InkSight - Revision history

Lucija Kovaček at 21:06, 3 May 2026

2026-05-03T21:06:16Z

← Older revision		Revision as of 21:06, 3 May 2026
Line 19:		Line 19:
	Zahtevna je tudi izbira ustrezne LBD, na primer pri malih molekulah brez znanih naravnih receptorjev. Pri načrtovanju novih receptorjev so si zato pomagali z lastnim programskim orodjem MESA Designer. Ta ima integrirano bazo [https://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/sabdab/ SAbDab] (''The Structural Antibody Database''), ki vsebuje več kot 10 000 eksperimentalno potrjenih struktur protiteles med katerimi poišče take, ki bi lahko vezali tarčni antigen, ter preveri afiniteto vezave z orodjem [https://life.bsc.es/pid/skempi2/ SKEMPI v2.0] (''Structural database of Kinetics and Energetics of Mutant Protein Interaction''). MESA Designer omogoča tudi vnos lastnega zaporedja LBD in pomaga pri izbiri različnih kombinacij TMD, povezovalnih zaporedij, proteaz itd. Program potem samodejno generira genske konstrukte, pripravljene za uporabo v laboratoriju.		Zahtevna je tudi izbira ustrezne LBD, na primer pri malih molekulah brez znanih naravnih receptorjev. Pri načrtovanju novih receptorjev so si zato pomagali z lastnim programskim orodjem MESA Designer. Ta ima integrirano bazo [https://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/sabdab/ SAbDab] (''The Structural Antibody Database''), ki vsebuje več kot 10 000 eksperimentalno potrjenih struktur protiteles med katerimi poišče take, ki bi lahko vezali tarčni antigen, ter preveri afiniteto vezave z orodjem [https://life.bsc.es/pid/skempi2/ SKEMPI v2.0] (''Structural database of Kinetics and Energetics of Mutant Protein Interaction''). MESA Designer omogoča tudi vnos lastnega zaporedja LBD in pomaga pri izbiri različnih kombinacij TMD, povezovalnih zaporedij, proteaz itd. Program potem samodejno generira genske konstrukte, pripravljene za uporabo v laboratoriju.

