Katalitični mehanizem transpozaz - Revision history

Nusabrdnik at 09:48, 19 April 2022

2022-04-19T09:48:23Z

← Older revision		Revision as of 09:48, 19 April 2022
Line 65:		Line 65:


	Ime so dobile po aminokislinskem ostanku, ki se nahaja v aktivnem mestu transpozaze. Oba tipa transpozaz naj bi imela enako zvitje katalitične domene kot serinske in tirozinske rekombinaze in za oba tipa je značilno, da “transpozirajo” konjugativne elemente (“ICS-je”), pri čemer nastanejo ciklični intermediati~~. Nato~~ se ena veriga lahko prenese v tarčno celico in z replikacijo nastane dvoverižni transpozon, ki se vstavi v genom.		Ime so dobile po aminokislinskem ostanku, ki se nahaja v aktivnem mestu transpozaze. Oba tipa transpozaz naj bi imela enako zvitje katalitične domene kot serinske in tirozinske rekombinaze in za oba tipa je značilno, da “transpozirajo” konjugativne elemente (“ICS-je”), pri čemer nastanejo ciklični intermediati, nato se ena veriga lahko prenese v tarčno celico in z replikacijo nastane dvoverižni transpozon, ki se vstavi v genom.

Maj at 11:33, 18 April 2022

2022-04-18T11:33:11Z

← Older revision		Revision as of 11:33, 18 April 2022
Line 71:		Line 71:


	Obstajajo 4 družine serinskih transpozaz, ki se razlikujejo po organizaciji domen in njihovem delovanju. Razcep DNA verige poteka prek serinskega nukleofila v aktivnem mestu, zanj ni potrebna prisotnost kovinskih ionov ali drugih kofaktorjev, igrajo pa pomembno vlogo argininski ostanki ob aktivnem mestu ( v primeru transpozaze Sin je eden izmed njih Arg-69, ki deluje kot kislina in protonira 3´ kisik pri cepitvi, arg-66 pa stabilizira celoten prehodni kompleks. Ostali arginini sodelujejo pri vezavi H+ ionov in usedanju DNA v aktivno mesto).		Obstajajo 4 družine serinskih transpozaz, ki se razlikujejo po organizaciji domen in njihovem delovanju. Razcep DNA verige poteka prek serinskega nukleofila v aktivnem mestu, zanj ni potrebna prisotnost kovinskih ionov ali drugih kofaktorjev, igrajo pa pomembno vlogo argininski ostanki ob aktivnem mestu (v primeru transpozaze Sin je eden izmed njih Arg-69, ki deluje kot kislina in protonira 3´ kisik pri cepitvi, arg-66 pa stabilizira celoten prehodni kompleks. Ostali arginini sodelujejo pri vezavi H+ ionov in usedanju DNA v aktivno mesto).

	Serinske transpozaze cepijo DNA s pomočjo serinskega ostanka, kar tvori 5’-fosfoserinsko vez in reaktivno 3’-OH skupino. Predpostavljen mehanizem delovanja je sledeč: po dve serinski transpozazi se vežeta na cepitveno mesto verige kot dimer, reakcija izmenjave pa poteka v tetramerni strukturi. Štiri serinske transpozaze tvorijo tetramerno strukturo, kjer vsaka izmed transpozaz cepi eno verigo. Dve izmed štirih podenot nato rotirata za 180°, tako da ponovno poravnata cepljene konce. Sledi napad 5’-fosfoserinskih vezi z reaktivnima 3´ –OH koncema, kar razreši strukturo. Reakcija je najverjetneje regulirana na nivoju prehoda dimera v tetramer. Nekateri podatki kažejo, da je že za cepitev DNA verige potrebna tetramerna oblika.		Serinske transpozaze cepijo DNA s pomočjo serinskega ostanka, kar tvori 5’-fosfoserinsko vez in reaktivno 3’-OH skupino. Predpostavljen mehanizem delovanja je sledeč: po dve serinski transpozazi se vežeta na cepitveno mesto verige kot dimer, reakcija izmenjave pa poteka v tetramerni strukturi. Štiri serinske transpozaze tvorijo tetramerno strukturo, kjer vsaka izmed transpozaz cepi eno verigo. Dve izmed štirih podenot nato rotirata za 180°, tako da ponovno poravnata cepljene konce. Sledi napad 5’-fosfoserinskih vezi z reaktivnima 3´ –OH koncema, kar razreši strukturo. Reakcija je najverjetneje regulirana na nivoju prehoda dimera v tetramer. Nekateri podatki kažejo, da je že za cepitev DNA verige potrebna tetramerna oblika.

Maj at 11:29, 18 April 2022

2022-04-18T11:29:49Z

← Older revision		Revision as of 11:29, 18 April 2022
Line 49:		Line 49:


	Ime katalitične domene se nanaša na dva ohranjena histidina v katalitičnem mestu, ločena z enim hidrofobnim ostankom, ki koordinirata dvovalentni kovinski ion; Mg2+. Enoverižne DNA transpozaze se vežejo na transpozone, kadar so ti v enoverižni obliki, npr. na ~~zaostajajoči~~ verigi med DNA replikacijo ali med določenimi tipi popravljanja DNA.		Ime katalitične domene se nanaša na dva ohranjena histidina v katalitičnem mestu, ločena z enim hidrofobnim ostankom, ki koordinirata dvovalentni kovinski ion; Mg2+. Enoverižne DNA transpozaze se vežejo na transpozone, kadar so ti v enoverižni obliki, npr. na zastajajoči verigi med DNA replikacijo ali med določenimi tipi popravljanja DNA.

