MIBOM - biokompatibilni material iz školjk - Revision history

Manca2: /* Regulacijski sistem */

2022-03-28T11:47:28Z

Regulacijski sistem

← Older revision		Revision as of 11:47, 28 March 2022
Line 54:		Line 54:
	'''Signalna pot, ki jo sprožijo Ca<sup>2+</sup> ioni'''		'''Signalna pot, ki jo sprožijo Ca<sup>2+</sup> ioni'''

	Vezava Ca<sup>2+</sup> ionov na kalmodulin ga aktivira, aktiviran kalmodulin pa aktivira kalcineurin, ki defosforilira jedrni faktor aktiviranih T-celic (NFAT), kar izpostavi jedrni lokalizacijski signal, zato pride do vnosa NFAT v jedro, kjer se veže na odzivni element za NFAT. Da bi preverili delovanje te signalne poti, so v vektor pGL4.30 klonirali zapis za odzivni element za NFAT (NFAT-RE), ki mu sledi minimalni promotor (Pmin) in zeleni fluorescenčni protein (eGFP), ki so ga uporabili namesto alginat liaze, da so lahko s pomočjo kolokalizacije dveh fluorescenčnih proteinov potrdili, da mehanski pritisk sproži to signalno pot [2].		Vezava Ca<sup>2+</sup> ionov na kalmodulin ga aktivira, aktiviran kalmodulin pa aktivira kalcineurin, ki defosforilira jedrni faktor aktiviranih T-celic (NFAT), kar izpostavi jedrni lokalizacijski signal, zato pride do vnosa NFAT v jedro, kjer se veže na odzivni element za NFAT. Da bi preverili delovanje te signalne poti, so v vektor pGL4.30 klonirali zapis za odzivni element za NFAT (NFAT-RE), ki mu sledi minimalni promotor (Pmin) in zapis za zeleni fluorescenčni protein (eGFP), ki so ga uporabili namesto alginat liaze, da so lahko s pomočjo kolokalizacije dveh fluorescenčnih proteinov potrdili, da mehanski pritisk sproži to signalno pot [2].

	24 ur po kotransfekciji celic s pcDNA3.1-mPiezo1.1-mRuby2 in pGL4.30-eGFP so celice mehansko stimulirali z izsesavanjem gojišča in na stresalniku 10 min pri 200 rpm. Kolokalizacija zelene in rdeče fluorescence dokazuje, da mehanski stres preko Piezo1.1 kanalčkov sproži prej omenjeno signalno pot, ki jo inducirajo Ca<sup>2+</sup> ioni. Pri celicah v kontrolni skupini, ki jih niso mehansko stimulirali, namreč ni prišlo do izražanja eGFP, zato ni bilo zelene fluorescence [2].		24 ur po kotransfekciji celic s pcDNA3.1-mPiezo1.1-mRuby2 in pGL4.30-eGFP so celice mehansko stimulirali z izsesavanjem gojišča in na stresalniku 10 min pri 200 rpm. Kolokalizacija zelene in rdeče fluorescence dokazuje, da mehanski stres preko Piezo1.1 kanalčkov sproži prej omenjeno signalno pot, ki jo inducirajo Ca<sup>2+</sup> ioni. Pri celicah v kontrolni skupini, ki jih niso mehansko stimulirali, namreč ni prišlo do izražanja eGFP, zato ni bilo zelene fluorescence [2].