	Da bi preverili delovanje programsko načrtanega membransko vezanega receptorja, ki veže fragment Fc protitelesa IgG, so celice HEK293T transfecirali z ustreznimi konstrukti, po 12 urah so izvedli indukcijo z ligandom, rezultate pa posneli 24 ~~ur kasneje~~ s fluorescenčno mikroskopijo. Znotrajcelični del receptorja MESA sestavljata N- in C-fragment razcepljene proteaze TEV, ki se po vezavi liganda povežeta v aktivno proteazo. Ta nato cepi v membrano zasidran tetraciklinski transaktivator (tTA), ki je povezan z modrim fluorescenčnim proteinom (BFP). tTA se po cepitvi prenese v jedro in se veže na odzivni element za tetraciklin (TRE) ter aktivira izražanje rumenega fluorescenčnega proteina (YFP). Pri treh kontrolnih vzorcih (receptor MESA, receptor MESA + tTA-BFP, receptor MESA + konstrukt za YFP) pričakovano niso opazili modre in rumene fluorescence. Presenetljivo je, da pri kontroli s kombinacijo receptorja in tTA-BFP ni bilo opaznega signala modre fluorescence, čeprav bi se BFP moral izražati na membrani celic. Raziskovalci tega niso pripisali neuspešni transkripciji, pač pa prenasičenju tTA-BFP, saj ta nima mesta, kamor bi se tarčno vezal. Posledično lahko pride do nepravilnega zvitja proteina, celo njegove razgradnje ali do dušenja fluorescence. Ko so celice transfecirali s celotnim sistemom (MESA + tTA-BFP + YFP) so pri neinduciranem stanju opazili šibko modro in rumeno fluorescenco, kar kaže na nizko stopnjo bazalne aktivacije. Po indukciji z IgG Fc se je signal YFP močno ojačal, modra fluorescenca pa je ostala podobna neinduciranem. Tako so uspešno validirali receptor, zasnovan z orodjem MESA Designer.		Da bi preverili delovanje programsko načrtanega membransko vezanega receptorja, ki veže fragment Fc protitelesa IgG, so celice HEK293T transfecirali z ustreznimi konstrukti, po 12 urah so izvedli indukcijo z ligandom, rezultate pa posneli po 24 urah s fluorescenčno mikroskopijo. Znotrajcelični del receptorja MESA sestavljata N- in C-fragment razcepljene proteaze TEV, ki se po vezavi liganda povežeta v aktivno proteazo. Ta nato cepi v membrano zasidran tetraciklinski transaktivator (tTA), ki je povezan z modrim fluorescenčnim proteinom (BFP). tTA se po cepitvi prenese v jedro in se veže na odzivni element za tetraciklin (TRE) ter aktivira izražanje rumenega fluorescenčnega proteina (YFP). Pri treh kontrolnih vzorcih (receptor MESA, receptor MESA + tTA-BFP, receptor MESA + konstrukt za YFP) pričakovano niso opazili modre in rumene fluorescence. Presenetljivo je, da pri kontroli s kombinacijo receptorja in tTA-BFP ni bilo opaznega signala modre fluorescence, čeprav bi se BFP moral izražati na membrani celic. Raziskovalci tega niso pripisali neuspešni transkripciji, pač pa prenasičenju tTA-BFP, saj ta nima mesta, kamor bi se tarčno vezal. Posledično lahko pride do nepravilnega zvitja proteina, celo njegove razgradnje ali do dušenja fluorescence. Ko so celice transfecirali s celotnim sistemom (MESA + tTA-BFP + YFP) so pri neinduciranem stanju opazili šibko modro in rumeno fluorescenco, kar kaže na nizko stopnjo bazalne aktivacije. Po indukciji z IgG Fc se je signal YFP močno ojačal, modra fluorescenca pa je ostala podobna neinduciranem. Tako so uspešno validirali receptor, zasnovan z orodjem MESA Designer.

	===Enkapsulini===		===Enkapsulini===

Lucija Kovaček at 21:04, 3 May 2026

2026-05-03T21:04:28Z

← Older revision		Revision as of 21:04, 3 May 2026
Line 17:		Line 17:
	===MESA Designer in eksperimentalna potrditev delovanja receptorskega sistema===		===MESA Designer in eksperimentalna potrditev delovanja receptorskega sistema===

	Zahtevna je tudi izbira ustrezne LBD, na primer pri malih molekulah brez znanih naravnih receptorjev. Pri načrtovanju novih receptorjev so si zato pomagali z lastnim programskim orodjem MESA Designer. Ta ima integrirano bazo SAbDab (''The Structural Antibody Database''), ki vsebuje več kot 10 000 eksperimentalno potrjenih struktur protiteles med katerimi poišče take, ki bi lahko vezali tarčni antigen, ter preveri afiniteto vezave z orodjem SKEMPI v2.0 (''Structural database of Kinetics and Energetics of Mutant Protein Interaction''). MESA Designer omogoča tudi vnos lastnega zaporedja LBD in pomaga pri izbiri različnih kombinacij TMD, povezovalnih zaporedij, proteaz itd. Program potem samodejno generira genske konstrukte, pripravljene za uporabo v laboratoriju.		Zahtevna je tudi izbira ustrezne LBD, na primer pri malih molekulah brez znanih naravnih receptorjev. Pri načrtovanju novih receptorjev so si zato pomagali z lastnim programskim orodjem MESA Designer. Ta ima integrirano bazo [https://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/sabdab/ SAbDab] (''The Structural Antibody Database''), ki vsebuje več kot 10 000 eksperimentalno potrjenih struktur protiteles med katerimi poišče take, ki bi lahko vezali tarčni antigen, ter preveri afiniteto vezave z orodjem [https://life.bsc.es/pid/skempi2/ SKEMPI v2.0] (''Structural database of Kinetics and Energetics of Mutant Protein Interaction''). MESA Designer omogoča tudi vnos lastnega zaporedja LBD in pomaga pri izbiri različnih kombinacij TMD, povezovalnih zaporedij, proteaz itd. Program potem samodejno generira genske konstrukte, pripravljene za uporabo v laboratoriju.