	Ker je mehanizem za družine IS200/IS605 HUH transpozaz najbolje preučen, se bomo v nadaljevanju osredotočili na le tega. Zanimivo pri transpozazah IS200/IS605 je, da nimajo inverznih zaporedij na koncih, temveč palindromska. Za razliko od večine DNA transpozaz, transpozaze IS200/IS605 zmeraj vstavijo le 3’ konec kratkega specifičnega zaporedja nukleotidov.		Ker je mehanizem za družine IS200/IS605 HUH transpozaz najbolje preučen, se bomo v nadaljevanju osredotočili na le tega. Zanimivo pri transpozazah IS200/IS605 je, da nimajo inverznih zaporedij na koncih, temveč palindromska. Za razliko od večine DNA transpozaz, transpozaze IS200/IS605 zmeraj vstavijo le 3’ konec kratkega specifičnega zaporedja nukleotidov.

Maj at 11:17, 18 April 2022

2022-04-18T11:17:25Z

← Older revision		Revision as of 11:17, 18 April 2022
Line 24:		Line 24:

	Ko RNazi H-podobna transpozaza prepozna tarčno zaporedje lahko prenos poteče preko dveh mehanizmov:		Ko RNazi H-podobna transpozaza prepozna tarčno zaporedje lahko prenos poteče preko dveh mehanizmov:


	''Replikativni mehanizem (copy and paste)''		''Replikativni mehanizem (copy and paste)''
Line 29:		Line 30:
	Transpozaza naredi zarezo na začetku in koncu transpozona. To ustvari dva reaktivna konca, ki napadeta tarčno zaporedje, kar na tarčni DNA ustvari zamaknjen zarez. DNA polimeraza podvoji obe nastali vrzeli, dokončno pa ju zlepi DNA ligaza. Sledi rekombinacija (crossing-over). Dobimo začetni transpozon in pa novo kopijo le-tega obdanega s tarčnim zaporedjem tako z leve kot z desne. Takšen mehanizem najdemo pri bakteriofagu Mu in pri družini transpozaz Tn3.		Transpozaza naredi zarezo na začetku in koncu transpozona. To ustvari dva reaktivna konca, ki napadeta tarčno zaporedje, kar na tarčni DNA ustvari zamaknjen zarez. DNA polimeraza podvoji obe nastali vrzeli, dokončno pa ju zlepi DNA ligaza. Sledi rekombinacija (crossing-over). Dobimo začetni transpozon in pa novo kopijo le-tega obdanega s tarčnim zaporedjem tako z leve kot z desne. Takšen mehanizem najdemo pri bakteriofagu Mu in pri družini transpozaz Tn3.

	Malce drugačen je ~~t. i. “copy and paste”~~ mehanizem. Transpozaza zbliža konca transpozona in na začetku naredi zarezo. Reaktivni konec napade konec transpozona in tvori “mostiček” med koncem in začetkom transpozona v obliki ssDNA (če se proces dogaja na plazmidu, na tej točki DNA izgleda kot številka 8, zato intermediatu pravimo tudi “figure-of-eight” intermediat). DNA polimeraza podvoji celoten transpozon – nastane cikličen intermediat, ki se približa tarčnemu zaporedju. Ponovno pride do hidrolitične cepitve, a tokrat na obeh verigah transpozona. Nastala reaktivna konca napadeta tarčno zaporedje, DNA polimeraza in ligaza pa ponvono zapolnita nastale vrzeli. Dobimo kopijo transpozona na novem mestu v genomu, obdanega s tarčnim zaporedjem z leve in desne strani. Takšen mehanizem je značilen za transpozaze družine IS3.		Malce drugačen je sledeči mehanizem. Transpozaza zbliža konca transpozona in na začetku naredi zarezo. Reaktivni konec napade konec transpozona in tvori “mostiček” med koncem in začetkom transpozona v obliki ssDNA (če se proces dogaja na plazmidu, na tej točki DNA izgleda kot številka 8, zato intermediatu pravimo tudi “figure-of-eight” intermediat). DNA polimeraza podvoji celoten transpozon – nastane cikličen intermediat, ki se približa tarčnemu zaporedju. Ponovno pride do hidrolitične cepitve, a tokrat na obeh verigah transpozona. Nastala reaktivna konca napadeta tarčno zaporedje, DNA polimeraza in ligaza pa ponvono zapolnita nastale vrzeli. Dobimo kopijo transpozona na novem mestu v genomu, obdanega s tarčnim zaporedjem z leve in desne strani. Takšen mehanizem je značilen za transpozaze družine IS3.


	''Konzervativni mehanizem (cut and paste)''		''Konzervativni mehanizem (cut and paste)''
Line 40:		Line 42:

	-Reaktivna konca napadeta nasprotno verigo in tvorita lasnični strukturi na donorski DNA, transpozon pa obdrži reaktivna konca s katerima lahko napade tarčno DNA. Takšen mehanizem je zaenkrat poznan le pri evkariotskih transpozazah.		-Reaktivna konca napadeta nasprotno verigo in tvorita lasnični strukturi na donorski DNA, transpozon pa obdrži reaktivna konca s katerima lahko napade tarčno DNA. Takšen mehanizem je zaenkrat poznan le pri evkariotskih transpozazah.