Manca2: /* Adhezijski sistem */

2022-03-28T10:07:29Z

Adhezijski sistem

← Older revision		Revision as of 10:07, 28 March 2022
Line 30:		Line 30:
	Ker lahko ponovitve zaporedja Mfp5 zagotovijo močnejšo adhezijo, so razvili biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3755003 BBa_K3755003] (Mfp5-2 CDS), ki jo sestavljata dve zaporedni kodirajoči zaporedji za Mfp5 iz klapavice ''Mytilus galloprovincialis''. V ekspresijski vektor pET28a so pod močen promotor T7 vstavili zapis za N-končno fuzijo Mfp5-2 s heksahistidinsko oznako in AKTK oznako (biokocka [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3755009 BBa_K3755009]), ki poveča hitrost iniciacije translacije in tako poveča učinkovitost translacije Mfp5-2 [2, 10, 11].		Ker lahko ponovitve zaporedja Mfp5 zagotovijo močnejšo adhezijo, so razvili biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3755003 BBa_K3755003] (Mfp5-2 CDS), ki jo sestavljata dve zaporedni kodirajoči zaporedji za Mfp5 iz klapavice ''Mytilus galloprovincialis''. V ekspresijski vektor pET28a so pod močen promotor T7 vstavili zapis za N-končno fuzijo Mfp5-2 s heksahistidinsko oznako in AKTK oznako (biokocka [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3755009 BBa_K3755009]), ki poveča hitrost iniciacije translacije in tako poveča učinkovitost translacije Mfp5-2 [2, 10, 11].

	Za šasijo so izbrali bakterije ''Escherichia coli'' BL21[DE3], ker je zapis za RNA-polimerazo bakteriofaga T7 integriran v genom. Izražanje Mfp5 so inducirali z 1 mM končno koncentracijo IPTG in celice 8-10 ur gojili na 37 °C pri 220 rpm. Protein so očistili z nikljevo afinitetno kromatografijo, ker pa se Mfp5-2 nahaja večinoma v inkluzijskih telescih, so med čiščenjem Mfp5 dodali denaturant gvanidinijev hidroklorid, s čimer so omogočili topnost proteina. Izkoristek je znašal 24 mg Mfp5/L bakterijske kulture. Tirozinske ostanke Mfp5 so posttranslacijsko modificirali v DOPA s pomočjo tirozinaze. Da bi okarakterizirali ~~adhezivne~~ lastnosti s tirozinazo modificiranega Mfp5-1 in Mfp5-2, so izvedli test viskoznosti in ugotovili, da ima Mfp5-2 za 16,11 % močnejšo adhezijo kot Mfp5-1 [2].		Za šasijo so izbrali bakterije ''Escherichia coli'' BL21[DE3], ker je zapis za RNA-polimerazo bakteriofaga T7 integriran v genom. Izražanje Mfp5 so inducirali z 1 mM končno koncentracijo IPTG in celice 8-10 ur gojili na 37 °C pri 220 rpm. Protein so očistili z nikljevo afinitetno kromatografijo, ker pa se Mfp5-2 nahaja večinoma v inkluzijskih telescih, so med čiščenjem Mfp5 dodali denaturant gvanidinijev hidroklorid, s čimer so omogočili topnost proteina. Izkoristek je znašal 24 mg Mfp5/L bakterijske kulture. Tirozinske ostanke Mfp5 so posttranslacijsko modificirali v DOPA s pomočjo tirozinaze. Da bi okarakterizirali adhezijske lastnosti s tirozinazo modificiranega Mfp5-1 in Mfp5-2, so izvedli test viskoznosti in ugotovili, da ima Mfp5-2 za 16,11 % močnejšo adhezijo kot Mfp5-1 [2].