	Da bi preverili delovanje programsko načrtanega membransko vezanega receptorja, ki veže fragment Fc protitelesa IgG, so celice HEK293T transfecirali z ustreznimi konstrukti, po 12 urah so izvedli indukcijo z ligandom, rezultate pa posneli 24 ur kasneje s fluorescenčno mikroskopijo. Znotrajcelični del receptorja MESA sestavljata N- in C-fragment razcepljene proteaze TEV, ki se po vezavi liganda povežeta v aktivno proteazo. Ta nato cepi v membrano zasidran tetraciklinski transaktivator (tTA), ki je povezan z modrim fluorescenčnim proteinom (BFP). tTA se po cepitvi prenese v jedro in se veže na odzivni element za tetraciklin (TRE) ter aktivira izražanje rumenega fluorescenčnega proteina (YFP). Pri treh kontrolnih vzorcih (receptor MESA, receptor MESA + tTA-BFP, receptor MESA + konstrukt za YFP) pričakovano niso opazili modre in rumene fluorescence. Presenetljivo je, da pri kontroli s kombinacijo receptorja in tTA-BFP ni bilo opaznega signala modre fluorescence, čeprav bi se BFP moral izražati na membrani celic. Raziskovalci tega niso pripisali neuspešni transkripciji, pač pa prenasičenju tTA-BFP, saj ta nima mesta, kamor bi se tarčno vezal. Posledično lahko pride do nepravilnega zvitja proteina, celo njegove razgradnje ali do dušenja fluorescence. Ko so celice transfecirali s celotnim sistemom (MESA + tTA-BFP + YFP) so pri neinduciranem stanju opazili šibko modro in rumeno fluorescenco, kar kaže na nizko stopnjo bazalne aktivacije. Po indukciji z IgG Fc se je signal YFP močno ojačal, modra fluorescenca pa je ostala podobna neinduciranem. Tako so uspešno validirali receptor, zasnovan z orodjem MESA Designer.		Da bi preverili delovanje programsko načrtanega membransko vezanega receptorja, ki veže fragment Fc protitelesa IgG, so celice HEK293T transfecirali z ustreznimi konstrukti, po 12 urah so izvedli indukcijo z ligandom, rezultate pa posneli 24 ur kasneje s fluorescenčno mikroskopijo. Znotrajcelični del receptorja MESA sestavljata N- in C-fragment razcepljene proteaze TEV, ki se po vezavi liganda povežeta v aktivno proteazo. Ta nato cepi v membrano zasidran tetraciklinski transaktivator (tTA), ki je povezan z modrim fluorescenčnim proteinom (BFP). tTA se po cepitvi prenese v jedro in se veže na odzivni element za tetraciklin (TRE) ter aktivira izražanje rumenega fluorescenčnega proteina (YFP). Pri treh kontrolnih vzorcih (receptor MESA, receptor MESA + tTA-BFP, receptor MESA + konstrukt za YFP) pričakovano niso opazili modre in rumene fluorescence. Presenetljivo je, da pri kontroli s kombinacijo receptorja in tTA-BFP ni bilo opaznega signala modre fluorescence, čeprav bi se BFP moral izražati na membrani celic. Raziskovalci tega niso pripisali neuspešni transkripciji, pač pa prenasičenju tTA-BFP, saj ta nima mesta, kamor bi se tarčno vezal. Posledično lahko pride do nepravilnega zvitja proteina, celo njegove razgradnje ali do dušenja fluorescence. Ko so celice transfecirali s celotnim sistemom (MESA + tTA-BFP + YFP) so pri neinduciranem stanju opazili šibko modro in rumeno fluorescenco, kar kaže na nizko stopnjo bazalne aktivacije. Po indukciji z IgG Fc se je signal YFP močno ojačal, modra fluorescenca pa je ostala podobna neinduciranem. Tako so uspešno validirali receptor, zasnovan z orodjem MESA Designer.