	'''HUH enoverižne transpozaze (IS200, IS605 družine) '''		'''HUH enoverižne transpozaze (IS200, IS605 družine) '''
Line 55:		Line 58:

	Transpozicija se začne z vezavo TnpA transpozaze (ki je v obliki dimera) na lasnične zanke, ki jih oblikujeta desni in levi konec enoverižne DNA (palindromska zaporedja na koncih transpozona). Desni in levi konec se razlikujeta v le eni bazi lasnične zanke. Prvi monomer se veže na desni konec, drugi pa na levi konec. Ta vezava sproži konformacijske spremembe na transpozazi, pri katerih se heliks αD premakne v aktivirano pozicijo, kar oblikuje aktivno mesto. V aktivno mesto se veže dvovalentni kovinski ion (Mn2+/Mg2+), ki lokalizira in polarizira tarčni fosfat, da lahko poteče nukleofilni napad tirozina (Y127) na tarčni fosfat. Tirozin se kovalentno veže na 5’ konec transpozona. Na levem koncu je to 5’ konec transpozona, na desnem koncu pa se TnpA veže na 5’ konec ssDNA, ki ni transpozon (donorska DNA). Po cepitvi transpozona od preostale ssDNA, nastane ciklični intermediat. TnpA uporabi vezano transpozonsko dna za integracijo transpozona v tarčno dna, torej ne potrebuje dodatne DNA vezavne domene. Donorsko DNA nadomesti tarčna DNA, ki jo prepozna preko kratkega nukleotidnega zaporedja na levem koncu transpozona. Mehanizem integracije poteka zelo podobno kot mehanizem izrezovanja. Tarčna DNA je usmerjena v aktivno mesto, pride do cepitve na tarčni dna, fosfotirozinski intermediati se sprostijo, spremeni se konformacija aktivnega mesta, kar privede do reorganizacije DNA, da nastane tarčna DNA z vključenim transpozonom.		Transpozicija se začne z vezavo TnpA transpozaze (ki je v obliki dimera) na lasnične zanke, ki jih oblikujeta desni in levi konec enoverižne DNA (palindromska zaporedja na koncih transpozona). Desni in levi konec se razlikujeta v le eni bazi lasnične zanke. Prvi monomer se veže na desni konec, drugi pa na levi konec. Ta vezava sproži konformacijske spremembe na transpozazi, pri katerih se heliks αD premakne v aktivirano pozicijo, kar oblikuje aktivno mesto. V aktivno mesto se veže dvovalentni kovinski ion (Mn2+/Mg2+), ki lokalizira in polarizira tarčni fosfat, da lahko poteče nukleofilni napad tirozina (Y127) na tarčni fosfat. Tirozin se kovalentno veže na 5’ konec transpozona. Na levem koncu je to 5’ konec transpozona, na desnem koncu pa se TnpA veže na 5’ konec ssDNA, ki ni transpozon (donorska DNA). Po cepitvi transpozona od preostale ssDNA, nastane ciklični intermediat. TnpA uporabi vezano transpozonsko dna za integracijo transpozona v tarčno dna, torej ne potrebuje dodatne DNA vezavne domene. Donorsko DNA nadomesti tarčna DNA, ki jo prepozna preko kratkega nukleotidnega zaporedja na levem koncu transpozona. Mehanizem integracije poteka zelo podobno kot mehanizem izrezovanja. Tarčna DNA je usmerjena v aktivno mesto, pride do cepitve na tarčni dna, fosfotirozinski intermediati se sprostijo, spremeni se konformacija aktivnega mesta, kar privede do reorganizacije DNA, da nastane tarčna DNA z vključenim transpozonom.


	'''SERINSKE IN TIROZINSKE TRANSPOZAZE '''		'''SERINSKE IN TIROZINSKE TRANSPOZAZE '''
Line 61:		Line 65:


	Ime so dobile po aminokislinskem ostanku, ki se nahaja v aktivnem mestu transpozaze. Oba tipa transpozaz naj bi imela enako zvitje katalitične domene kot serinske in tirozinske rekombinaze in za oba tipa je značilno, da “transpozirajo” konjugativne elemente (“ICS-je”), pri čemer nastanejo ciklični intermediati. Nato se ena veriga lahko prenese v tarčno celico in z replikacijo nastane dvoverižni transpozon, ki se vstavi v genom.		Ime so dobile po aminokislinskem ostanku, ki se nahaja v aktivnem mestu transpozaze. Oba tipa transpozaz naj bi imela enako zvitje katalitične domene kot serinske in tirozinske rekombinaze in za oba tipa je značilno, da “transpozirajo” konjugativne elemente (“ICS-je”), pri čemer nastanejo ciklični intermediati. Nato se ena veriga lahko prenese v tarčno celico in z replikacijo nastane dvoverižni transpozon, ki se vstavi v genom.


	'''Serinske transpozaze'''		'''Serinske transpozaze'''
Line 69:		Line 74:

	Serinske transpozaze cepijo DNA s pomočjo serinskega ostanka, kar tvori 5’-fosfoserinsko vez in reaktivno 3’-OH skupino. Predpostavljen mehanizem delovanja je sledeč: po dve serinski transpozazi se vežeta na cepitveno mesto verige kot dimer, reakcija izmenjave pa poteka v tetramerni strukturi. Štiri serinske transpozaze tvorijo tetramerno strukturo, kjer vsaka izmed transpozaz cepi eno verigo. Dve izmed štirih podenot nato rotirata za 180°, tako da ponovno poravnata cepljene konce. Sledi napad 5’-fosfoserinskih vezi z reaktivnima 3´ –OH koncema, kar razreši strukturo. Reakcija je najverjetneje regulirana na nivoju prehoda dimera v tetramer. Nekateri podatki kažejo, da je že za cepitev DNA verige potrebna tetramerna oblika.		Serinske transpozaze cepijo DNA s pomočjo serinskega ostanka, kar tvori 5’-fosfoserinsko vez in reaktivno 3’-OH skupino. Predpostavljen mehanizem delovanja je sledeč: po dve serinski transpozazi se vežeta na cepitveno mesto verige kot dimer, reakcija izmenjave pa poteka v tetramerni strukturi. Štiri serinske transpozaze tvorijo tetramerno strukturo, kjer vsaka izmed transpozaz cepi eno verigo. Dve izmed štirih podenot nato rotirata za 180°, tako da ponovno poravnata cepljene konce. Sledi napad 5’-fosfoserinskih vezi z reaktivnima 3´ –OH koncema, kar razreši strukturo. Reakcija je najverjetneje regulirana na nivoju prehoda dimera v tetramer. Nekateri podatki kažejo, da je že za cepitev DNA verige potrebna tetramerna oblika.


	'''Tirozinske transpozaze'''		'''Tirozinske transpozaze'''

Maj at 11:15, 18 April 2022

2022-04-18T11:15:30Z

← Older revision		Revision as of 11:15, 18 April 2022
Line 12:		Line 12:

	'''RNazi H-podobne transpozaze (Tn5) '''		'''RNazi H-podobne transpozaze (Tn5) '''

	~~----~~


Line 23:		Line 21:

	'''Razlika med replikativnimi in nereplikativnimi transpozazami'''		'''Razlika med replikativnimi in nereplikativnimi transpozazami'''

Maj at 11:13, 18 April 2022

2022-04-18T11:13:00Z

← Older revision		Revision as of 11:13, 18 April 2022
Line 16:		Line 16:


	RNazi H podobne transpozaze imajo v svojem aktivnem mestu motiv treh značilnih aminokislinskih ostankov (DDD ali DDE). Ti aminokislinski ostanki, koordinirajo dva Mg2+ iona, ki aktivirata molekulo vode ali 3´ OH skupino nukleotida in jo pripravita za ~~nukleotidni~~ napad na fosfodiestrsko vez. Motiv DDE/DDD je visoko konzervativen. Če katerega izmed teh ostankov mutiramo iz karboksilatnega v karboksiamidnega, transpozaza postane neaktivna. V primeru napada vode dobimo kot produkt 3´OH skupino in 5´fosfat, v primeru, da napada druga veriga DNA pa se le zamenja povezani nukleotid. Oba mehanizma sta nukleofilni substituciji SN2. Zanimivo, kljub podobnosti Mg2+ in Ca2+ ionov, kalcijevi ioni niso zmožni katalizirati reakcije. Razlog za to še ni znan.		RNazi H podobne transpozaze imajo v svojem aktivnem mestu motiv treh značilnih aminokislinskih ostankov (DDD ali DDE). Ti aminokislinski ostanki, koordinirajo dva Mg2+ iona, ki aktivirata molekulo vode ali 3´ OH skupino nukleotida in jo pripravita za nukleofilni napad na fosfodiestrsko vez. Motiv DDE/DDD je visoko konzervativen. Če katerega izmed teh ostankov mutiramo iz karboksilatnega v karboksiamidnega, transpozaza postane neaktivna. V primeru napada vode dobimo kot produkt 3´OH skupino in 5´fosfat, v primeru, da napada druga veriga DNA pa se le zamenja povezani nukleotid. Oba mehanizma sta nukleofilni substituciji SN2. Zanimivo, kljub podobnosti Mg2+ in Ca2+ ionov, kalcijevi ioni niso zmožni katalizirati reakcije. Razlog za to še ni znan.

	Pri RNazi H podobnih transpozazah ključno vlogo igrata prav ta dva Mg2+ iona. Ion B koordinira vodo (OH- anion), kjer ima kisik prosti nevezni elektronski par orientiran proti fosforju v DNA, medtem ko ion A deluje kot Lewisova kislina in omogoča izstop izstopajoče skupine ter stabilizira prehodno stanje prek interakcij z bližnjimi kisikovimi atomi. Pri reakciji zamenjave DNA verig pa iona zamenjata vlogi. Ko se torej izrezani del DNA verige, ki ga prenaša transpozaza veže na drugo mesto v genomu, Ion A koordinira vodo in omogoča nukleofilni napad, ion B pa stabilizira intermediate. To je verjetno posledica tega, da 3´-OH konec transpozona ostaja koordiniran na isti kovinski ion skozi cel proces. Ta mehanizem se imenuje ping-pong mehanizem.		Pri RNazi H podobnih transpozazah ključno vlogo igrata prav ta dva Mg2+ iona. Ion B koordinira vodo (OH- anion), kjer ima kisik prosti nevezni elektronski par orientiran proti fosforju v DNA, medtem ko ion A deluje kot Lewisova kislina in omogoča izstop izstopajoče skupine ter stabilizira prehodno stanje prek interakcij z bližnjimi kisikovimi atomi. Pri reakciji zamenjave DNA verig pa iona zamenjata vlogi. Ko se torej izrezani del DNA verige, ki ga prenaša transpozaza veže na drugo mesto v genomu, Ion A koordinira vodo in omogoča nukleofilni napad, ion B pa stabilizira intermediate. To je verjetno posledica tega, da 3´-OH konec transpozona ostaja koordiniran na isti kovinski ion skozi cel proces. Ta mehanizem se imenuje ping-pong mehanizem.