	==Hidrogel==		==Hidrogel==

Manca2: /* Adhezijski sistem */

2022-03-28T10:05:19Z

Adhezijski sistem

← Older revision		Revision as of 10:05, 28 March 2022
Line 30:		Line 30:
	Ker lahko ponovitve zaporedja Mfp5 zagotovijo močnejšo adhezijo, so razvili biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3755003 BBa_K3755003] (Mfp5-2 CDS), ki jo sestavljata dve zaporedni kodirajoči zaporedji za Mfp5 iz klapavice ''Mytilus galloprovincialis''. V ekspresijski vektor pET28a so pod močen promotor T7 vstavili zapis za N-končno fuzijo Mfp5-2 s heksahistidinsko oznako in AKTK oznako (biokocka [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3755009 BBa_K3755009]), ki poveča hitrost iniciacije translacije in tako poveča učinkovitost translacije Mfp5-2 [2, 10, 11].		Ker lahko ponovitve zaporedja Mfp5 zagotovijo močnejšo adhezijo, so razvili biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3755003 BBa_K3755003] (Mfp5-2 CDS), ki jo sestavljata dve zaporedni kodirajoči zaporedji za Mfp5 iz klapavice ''Mytilus galloprovincialis''. V ekspresijski vektor pET28a so pod močen promotor T7 vstavili zapis za N-končno fuzijo Mfp5-2 s heksahistidinsko oznako in AKTK oznako (biokocka [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3755009 BBa_K3755009]), ki poveča hitrost iniciacije translacije in tako poveča učinkovitost translacije Mfp5-2 [2, 10, 11].

	Za šasijo so izbrali bakterije ''Escherichia coli'' BL21[DE3], ker je RNA-~~polimeraza~~ bakteriofaga T7 ~~integrirana~~ v genom. Izražanje Mfp5 so inducirali z 1 mM končno koncentracijo IPTG in celice 8-10 ur gojili na 37 °C pri 220 rpm. Protein so očistili z nikljevo afinitetno kromatografijo, ker pa se Mfp5-2 nahaja večinoma v inkluzijskih telescih, so med čiščenjem Mfp5 dodali denaturant gvanidinijev hidroklorid, s čimer so omogočili topnost proteina. Izkoristek je znašal 24 mg Mfp5/L bakterijske kulture. Tirozinske ostanke Mfp5 so posttranslacijsko modificirali v DOPA s pomočjo tirozinaze. Da bi okarakterizirali adhezivne lastnosti s tirozinazo modificiranega Mfp5-1 in Mfp5-2, so izvedli test viskoznosti in ugotovili, da ima Mfp5-2 za 16,11 % močnejšo adhezijo kot Mfp5-1 [2].		Za šasijo so izbrali bakterije ''Escherichia coli'' BL21[DE3], ker je zapis za RNA-polimerazo bakteriofaga T7 integriran v genom. Izražanje Mfp5 so inducirali z 1 mM končno koncentracijo IPTG in celice 8-10 ur gojili na 37 °C pri 220 rpm. Protein so očistili z nikljevo afinitetno kromatografijo, ker pa se Mfp5-2 nahaja večinoma v inkluzijskih telescih, so med čiščenjem Mfp5 dodali denaturant gvanidinijev hidroklorid, s čimer so omogočili topnost proteina. Izkoristek je znašal 24 mg Mfp5/L bakterijske kulture. Tirozinske ostanke Mfp5 so posttranslacijsko modificirali v DOPA s pomočjo tirozinaze. Da bi okarakterizirali adhezivne lastnosti s tirozinazo modificiranega Mfp5-1 in Mfp5-2, so izvedli test viskoznosti in ugotovili, da ima Mfp5-2 za 16,11 % močnejšo adhezijo kot Mfp5-1 [2].

	==Hidrogel==		==Hidrogel==

Manca2 at 09:16, 28 March 2022

2022-03-28T09:16:21Z

← Older revision		Revision as of 09:16, 28 March 2022
Line 16:		Line 16:


	Školjke vsebujejo bisus, posebno strukturo, s pomočjo katere se pritrjajo na podlago. Bisus je sestavljen iz snopa niti, na koncu katerih je ~~adhezivni~~ plak, ki vsebuje vodoodporne ~~adhezivne~~ proteine, ki školjkam omogočajo pritrjanje na različne podlage ter vzdržijo povečane mehanske obremenitve zaradi valov in tokov. Ker adhezivi, ki se jih trenutno uporablja v medicini, onemogočajo adhezijo v vodnem okolju, so ~~adhezivni~~ proteini školjk zanimivi za tovrstno uporabo [3, 4].		Školjke vsebujejo bisus, posebno strukturo, s pomočjo katere se pritrjajo na podlago. Bisus je sestavljen iz snopa niti, na koncu katerih je adhezijski plak, ki vsebuje vodoodporne adhezijske proteine, ki školjkam omogočajo pritrjanje na različne podlage ter vzdržijo povečane mehanske obremenitve zaradi valov in tokov. Ker adhezivi, ki se jih trenutno uporablja v medicini, onemogočajo adhezijo v vodnem okolju, so adhezijski proteini školjk zanimivi za tovrstno uporabo [3, 4].

