D</sup> iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega P<sub>bs</sub> [2].

	Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ<sup>54</sup>, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja P<sub>bs</sub>, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σ<sup>B</sup> in σ<sup>D</sup>. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali P<sub>st</sub>. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ<sup>54</sup> v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σ<sup>B</sup> oz. σ<sup>D</sup>. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z ~~izvirnim~~ P<sub>bs</sub>. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen pri ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicumu'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].		Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ<sup>54</sup>, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja P<sub>bs</sub>, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σ<sup>B</sup> in σ<sup>D</sup>. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali P<sub>st</sub>. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ<sup>54</sup> v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σ<sup>B</sup> oz. σ<sup>D</sup>. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvornim P<sub>bs</sub>. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen pri ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicumu'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

	=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja P<sub>bs</sub> ===		=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja P<sub>bs</sub> ===

Miljan01: /* Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v E. coli */

2025-04-14T19:45:28Z

Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v E. coli

← Older revision		Revision as of 19:45, 14 April 2025
Line 14:		Line 14:
	=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja P<sub>bs</sub> v ''E. coli'' ===		=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja P<sub>bs</sub> v ''E. coli'' ===

	UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od ~~začetnega~~ mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor P<sub>bs</sub> z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. UP4 in UP6 sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost P<sub>bs</sub> povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s skupnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190–300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD<sub>600</sub>, tj. F/OD<sub>600</sub>) [2].		UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od mesta začetka transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor P<sub>bs</sub> z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. UP4 in UP6 sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost P<sub>bs</sub> povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s skupnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190–300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD<sub>600</sub>, tj. F/OD<sub>600</sub>) [2].

	=== Nadgradnja promotorja P<sub>bs</sub> z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===		=== Nadgradnja promotorja P<sub>bs</sub> z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===

Miljan01: /* Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v E. coli */

2025-04-14T19:44:56Z

Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v E. coli

← Older revision		Revision as of 19:44, 14 April 2025
Line 14:		Line 14:
	=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja P<sub>bs</sub> v ''E. coli'' ===		=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja P<sub>bs</sub> v ''E. coli'' ===

	UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor P<sub>bs</sub> z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. UP4 in UP6 sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost P<sub>bs</sub> povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s ~~splošnim~~ zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190–300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD<sub>600</sub>, tj. F/OD<sub>600</sub>) [2].		UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor P<sub>bs</sub> z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. UP4 in UP6 sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost P<sub>bs</sub> povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s skupnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190–300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD<sub>600</sub>, tj. F/OD<sub>600</sub>) [2].

	=== Nadgradnja promotorja P<sub>bs</sub> z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===		=== Nadgradnja promotorja P<sub>bs</sub> z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===

Miljan01: /* Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v E. coli */

2025-04-14T19:31:27Z

Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v E. coli

← Older revision		Revision as of 19:31, 14 April 2025
Line 14:		Line 14:
	=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja P<sub>bs</sub> v ''E. coli'' ===		=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja P<sub>bs</sub> v ''E. coli'' ===

	UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor P<sub>bs</sub> z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. UP4 in UP6 sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost P<sub>bs</sub> povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med ~~190-300~~ % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD<sub>600</sub>, tj. F/OD<sub>600</sub>) [2].		UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor P<sub>bs</sub> z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. UP4 in UP6 sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost P<sub>bs</sub> povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190–300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD<sub>600</sub>, tj. F/OD<sub>600</sub>) [2].

	=== Nadgradnja promotorja P<sub>bs</sub> z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===		=== Nadgradnja promotorja P<sub>bs</sub> z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===

Miljan01: /* Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v E. coli */

2025-04-14T19:31:09Z

Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v E. coli

← Older revision		Revision as of 19:31, 14 April 2025
Line 14:		Line 14:
	=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja P<sub>bs</sub> v ''E. coli'' ===		=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja P<sub>bs</sub> v ''E. coli'' ===

	UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor P<sub>bs</sub> z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. ~~Slednja~~ sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost P<sub>bs</sub> povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD<sub>600</sub>, tj. F/OD<sub>600</sub>) [2].		UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor P<sub>bs</sub> z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. UP4 in UP6 sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost P<sub>bs</sub> povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD<sub>600</sub>, tj. F/OD<sub>600</sub>) [2].

	=== Nadgradnja promotorja P<sub>bs</sub> z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===		=== Nadgradnja promotorja P<sub>bs</sub> z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===

Miljan01: /* Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs */

2025-04-14T18:55:09Z

Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs

← Older revision		Revision as of 18:55, 14 April 2025
Line 26:		Line 26:
	Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF-ja na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].		Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF-ja na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

	Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri ~~različne~~ TFBS-je, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].		Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS-ja, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

	== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==		== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Miljan01: /* Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ */

2025-04-14T18:53:33Z

Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ

← Older revision		Revision as of 18:53, 14 April 2025
Line 16:		Line 16:
	UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor P<sub>bs</sub> z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost P<sub>bs</sub> povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD<sub>600</sub>, tj. F/OD<sub>600</sub>) [2].		UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor P<sub>bs</sub> z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost P<sub>bs</sub> povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD<sub>600</sub>, tj. F/OD<sub>600</sub>) [2].

	=== Nadgradnja promotorja P<sub>bs</sub> z vključitvijo vezavnih mest za ~~faktor~~ σ ===		=== Nadgradnja promotorja P<sub>bs</sub> z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===

	σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost P<sub>bs</sub> na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ<sup>54</sup> iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σ<sup>B</sup> in σ<sup>D</sup> iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega P<sub>bs</sub> [2].		σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost P<sub>bs</sub> na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ<sup>54</sup> iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σ<sup>B</sup> in σ<sup>D</sup> iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega P<sub>bs</sub> [2].