Mark Loborec at 14:06, 17 April 2022

2022-04-17T14:06:21Z

← Older revision		Revision as of 14:06, 17 April 2022
Line 68:		Line 68:

	'''Serinske transpozaze'''		'''Serinske transpozaze'''

	~~----~~


Line 77:		Line 75:

	'''Tirozinske transpozaze'''		'''Tirozinske transpozaze'''

	~~----~~

Mark Loborec at 14:05, 17 April 2022

2022-04-17T14:05:43Z

Mark Loborec at 14:03, 17 April 2022

2022-04-17T14:03:56Z

← Older revision		Revision as of 14:03, 17 April 2022
Line 19:		Line 19:


	''Razlika med replikativnimi in nereplikativnimi transpozazami''		'''Razlika med replikativnimi in nereplikativnimi transpozazami'''

			----


	Ko RNazi H-podobna transpozaza prepozna tarčno zaporedje lahko prenos poteče preko dveh mehanizmov:		Ko RNazi H-podobna transpozaza prepozna tarčno zaporedje lahko prenos poteče preko dveh mehanizmov:

Nusabrdnik at 13:56, 17 April 2022

2022-04-17T13:56:44Z

← Older revision		Revision as of 13:56, 17 April 2022
Line 23:		Line 23:
	Ko RNazi H-podobna transpozaza prepozna tarčno zaporedje lahko prenos poteče preko dveh mehanizmov:		Ko RNazi H-podobna transpozaza prepozna tarčno zaporedje lahko prenos poteče preko dveh mehanizmov:

	Replikativni mehanizem (copy and paste)		'''Replikativni mehanizem (copy and paste)'''

	Transpozaza naredi zarezo na začetku in koncu transpozona. To ustvari dva reaktivna konca, ki napadeta tarčno zaporedje, kar na tarčni DNA ustvari zamaknjen zarez. DNA polimeraza podvoji obe nastali vrzeli, dokončno pa ju zlepi DNA ligaza. Sledi rekombinacija (crossing-over). Dobimo začetni transpozon in pa novo kopijo le-tega obdanega s tarčnim zaporedjem tako z leve kot z desne. Takšen mehanizem najdemo pri bakteriofagu Mu in pri družini transpozaz Tn3.		Transpozaza naredi zarezo na začetku in koncu transpozona. To ustvari dva reaktivna konca, ki napadeta tarčno zaporedje, kar na tarčni DNA ustvari zamaknjen zarez. DNA polimeraza podvoji obe nastali vrzeli, dokončno pa ju zlepi DNA ligaza. Sledi rekombinacija (crossing-over). Dobimo začetni transpozon in pa novo kopijo le-tega obdanega s tarčnim zaporedjem tako z leve kot z desne. Takšen mehanizem najdemo pri bakteriofagu Mu in pri družini transpozaz Tn3.
Line 29:		Line 29:
	Malce drugačen je t. i. “copy and paste” mehanizem. Transpozaza zbliža konca transpozona in na začetku naredi zarezo. Reaktivni konec napade konec transpozona in tvori “mostiček” med koncem in začetkom transpozona v obliki ssDNA (če se proces dogaja na plazmidu, na tej točki DNA izgleda kot številka 8, zato intermediatu pravimo tudi “figure-of-eight” intermediat). DNA polimeraza podvoji celoten transpozon – nastane cikličen intermediat, ki se približa tarčnemu zaporedju. Ponovno pride do hidrolitične cepitve, a tokrat na obeh verigah transpozona. Nastala reaktivna konca napadeta tarčno zaporedje, DNA polimeraza in ligaza pa ponvono zapolnita nastale vrzeli. Dobimo kopijo transpozona na novem mestu v genomu, obdanega s tarčnim zaporedjem z leve in desne strani. Takšen mehanizem je značilen za transpozaze družine IS3.		Malce drugačen je t. i. “copy and paste” mehanizem. Transpozaza zbliža konca transpozona in na začetku naredi zarezo. Reaktivni konec napade konec transpozona in tvori “mostiček” med koncem in začetkom transpozona v obliki ssDNA (če se proces dogaja na plazmidu, na tej točki DNA izgleda kot številka 8, zato intermediatu pravimo tudi “figure-of-eight” intermediat). DNA polimeraza podvoji celoten transpozon – nastane cikličen intermediat, ki se približa tarčnemu zaporedju. Ponovno pride do hidrolitične cepitve, a tokrat na obeh verigah transpozona. Nastala reaktivna konca napadeta tarčno zaporedje, DNA polimeraza in ligaza pa ponvono zapolnita nastale vrzeli. Dobimo kopijo transpozona na novem mestu v genomu, obdanega s tarčnim zaporedjem z leve in desne strani. Takšen mehanizem je značilen za transpozaze družine IS3.

	Konzervativni mehanizem (cut and paste)		'''Konzervativni mehanizem (cut and paste)'''

	Pri nereplikativnem mehanizmu transpozazi sprva zbližata konca transpozona. Sledi cepitev ene fosfodiestrske vezi na vsaki verigi na nasprotnima koncema, kar ustvari dva reaktivna 3’-OH konca. Proces se lahko nadaljuje po eni od treh poti:		Pri nereplikativnem mehanizmu transpozazi sprva zbližata konca transpozona. Sledi cepitev ene fosfodiestrske vezi na vsaki verigi na nasprotnima koncema, kar ustvari dva reaktivna 3’-OH konca. Proces se lahko nadaljuje po eni od treh poti:
Line 41:		Line 41:
	'''HUH enoverižne transpozaze (IS200, IS605 družine)		'''HUH enoverižne transpozaze (IS200, IS605 družine)
	'''		'''

	Ime katalitične domene se nanaša na dva ohranjena histidina v katalitičnem mestu, ločena z enim hidrofobnim ostankom, ki koordinirata dvovalentni kovinski ion; Mg2+. Enoverižne DNA transpozaze se vežejo na transpozone, kadar so ti v enoverižni obliki, npr. na zaostajajoči verigi med DNA replikacijo ali med določenimi tipi popravljanja DNA.		Ime katalitične domene se nanaša na dva ohranjena histidina v katalitičnem mestu, ločena z enim hidrofobnim ostankom, ki koordinirata dvovalentni kovinski ion; Mg2+. Enoverižne DNA transpozaze se vežejo na transpozone, kadar so ti v enoverižni obliki, npr. na zaostajajoči verigi med DNA replikacijo ali med določenimi tipi popravljanja DNA.