	==Ideja: projekt MIBOM==		==Ideja: projekt MIBOM==

	Ekipa iz Šanghaja si je zamislila osteogeno biokompatibilno lepilo MIBOM na osnovi ~~adhezivnih~~ proteinov školjk, ki bi med sabo zlepilo fragmente zdrobljenih kosti in tako pomagalo pri regeneraciji kosti po kominutivnem zlomu. Sestavljajo ga štirje sistemi, odgovorni za adhezijo, strukturno jakost, regulirano razgradnjo materiala med procesom rasti kosti in sprostitev zdravil. MIBOM torej služi kot pomoč pri fiksaciji fragmentov zdrobljenih kosti, njihov cilj pa je nadomestiti kovinske vsadke [2].		Ekipa iz Šanghaja si je zamislila osteogeno biokompatibilno lepilo MIBOM na osnovi adhezijskih proteinov školjk, ki bi med sabo zlepilo fragmente zdrobljenih kosti in tako pomagalo pri regeneraciji kosti po kominutivnem zlomu. Sestavljajo ga štirje sistemi, odgovorni za adhezijo, strukturno jakost, regulirano razgradnjo materiala med procesom rasti kosti in sprostitev zdravil. MIBOM torej služi kot pomoč pri fiksaciji fragmentov zdrobljenih kosti, njihov cilj pa je nadomestiti kovinske vsadke [2].

	==Adhezijski sistem==		==Adhezijski sistem==

Manca2: /* Problem: kominutivni zlom */

2022-03-27T19:51:36Z

Problem: kominutivni zlom

← Older revision		Revision as of 19:51, 27 March 2022
Line 11:		Line 11:
	Kominutivni zlom je zlom kosti na več kot dva fragmenta in predstavlja najbolj resno poškodbo kosti. Do tovrstnih zlomov prihaja po poškodbah zaradi hudega trčenja, kot so prometne nesreče, nesreče pri športu in padci [1, 2].		Kominutivni zlom je zlom kosti na več kot dva fragmenta in predstavlja najbolj resno poškodbo kosti. Do tovrstnih zlomov prihaja po poškodbah zaradi hudega trčenja, kot so prometne nesreče, nesreče pri športu in padci [1, 2].

	Kar 95 % vseh zlomov stegnenice predstavljajo kominutivni zlomi. V primerjavi z enostavnimi zlomi trajajo operacije za kominutivne zlome v povprečju dvakrat dlje, ker je treba fragmente zdrobljenih kosti fiksirati s ~~pomočjo kovinskega vsadka~~. Določenih majhnih fragmentov pa ni možno ustrezno fiksirati, zato je treba izvesti osteotomijo (umetna prekinitev kosti). Problem predstavlja tudi visoka cena operacije, dolg čas okrevanja in dodatna operacija za odstranitev kovinskega vsadka [2].		Kar 95 % vseh zlomov stegnenice predstavljajo kominutivni zlomi. V primerjavi z enostavnimi zlomi trajajo operacije za kominutivne zlome v povprečju dvakrat dlje, ker je treba fragmente zdrobljenih kosti fiksirati s kovinskimi vsadki. Določenih majhnih fragmentov pa ni možno ustrezno fiksirati, zato je treba izvesti osteotomijo (umetna prekinitev kosti). Problem predstavlja tudi visoka cena operacije, dolg čas okrevanja in dodatna operacija za odstranitev kovinskega vsadka [2].