Lucija Kovaček at 20:19, 3 May 2026

2026-05-03T20:19:44Z

← Older revision		Revision as of 20:19, 3 May 2026
Line 37:		Line 37:
	===Tirozinaze===		===Tirozinaze===

	Ključen encim biosenzorskega sistema je tirozinaza, ki ima v aktivnem mestu prisotna dva bakrova iona, koordinirana s šestimi His. Poleg osrednje domene iz štirih α-vijačnic, lahko tirozinaze vsebujejo še N-končno domeno (NTD) in C-končno domeno (CTD), ki uravnavata aktivnost. Ekipa si je izbrala tri glavne pristope regulacije tirozinaz. Prvi je bil z razcepljenimi tirozinazami, ki se aktivirajo šele, ko se uspešno sestavijo proteinske nanokletke (BmTyr iz ''Bacillus megaterium''). Drugi pristop je povezan s proteinom Caddie, ki prenaša baker v aktivno mesto in je zato nujen za delovanje, aktivacija pa je zopet vezana tudi na sestavljanje nanokletke (tirozinazi SavMel iz ''Streptomyces avermitilis'' in SkMel iz ''Streptomyces kathirae''). Zadnji temelji na C-končni domeni Lid, ki kot »pokrov« blokira dostop substrata do aktivnega mesta. Encim se aktivira šele po proteolitični cepitvi domene (tirozinazi ~~HcTyr1~~ iz ''Hahella'' in VsTyr iz ''Verrucomicrobium spinosum'').		Ključen encim biosenzorskega sistema je tirozinaza, ki ima v aktivnem mestu prisotna dva bakrova iona, koordinirana s šestimi His. Poleg osrednje domene iz štirih α-vijačnic, lahko tirozinaze vsebujejo še N-končno domeno (NTD) in C-končno domeno (CTD), ki uravnavata aktivnost. Ekipa si je izbrala tri glavne pristope regulacije tirozinaz. Prvi je bil z razcepljenimi tirozinazami, ki se aktivirajo šele, ko se uspešno sestavijo proteinske nanokletke (BmTyr iz ''Bacillus megaterium''). Drugi pristop je povezan s proteinom Caddie, ki prenaša baker v aktivno mesto in je zato nujen za delovanje, aktivacija pa je zopet vezana tudi na sestavljanje nanokletke (tirozinazi SavMel iz ''Streptomyces avermitilis'' in SkMel iz ''Streptomyces kathirae''). Zadnji temelji na C-končni domeni Lid, ki kot »pokrov« blokira dostop substrata do aktivnega mesta. Encim se aktivira šele po proteolitični cepitvi domene (tirozinazi HcTyr iz ''Hahella'' in VsTyr iz ''Verrucomicrobium spinosum'').

	Po neuspešnih poskusih izražanja v brezceličnem sistemu, so naredili transformacijo celic ''E. coli'' BL21[DE3] z vektorjem pET21b, ki je nosil zapis za različico tirozinaze. Očiščene encime so nanesli na NaDS-PAGE, nato so preverili še aktivnost z merjenjem absorbance pri 490 nm. Zaradi časovne stiske in težav niso uspeli izolirati, očistiti in detektirati tirozinaz. Izjema je bila le HcTyr, ki so ji nato dodali proteazo TEV in izmerili povečanje absorbance, s čimer so potrdili uspešno sintezo melanina s pristopom z domeno Lid.		Po neuspešnih poskusih izražanja v brezceličnem sistemu, so naredili transformacijo celic ''E. coli'' BL21[DE3] z vektorjem pET21b, ki je nosil zapis za različico tirozinaze. Očiščene encime so nanesli na NaDS-PAGE gel, nato so preverili še aktivnost z merjenjem absorbance pri 490 nm. Zaradi časovne stiske in težav niso uspeli izolirati, očistiti in detektirati tirozinaz. Izjema je bila le HcTyr, ki so ji nato dodali proteazo TEV in izmerili povečanje absorbance, s čimer so potrdili uspešno sintezo melanina s pristopom z domeno Lid.