← Older revision		Revision as of 14:05, 17 April 2022
Line 12:		Line 12:

	'''RNazi H-podobne transpozaze (Tn5) '''		'''RNazi H-podobne transpozaze (Tn5) '''

			----


	RNazi H podobne transpozaze imajo v svojem aktivnem mestu motiv treh značilnih aminokislinskih ostankov (DDD ali DDE). Ti aminokislinski ostanki, koordinirajo dva Mg2+ iona, ki aktivirata molekulo vode ali 3´ OH skupino nukleotida in jo pripravita za nukleotidni napad na fosfodiestrsko vez. Motiv DDE/DDD je visoko konzervativen. Če katerega izmed teh ostankov mutiramo iz karboksilatnega v karboksiamidnega, transpozaza postane neaktivna. V primeru napada vode dobimo kot produkt 3´OH skupino in 5´fosfat, v primeru, da napada druga veriga DNA pa se le zamenja povezani nukleotid. Oba mehanizma sta nukleofilni substituciji SN2. Zanimivo, kljub podobnosti Mg2+ in Ca2+ ionov, kalcijevi ioni niso zmožni katalizirati reakcije. Razlog za to še ni znan.		RNazi H podobne transpozaze imajo v svojem aktivnem mestu motiv treh značilnih aminokislinskih ostankov (DDD ali DDE). Ti aminokislinski ostanki, koordinirajo dva Mg2+ iona, ki aktivirata molekulo vode ali 3´ OH skupino nukleotida in jo pripravita za nukleotidni napad na fosfodiestrsko vez. Motiv DDE/DDD je visoko konzervativen. Če katerega izmed teh ostankov mutiramo iz karboksilatnega v karboksiamidnega, transpozaza postane neaktivna. V primeru napada vode dobimo kot produkt 3´OH skupino in 5´fosfat, v primeru, da napada druga veriga DNA pa se le zamenja povezani nukleotid. Oba mehanizma sta nukleofilni substituciji SN2. Zanimivo, kljub podobnosti Mg2+ in Ca2+ ionov, kalcijevi ioni niso zmožni katalizirati reakcije. Razlog za to še ni znan.
Line 21:		Line 24:
	'''Razlika med replikativnimi in nereplikativnimi transpozazami'''		'''Razlika med replikativnimi in nereplikativnimi transpozazami'''

	~~----~~


	Ko RNazi H-podobna transpozaza prepozna tarčno zaporedje lahko prenos poteče preko dveh mehanizmov:		Ko RNazi H-podobna transpozaza prepozna tarčno zaporedje lahko prenos poteče preko dveh mehanizmov:

	'''Replikativni mehanizem (copy and paste)'''		''Replikativni mehanizem (copy and paste)''

	Transpozaza naredi zarezo na začetku in koncu transpozona. To ustvari dva reaktivna konca, ki napadeta tarčno zaporedje, kar na tarčni DNA ustvari zamaknjen zarez. DNA polimeraza podvoji obe nastali vrzeli, dokončno pa ju zlepi DNA ligaza. Sledi rekombinacija (crossing-over). Dobimo začetni transpozon in pa novo kopijo le-tega obdanega s tarčnim zaporedjem tako z leve kot z desne. Takšen mehanizem najdemo pri bakteriofagu Mu in pri družini transpozaz Tn3.		Transpozaza naredi zarezo na začetku in koncu transpozona. To ustvari dva reaktivna konca, ki napadeta tarčno zaporedje, kar na tarčni DNA ustvari zamaknjen zarez. DNA polimeraza podvoji obe nastali vrzeli, dokončno pa ju zlepi DNA ligaza. Sledi rekombinacija (crossing-over). Dobimo začetni transpozon in pa novo kopijo le-tega obdanega s tarčnim zaporedjem tako z leve kot z desne. Takšen mehanizem najdemo pri bakteriofagu Mu in pri družini transpozaz Tn3.
Line 32:		Line 35:
	Malce drugačen je t. i. “copy and paste” mehanizem. Transpozaza zbliža konca transpozona in na začetku naredi zarezo. Reaktivni konec napade konec transpozona in tvori “mostiček” med koncem in začetkom transpozona v obliki ssDNA (če se proces dogaja na plazmidu, na tej točki DNA izgleda kot številka 8, zato intermediatu pravimo tudi “figure-of-eight” intermediat). DNA polimeraza podvoji celoten transpozon – nastane cikličen intermediat, ki se približa tarčnemu zaporedju. Ponovno pride do hidrolitične cepitve, a tokrat na obeh verigah transpozona. Nastala reaktivna konca napadeta tarčno zaporedje, DNA polimeraza in ligaza pa ponvono zapolnita nastale vrzeli. Dobimo kopijo transpozona na novem mestu v genomu, obdanega s tarčnim zaporedjem z leve in desne strani. Takšen mehanizem je značilen za transpozaze družine IS3.		Malce drugačen je t. i. “copy and paste” mehanizem. Transpozaza zbliža konca transpozona in na začetku naredi zarezo. Reaktivni konec napade konec transpozona in tvori “mostiček” med koncem in začetkom transpozona v obliki ssDNA (če se proces dogaja na plazmidu, na tej točki DNA izgleda kot številka 8, zato intermediatu pravimo tudi “figure-of-eight” intermediat). DNA polimeraza podvoji celoten transpozon – nastane cikličen intermediat, ki se približa tarčnemu zaporedju. Ponovno pride do hidrolitične cepitve, a tokrat na obeh verigah transpozona. Nastala reaktivna konca napadeta tarčno zaporedje, DNA polimeraza in ligaza pa ponvono zapolnita nastale vrzeli. Dobimo kopijo transpozona na novem mestu v genomu, obdanega s tarčnim zaporedjem z leve in desne strani. Takšen mehanizem je značilen za transpozaze družine IS3.