	==Školjke kot vir vodoodpornih bioadhezivov==		==Školjke kot vir vodoodpornih bioadhezivov==

Manca2: /* Regulacijski sistem */

2022-03-27T19:33:16Z

Regulacijski sistem

← Older revision		Revision as of 19:33, 27 March 2022
Line 56:		Line 56:
	Vezava Ca<sup>2+</sup> ionov na kalmodulin ga aktivira, aktiviran kalmodulin pa aktivira kalcineurin, ki defosforilira jedrni faktor aktiviranih T-celic (NFAT), kar izpostavi jedrni lokalizacijski signal, zato pride do vnosa NFAT v jedro, kjer se veže na odzivni element za NFAT. Da bi preverili delovanje te signalne poti, so v vektor pGL4.30 klonirali zapis za odzivni element za NFAT (NFAT-RE), ki mu sledi minimalni promotor (Pmin) in zeleni fluorescenčni protein (eGFP), ki so ga uporabili namesto alginat liaze, da so lahko s pomočjo kolokalizacije dveh fluorescenčnih proteinov potrdili, da mehanski pritisk sproži to signalno pot [2].		Vezava Ca<sup>2+</sup> ionov na kalmodulin ga aktivira, aktiviran kalmodulin pa aktivira kalcineurin, ki defosforilira jedrni faktor aktiviranih T-celic (NFAT), kar izpostavi jedrni lokalizacijski signal, zato pride do vnosa NFAT v jedro, kjer se veže na odzivni element za NFAT. Da bi preverili delovanje te signalne poti, so v vektor pGL4.30 klonirali zapis za odzivni element za NFAT (NFAT-RE), ki mu sledi minimalni promotor (Pmin) in zeleni fluorescenčni protein (eGFP), ki so ga uporabili namesto alginat liaze, da so lahko s pomočjo kolokalizacije dveh fluorescenčnih proteinov potrdili, da mehanski pritisk sproži to signalno pot [2].

	24 ur po kotransfekciji celic s pcDNA3.1-mPiezo1.1-mRuby2 in pGL4.30-eGFP so celice mehansko stimulirali z izsesavanjem gojišča ~~oz.~~ na stresalniku 10 min pri 200 rpm. Kolokalizacija zelene in rdeče fluorescence dokazuje, da mehanski stres preko Piezo1.1 kanalčkov sproži prej omenjeno signalno pot, ki jo inducirajo Ca<sup>2+</sup> ioni. Pri celicah v kontrolni skupini, ki jih niso mehansko stimulirali, namreč ni prišlo do izražanja eGFP, zato ni bilo zelene fluorescence [2].		24 ur po kotransfekciji celic s pcDNA3.1-mPiezo1.1-mRuby2 in pGL4.30-eGFP so celice mehansko stimulirali z izsesavanjem gojišča in na stresalniku 10 min pri 200 rpm. Kolokalizacija zelene in rdeče fluorescence dokazuje, da mehanski stres preko Piezo1.1 kanalčkov sproži prej omenjeno signalno pot, ki jo inducirajo Ca<sup>2+</sup> ioni. Pri celicah v kontrolni skupini, ki jih niso mehansko stimulirali, namreč ni prišlo do izražanja eGFP, zato ni bilo zelene fluorescence [2].

	Razvili so tudi biokocko za alginat liazo ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3755013 BBa_K3755013]) s človeškim signalnim zaporedjem IL-2 za izločanje alginat liaze iz sesalskih celic [2].		Razvili so tudi biokocko za alginat liazo ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3755013 BBa_K3755013]) s človeškim signalnim zaporedjem IL-2 za izločanje alginat liaze iz sesalskih celic [2].