	==Zaključek==		==Zaključek==

			InkSight predstavlja pomemben korak k personalizirani medicini in iznajdljivo združuje sintezno biologijo s tradicijo tetovaž. Raziskovalci so uspešno razvili in eksperimentalno ovrednotili vse tri glavne komponente biosenzorskega sistema, čeprav ta kot celota od biomarkerja do sintetiziranega melanina še ni bil vzpostavljen. V prihodnjih študijah bo potrebno celice integrirati v biokompatibilen hidrogel, sistem razširiti na terapevtsko relevantne ligande (npr. progesteron), smiselno pa bi bilo preizkusiti še druge pigmente in razviti digitalni vmesnik, ki bi objektivno določil barvno spremembo.

	==Viri==		==Viri==
	[1] Inksight. InkSight - The Living Tattoo. https://2025.igem.wiki/munich/ (pridobljeno 3. maj 2026).		[1] Inksight. InkSight - The Living Tattoo. https://2025.igem.wiki/munich/ (pridobljeno 3. maj 2026).

Lucija Kovaček at 19:06, 3 May 2026

2026-05-03T19:06:44Z

@@ Line 1: / Line 1: @@
 [https://2025.igem.wiki/munich/ InkSight] je projekt skupine iz Münchna, ki je bil leta 2025 na tekmovanju iGEM nagrajen kot najboljši na področju diagnostike.
 ==Uvod==
 ==Opis projekta==
-==Načrtovanje in eksperimentalno delo==
+Skupina je pri projektu InkSight zasnovala spremenjene sesalske celice v hidrogelu, ki jih je mogoče vbrizgati v povrhnjico kot biosenzorsko tetovažo. Celice lahko prepoznajo specifične biomarkerje v intersticijski tekočini in pri tem sprožijo sintezo melanina, kar povzroči vidno spremembo barve kože. Tak sistem bi omogočal neprekinjeno spremljanje biomarkerjev v realnem času in nadomeščal klasično, včasih invazivno, laboratorijsko diagnostiko.
 ==Zaključek==
 ==Viri==

Lucija Kovaček at 15:24, 2 May 2026

2026-05-02T15:24:54Z

← Older revision		Revision as of 15:24, 2 May 2026
Line 1:		Line 1:
	[https://2025.igem.wiki/munich/ InkSight] je projekt skupine iz Münchna, ki je bil nagrajen kot najboljši na področju diagnostike.		[https://2025.igem.wiki/munich/ InkSight] je projekt skupine iz Münchna, ki je bil leta 2025 na tekmovanju iGEM nagrajen kot najboljši na področju diagnostike.
	==Uvod==		==Uvod==
	==Opis projekta==		==Opis projekta==

Lucija Kovaček at 10:54, 2 May 2026

2026-05-02T10:54:22Z

← Older revision		Revision as of 10:54, 2 May 2026
Line 1:		Line 1:
			[https://2025.igem.wiki/munich/ InkSight] je projekt skupine iz Münchna, ki je bil nagrajen kot najboljši na področju diagnostike.
	==Uvod==		==Uvod==
	==Opis projekta==		==Opis projekta==

Lucija Kovaček: Created page with "==Uvod== ==Opis projekta== ==Načrtovanje in eksperimentalno delo== ==Zaključek== ==Viri=="

2026-05-01T16:55:11Z

Created page with "==Uvod== ==Opis projekta== ==Načrtovanje in eksperimentalno delo== ==Zaključek== ==Viri=="

New page

==Uvod==
==Opis projekta==
==Načrtovanje in eksperimentalno delo==
==Zaključek==
==Viri==