	'''Konzervativni mehanizem (cut and paste)'''		''Konzervativni mehanizem (cut and paste)''

	Pri nereplikativnem mehanizmu transpozazi sprva zbližata konca transpozona. Sledi cepitev ene fosfodiestrske vezi na vsaki verigi na nasprotnima koncema, kar ustvari dva reaktivna 3’-OH konca. Proces se lahko nadaljuje po eni od treh poti:		Pri nereplikativnem mehanizmu transpozazi sprva zbližata konca transpozona. Sledi cepitev ene fosfodiestrske vezi na vsaki verigi na nasprotnima koncema, kar ustvari dva reaktivna 3’-OH konca. Proces se lahko nadaljuje po eni od treh poti:
Line 42:		Line 45:
	-Reaktivna konca napadeta nasprotno verigo in tvorita lasnični strukturi na donorski DNA, transpozon pa obdrži reaktivna konca s katerima lahko napade tarčno DNA. Takšen mehanizem je zaenkrat poznan le pri evkariotskih transpozazah.		-Reaktivna konca napadeta nasprotno verigo in tvorita lasnični strukturi na donorski DNA, transpozon pa obdrži reaktivna konca s katerima lahko napade tarčno DNA. Takšen mehanizem je zaenkrat poznan le pri evkariotskih transpozazah.

	'''HUH enoverižne transpozaze (IS200, IS605 družine)		'''HUH enoverižne transpozaze (IS200, IS605 družine) '''
	'''
			----


	Ime katalitične domene se nanaša na dva ohranjena histidina v katalitičnem mestu, ločena z enim hidrofobnim ostankom, ki koordinirata dvovalentni kovinski ion; Mg2+. Enoverižne DNA transpozaze se vežejo na transpozone, kadar so ti v enoverižni obliki, npr. na zaostajajoči verigi med DNA replikacijo ali med določenimi tipi popravljanja DNA.		Ime katalitične domene se nanaša na dva ohranjena histidina v katalitičnem mestu, ločena z enim hidrofobnim ostankom, ki koordinirata dvovalentni kovinski ion; Mg2+. Enoverižne DNA transpozaze se vežejo na transpozone, kadar so ti v enoverižni obliki, npr. na zaostajajoči verigi med DNA replikacijo ali med določenimi tipi popravljanja DNA.
Line 55:		Line 60:
	Transpozicija se začne z vezavo TnpA transpozaze (ki je v obliki dimera) na lasnične zanke, ki jih oblikujeta desni in levi konec enoverižne DNA (palindromska zaporedja na koncih transpozona). Desni in levi konec se razlikujeta v le eni bazi lasnične zanke. Prvi monomer se veže na desni konec, drugi pa na levi konec. Ta vezava sproži konformacijske spremembe na transpozazi, pri katerih se heliks αD premakne v aktivirano pozicijo, kar oblikuje aktivno mesto. V aktivno mesto se veže dvovalentni kovinski ion (Mn2+/Mg2+), ki lokalizira in polarizira tarčni fosfat, da lahko poteče nukleofilni napad tirozina (Y127) na tarčni fosfat. Tirozin se kovalentno veže na 5’ konec transpozona. Na levem koncu je to 5’ konec transpozona, na desnem koncu pa se TnpA veže na 5’ konec ssDNA, ki ni transpozon (donorska DNA). Po cepitvi transpozona od preostale ssDNA, nastane ciklični intermediat. TnpA uporabi vezano transpozonsko dna za integracijo transpozona v tarčno dna, torej ne potrebuje dodatne DNA vezavne domene. Donorsko DNA nadomesti tarčna DNA, ki jo prepozna preko kratkega nukleotidnega zaporedja na levem koncu transpozona. Mehanizem integracije poteka zelo podobno kot mehanizem izrezovanja. Tarčna DNA je usmerjena v aktivno mesto, pride do cepitve na tarčni dna, fosfotirozinski intermediati se sprostijo, spremeni se konformacija aktivnega mesta, kar privede do reorganizacije DNA, da nastane tarčna DNA z vključenim transpozonom.		Transpozicija se začne z vezavo TnpA transpozaze (ki je v obliki dimera) na lasnične zanke, ki jih oblikujeta desni in levi konec enoverižne DNA (palindromska zaporedja na koncih transpozona). Desni in levi konec se razlikujeta v le eni bazi lasnične zanke. Prvi monomer se veže na desni konec, drugi pa na levi konec. Ta vezava sproži konformacijske spremembe na transpozazi, pri katerih se heliks αD premakne v aktivirano pozicijo, kar oblikuje aktivno mesto. V aktivno mesto se veže dvovalentni kovinski ion (Mn2+/Mg2+), ki lokalizira in polarizira tarčni fosfat, da lahko poteče nukleofilni napad tirozina (Y127) na tarčni fosfat. Tirozin se kovalentno veže na 5’ konec transpozona. Na levem koncu je to 5’ konec transpozona, na desnem koncu pa se TnpA veže na 5’ konec ssDNA, ki ni transpozon (donorska DNA). Po cepitvi transpozona od preostale ssDNA, nastane ciklični intermediat. TnpA uporabi vezano transpozonsko dna za integracijo transpozona v tarčno dna, torej ne potrebuje dodatne DNA vezavne domene. Donorsko DNA nadomesti tarčna DNA, ki jo prepozna preko kratkega nukleotidnega zaporedja na levem koncu transpozona. Mehanizem integracije poteka zelo podobno kot mehanizem izrezovanja. Tarčna DNA je usmerjena v aktivno mesto, pride do cepitve na tarčni dna, fosfotirozinski intermediati se sprostijo, spremeni se konformacija aktivnega mesta, kar privede do reorganizacije DNA, da nastane tarčna DNA z vključenim transpozonom.