Manca2: /* Problem: kominutivni zlom */

2022-03-27T19:25:32Z

Problem: kominutivni zlom

← Older revision		Revision as of 19:25, 27 March 2022
Line 11:		Line 11:
	Kominutivni zlom je zlom kosti na več kot dva fragmenta in predstavlja najbolj resno poškodbo kosti. Do tovrstnih zlomov prihaja po poškodbah zaradi hudega trčenja, kot so prometne nesreče, nesreče pri športu in padci [1, 2].		Kominutivni zlom je zlom kosti na več kot dva fragmenta in predstavlja najbolj resno poškodbo kosti. Do tovrstnih zlomov prihaja po poškodbah zaradi hudega trčenja, kot so prometne nesreče, nesreče pri športu in padci [1, 2].

	95 % vseh zlomov stegnenice predstavljajo kominutivni zlomi. V primerjavi z enostavnimi zlomi trajajo operacije za kominutivne zlome v povprečju dvakrat dlje, ker je treba fragmente zdrobljenih kosti fiksirati s pomočjo kovinskega vsadka. Določenih majhnih fragmentov pa ni možno ustrezno fiksirati, zato je treba izvesti osteotomijo (umetna prekinitev kosti). Problem predstavlja tudi visoka cena operacije, dolg čas okrevanja in dodatna operacija za odstranitev kovinskega vsadka [2].		Kar 95 % vseh zlomov stegnenice predstavljajo kominutivni zlomi. V primerjavi z enostavnimi zlomi trajajo operacije za kominutivne zlome v povprečju dvakrat dlje, ker je treba fragmente zdrobljenih kosti fiksirati s pomočjo kovinskega vsadka. Določenih majhnih fragmentov pa ni možno ustrezno fiksirati, zato je treba izvesti osteotomijo (umetna prekinitev kosti). Problem predstavlja tudi visoka cena operacije, dolg čas okrevanja in dodatna operacija za odstranitev kovinskega vsadka [2].

	==Školjke kot vir vodoodpornih bioadhezivov==		==Školjke kot vir vodoodpornih bioadhezivov==

Manca2: /* Adhezijski sistem */

2022-03-27T19:19:05Z

Adhezijski sistem

← Older revision		Revision as of 19:19, 27 March 2022
Line 30:		Line 30:
	Ker lahko ponovitve zaporedja Mfp5 zagotovijo močnejšo adhezijo, so razvili biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3755003 BBa_K3755003] (Mfp5-2 CDS), ki jo sestavljata dve zaporedni kodirajoči zaporedji za Mfp5 iz klapavice ''Mytilus galloprovincialis''. V ekspresijski vektor pET28a so pod močen promotor T7 vstavili zapis za N-končno fuzijo Mfp5-2 s heksahistidinsko oznako in AKTK oznako (biokocka [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3755009 BBa_K3755009]), ki poveča hitrost iniciacije translacije in tako poveča učinkovitost translacije Mfp5-2 [2, 10, 11].		Ker lahko ponovitve zaporedja Mfp5 zagotovijo močnejšo adhezijo, so razvili biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3755003 BBa_K3755003] (Mfp5-2 CDS), ki jo sestavljata dve zaporedni kodirajoči zaporedji za Mfp5 iz klapavice ''Mytilus galloprovincialis''. V ekspresijski vektor pET28a so pod močen promotor T7 vstavili zapis za N-končno fuzijo Mfp5-2 s heksahistidinsko oznako in AKTK oznako (biokocka [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3755009 BBa_K3755009]), ki poveča hitrost iniciacije translacije in tako poveča učinkovitost translacije Mfp5-2 [2, 10, 11].

	Za šasijo so izbrali bakterije ''Escherichia coli'' BL21[DE3], ker je RNA-polimeraza bakteriofaga T7 integrirana v genom. Izražanje Mfp5 so inducirali z 1 mM končno koncentracijo IPTG in celice 8-10 ur gojili na 37 °C pri 220 rpm. Protein so očistili z nikljevo afinitetno kromatografijo, ker pa se Mfp5-2 nahaja večinoma v inkluzijskih telescih, so med čiščenjem Mfp5 dodali denaturant gvanidinijev hidroklorid, s čimer so omogočili topnost proteina. Izkoristek je znašal 24 mg Mfp5/L bakterijske kulture. ~~Nato pa so tirozinske~~ ostanke Mfp5 modificirali v DOPA s pomočjo tirozinaze. Da bi okarakterizirali adhezivne lastnosti s tirozinazo modificiranega Mfp5-1 in Mfp5-2, so izvedli test viskoznosti in ugotovili, da ima Mfp5-2 za 16,11 % močnejšo adhezijo kot Mfp5-1 [2].		Za šasijo so izbrali bakterije ''Escherichia coli'' BL21[DE3], ker je RNA-polimeraza bakteriofaga T7 integrirana v genom. Izražanje Mfp5 so inducirali z 1 mM končno koncentracijo IPTG in celice 8-10 ur gojili na 37 °C pri 220 rpm. Protein so očistili z nikljevo afinitetno kromatografijo, ker pa se Mfp5-2 nahaja večinoma v inkluzijskih telescih, so med čiščenjem Mfp5 dodali denaturant gvanidinijev hidroklorid, s čimer so omogočili topnost proteina. Izkoristek je znašal 24 mg Mfp5/L bakterijske kulture. Tirozinske ostanke Mfp5 so posttranslacijsko modificirali v DOPA s pomočjo tirozinaze. Da bi okarakterizirali adhezivne lastnosti s tirozinazo modificiranega Mfp5-1 in Mfp5-2, so izvedli test viskoznosti in ugotovili, da ima Mfp5-2 za 16,11 % močnejšo adhezijo kot Mfp5-1 [2].

	==Hidrogel==		==Hidrogel==

Manca2: /* Adhezijski sistem */

2022-03-27T18:45:02Z

Adhezijski sistem

← Older revision		Revision as of 18:45, 27 March 2022
Line 30:		Line 30:
	Ker lahko ponovitve zaporedja Mfp5 zagotovijo močnejšo adhezijo, so razvili biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3755003 BBa_K3755003] (Mfp5-2 CDS), ki jo sestavljata dve zaporedni kodirajoči zaporedji za Mfp5 iz klapavice ''Mytilus galloprovincialis''. V ekspresijski vektor pET28a so pod močen promotor T7 vstavili zapis za N-končno fuzijo Mfp5-2 s heksahistidinsko oznako in AKTK oznako (biokocka [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3755009 BBa_K3755009]), ki poveča hitrost iniciacije translacije in tako poveča učinkovitost translacije Mfp5-2 [2, 10, 11].		Ker lahko ponovitve zaporedja Mfp5 zagotovijo močnejšo adhezijo, so razvili biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3755003 BBa_K3755003] (Mfp5-2 CDS), ki jo sestavljata dve zaporedni kodirajoči zaporedji za Mfp5 iz klapavice ''Mytilus galloprovincialis''. V ekspresijski vektor pET28a so pod močen promotor T7 vstavili zapis za N-končno fuzijo Mfp5-2 s heksahistidinsko oznako in AKTK oznako (biokocka [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3755009 BBa_K3755009]), ki poveča hitrost iniciacije translacije in tako poveča učinkovitost translacije Mfp5-2 [2, 10, 11].