	'''SERINSKE IN TIROZINSKE TRANSPOZAZE		'''SERINSKE IN TIROZINSKE TRANSPOZAZE '''
	'''
			----


	Ime so dobile po aminokislinskem ostanku, ki se nahaja v aktivnem mestu transpozaze. Oba tipa transpozaz naj bi imela enako zvitje katalitične domene kot serinske in tirozinske rekombinaze in za oba tipa je značilno, da “transpozirajo” konjugativne elemente (“ICS-je”), pri čemer nastanejo ciklični intermediati. Nato se ena veriga lahko prenese v tarčno celico in z replikacijo nastane dvoverižni transpozon, ki se vstavi v genom.		Ime so dobile po aminokislinskem ostanku, ki se nahaja v aktivnem mestu transpozaze. Oba tipa transpozaz naj bi imela enako zvitje katalitične domene kot serinske in tirozinske rekombinaze in za oba tipa je značilno, da “transpozirajo” konjugativne elemente (“ICS-je”), pri čemer nastanejo ciklični intermediati. Nato se ena veriga lahko prenese v tarčno celico in z replikacijo nastane dvoverižni transpozon, ki se vstavi v genom.

	'''Serinske transpozaze'''		'''Serinske transpozaze'''

			----


	Obstajajo 4 družine serinskih transpozaz, ki se razlikujejo po organizaciji domen in njihovem delovanju. Razcep DNA verige poteka prek serinskega nukleofila v aktivnem mestu, zanj ni potrebna prisotnost kovinskih ionov ali drugih kofaktorjev, igrajo pa pomembno vlogo argininski ostanki ob aktivnem mestu ( v primeru transpozaze Sin je eden izmed njih Arg-69, ki deluje kot kislina in protonira 3´ kisik pri cepitvi, arg-66 pa stabilizira celoten prehodni kompleks. Ostali arginini sodelujejo pri vezavi H+ ionov in usedanju DNA v aktivno mesto).		Obstajajo 4 družine serinskih transpozaz, ki se razlikujejo po organizaciji domen in njihovem delovanju. Razcep DNA verige poteka prek serinskega nukleofila v aktivnem mestu, zanj ni potrebna prisotnost kovinskih ionov ali drugih kofaktorjev, igrajo pa pomembno vlogo argininski ostanki ob aktivnem mestu ( v primeru transpozaze Sin je eden izmed njih Arg-69, ki deluje kot kislina in protonira 3´ kisik pri cepitvi, arg-66 pa stabilizira celoten prehodni kompleks. Ostali arginini sodelujejo pri vezavi H+ ionov in usedanju DNA v aktivno mesto).
Line 67:		Line 77:

	'''Tirozinske transpozaze'''		'''Tirozinske transpozaze'''

			----


	Tirozinske transpozaze cepijo DNA s pomočjo tirozinskega ostanka, pri čemer tvorijo 3’-fosfotirozinsko vez. Na konca transpozona se vežejo štiri tirozinske transpozaze, ki tako tvorijo tetramerni kompleks. Po diagonali nasprotni transpozazi cepita vsaka po eno verigo, kar tvori reaktivna konca, ki napadeta nasprotni 3’-fosfotirozinski vezi – nastane t. i. “Holliday junction”. Postopek ponovita še preostali dve transpozazi, pri čemer pa reaktivna konca ponovno napadeta nasprotni 3’-fosfotirozinski vezi. Dobimo ciklični transpozon, ki pa se po nasprotno-enakem procesu vgradi v tarčno DNA.		Tirozinske transpozaze cepijo DNA s pomočjo tirozinskega ostanka, pri čemer tvorijo 3’-fosfotirozinsko vez. Na konca transpozona se vežejo štiri tirozinske transpozaze, ki tako tvorijo tetramerni kompleks. Po diagonali nasprotni transpozazi cepita vsaka po eno verigo, kar tvori reaktivna konca, ki napadeta nasprotni 3’-fosfotirozinski vezi – nastane t. i. “Holliday junction”. Postopek ponovita še preostali dve transpozazi, pri čemer pa reaktivna konca ponovno napadeta nasprotni 3’-fosfotirozinski vezi. Dobimo ciklični transpozon, ki pa se po nasprotno-enakem procesu vgradi v tarčno DNA.