	Za šasijo so izbrali bakterije ''Escherichia coli'' BL21[DE3], ker je RNA-polimeraza bakteriofaga T7 integrirana v genom. Izražanje Mfp5 so inducirali z 1 mM končno koncentracijo IPTG in celice 8-10 ur gojili na 37 °C pri 220 rpm. Protein so očistili ~~s pomočjo nikljeve afinitetne kromatografije~~, ker pa se Mfp5-2 nahaja večinoma v inkluzijskih telescih, so med čiščenjem Mfp5 dodali denaturant gvanidinijev hidroklorid, s čimer so omogočili topnost proteina. Izkoristek je znašal 24 mg Mfp5/L bakterijske kulture. Nato pa so tirozinske ostanke Mfp5 modificirali v DOPA s pomočjo tirozinaze. Da bi okarakterizirali adhezivne lastnosti s tirozinazo modificiranega Mfp5-1 in Mfp5-2, so izvedli test viskoznosti in ugotovili, da ima Mfp5-2 za 16,11 % močnejšo adhezijo kot Mfp5-1 [2].		Za šasijo so izbrali bakterije ''Escherichia coli'' BL21[DE3], ker je RNA-polimeraza bakteriofaga T7 integrirana v genom. Izražanje Mfp5 so inducirali z 1 mM končno koncentracijo IPTG in celice 8-10 ur gojili na 37 °C pri 220 rpm. Protein so očistili z nikljevo afinitetno kromatografijo, ker pa se Mfp5-2 nahaja večinoma v inkluzijskih telescih, so med čiščenjem Mfp5 dodali denaturant gvanidinijev hidroklorid, s čimer so omogočili topnost proteina. Izkoristek je znašal 24 mg Mfp5/L bakterijske kulture. Nato pa so tirozinske ostanke Mfp5 modificirali v DOPA s pomočjo tirozinaze. Da bi okarakterizirali adhezivne lastnosti s tirozinazo modificiranega Mfp5-1 in Mfp5-2, so izvedli test viskoznosti in ugotovili, da ima Mfp5-2 za 16,11 % močnejšo adhezijo kot Mfp5-1 [2].

	==Hidrogel==		==Hidrogel==

Manca2: /* Hidrogel */

2022-03-27T18:42:37Z

Hidrogel

← Older revision		Revision as of 18:42, 27 March 2022
Line 40:		Line 40:
	Ker se GelMA v organizmu hitro razgradi in nima dovolj visoke strukturne jakosti so dodali še alginat, ki se prečno poveže ob vezavi Ca<sup>2+</sup> ionov. Hidrogel se torej najprej delno strdi z obsevanjem z UV-svetlobo, kar zdravnikom omogoča, da postavijo fragmente kosti v ustrezen položaj, ob vezavi Ca<sup>2+</sup> ionov pa se hidrogel popolnoma strdi. Dolgoročno viabilnost celic HUVEC v hidrogelu so testirali tako, da so jih enkapsulirali v hidrogel, jih gojili 21 dni in jih vsake tri dni barvali s fluorescein diacetatom (obarva žive celice) in propidijevim jodidom (obarva mrtve celice). Delež preživelih celic je znašal okoli 60 % [2].		Ker se GelMA v organizmu hitro razgradi in nima dovolj visoke strukturne jakosti so dodali še alginat, ki se prečno poveže ob vezavi Ca<sup>2+</sup> ionov. Hidrogel se torej najprej delno strdi z obsevanjem z UV-svetlobo, kar zdravnikom omogoča, da postavijo fragmente kosti v ustrezen položaj, ob vezavi Ca<sup>2+</sup> ionov pa se hidrogel popolnoma strdi. Dolgoročno viabilnost celic HUVEC v hidrogelu so testirali tako, da so jih enkapsulirali v hidrogel, jih gojili 21 dni in jih vsake tri dni barvali s fluorescein diacetatom (obarva žive celice) in propidijevim jodidom (obarva mrtve celice). Delež preživelih celic je znašal okoli 60 % [2].

	Testirali so tudi adhezijo Mfp5 v kombinaciji z GelMA, ki se je povečala za 36,2 % v primerjavi z GelMA in za 260,8 % v primerjavi z Mfp5. Preverili so tudi reološke lastnosti hidrogela~~, s čimer so~~ dokazali, da je njihov material primeren za regeneracijo kosti [2].		Testirali so tudi adhezijo Mfp5 v kombinaciji z GelMA, ki se je povečala za 36,2 % v primerjavi z GelMA in za 260,8 % v primerjavi z Mfp5. Preverili so tudi reološke lastnosti hidrogela in tako dokazali, da je njihov material primeren za regeneracijo kosti [2].

	== Regulacijski sistem ==		== Regulacijski sistem ==