Main Page - Revision history

WikiSysop: Reverted edits by Ena Kartal (talk) to last revision by WikiSysop

2024-05-15T15:01:50Z

Reverted edits by Ena Kartal (talk) to last revision by WikiSysop

← Older revision		Revision as of 15:01, 15 May 2024
Line 1:		Line 1:
	~~Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2329050124000184?via%3Dihub#bib15# All-~~in~~-one IQ toggle switches with high versatilities for fine-tuning of transgene expression in mammalian cells and tissues]~~		== Wiki Fakultete za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerze v Ljubljani ==

			Dobrodošli na glavni strani wikija [http://www.fkkt.uni-lj.si/ FKKT UL]!

	~~== Uvod ==~~		Namen tega [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wiki wikija] je, da učiteljem in študentom omogoči interaktivno sodelovanje pri vsebinah, ki sodijo v sklop kemije, biokemije, kemijskega inženirstva in tehnologije. Wiki lahko uporabljate za opise študijskih predmetov in vsebin, za leksikone posameznih področij, za opise tehnik in tehnologij, za laboratorijske priročnike in dnevnike in še marsikaj drugega.
	~~Doslej razvita transgena stikala izkoriščajo zunanje dražljaje~~, ~~ki jih lahko spreminjamo, kot so hormoni, kemikalije, težke kovine, toplota, svetloba ipd. Med genskimi stikali~~, ki ~~so odvisni od majhnih molekul~~, ~~je sistem Tet-On/Off (izkorišča tetraciklin ali njegove derivate~~, ~~kot sta doksiciklin~~ in ~~minociklin) veljalo za najmočnejšo metodo za induciranje izražanja transgenov~~. ~~Pogosto opažena nesprejemljiva stopnja pušččanja tega sistema poskušali so odpraviti z uporabo enovektorskega pristopa optimiziranega~~ za ~~proizvodnjo lentivirusa. Sistem 'vse v enem' Tet-Off je zmanjšal bazalno puščanje~~, ~~vendar na račun moči indukcije transgena. Zaradi tega so razvili represibilni binarni transgenski indukcijski sistem~~, ~~stikalo Q (ali SIQ)~~, ~~pridobljeno iz glive Neurospora crassa. SIQ ni pokazalo nobenega puščanja pri izražanju transgena v celicah sesalcev, hkrati pa je ohranjalo visoko občutljivost na kemični induktor [1,2]~~.

	Za ~~izdelavo novega SIQ so uporabljali vektor pENTR-EUI~~. ~~Pred tem so dokazali, da~~ je ~~bilo singularno gensko stikalo (EUI) na osnovi Gal4/UAS uspešno implementirano za transgensko indukcijo v človeških celičnih linijah~~, ~~vendar je transgenska inducibilnost sistema Gal4/UAS na splošno šibkejša ter je zelo občutljiv na metilacijo, kar lahko provzroči utišanje transgena po zaporednih generacijah~~. Na osnovi tega so za izdelavo novega sistema uporabili podoben vektor z uvedbo določenih sprememb, kot je recimo takoimenovani pogonski modul, ki je ključen za izražanje komponent potrebnih za vezavo na elemente ojačevalca 13 x QUAS, ki nato inducirajo transkripcijo transgena le, če ga stimulirajo kemični dražljaji. ~~Končni vektor pSIQ je bil zasnovan tako, da izgubi tako pUC ori kot dva izbirna markerja po rekombinaciji z vektorjem pAd/PL~~-~~DEST za pripravo adenovirusa [1~~].		Za vpisovanje novih podatkov in ustvarjanje novih strani se morate najprej [[Registracija\|registrirati]]. Registracija je ročna, vpisane registracijske podatke pa [mailto:wiki.sysop@fkkt.uni-lj.si administrator] preverja.

	~~== SIQ omogoča enostavno ustvarjanje stabilnih celičnih linij ==~~		Wiki FKKT UL poganja [http://en.wikipedia.org/wiki/MediaWiki Mediawiki], ki je verjetno najbolj znano programje v svetu wikijev in ki ga uporablja tudi [http://sl.wikipedia.org/wiki/Glavna_stran Wikipedija]. O njegovi uporabi boste zlahka našli vse tiste informacije, ki so potrebne za osnovno delo z wikijem; nekaj jih je zbranih na strani [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Help:Contents Pomoč].
	~~Vektor pSIQ vsebuje prepoznavno meto serin integraze (phiC31) attB, ki omogoča generiranje stabilnih celičnih linij z rekombinacijo na osnovi integraze~~. ~~V preskusni vektor so kot transgen vstavili zapis za EGFP~~, ki je ~~odvisen od odmerka tebufenozida (Teb)~~. ~~S kontransfekcijo vektora pSIQ~~, ki ~~kodira transgen EGFP, z ekspresijskim vektorjem integraze v HEK293-attP-Bla celicah~~ so ~~potrdili njihovo pravilno implantacijo na mesto attP gostiteljskega genoma. Potem so dokazali, da je raven izražanja EGFP naraščala~~ z ~~neprekinjenim dodajanjem Teb in~~ je ~~dosegla plato po 48 urah~~. ~~Poleg tega vzpostavljena celična linija se je odzvala izključno na eksogene kemične dražljaje, kar so dokazali z opaženo postopno zmanjševanje ravni EGFP po odstranitvi Teb~~. ~~Natančnost SIQ so dokazali tudi z generiranjem druge stabilne celične linije s istim transgenom in vsemi komponentami SIQ razen pogonskega modula (CMV-QFDBD~~-~~2x AD-VP16-EcR-poly(A))~~. ~~Čeprav je prišlo do integracije na identičen attP lokus HEK293-attP-Bla celičnih linij, te brez pogonskega modula niso pokazale nobenega odziva na dražljaje z uporabo Teb~~. ~~Pomembno je omeniti tudi to, da je SIQ-EGFP brez dodajanja Teb prikazala le zanemarljivo raven izražanja EGFP [1,3,4~~].

	~~== Preklopno stikalo SIQ lahko preuredimo v sistem za dostavo genov posredovani z adenovirusi ==~~		Želimo vam veliko veselja z uporabo novega wikija!
	Sistemi za dostavo genov, posredovani z adenovirusi, so bili v veliki meri uporabljeni za klinične aplikacije. Glavna pomanjkljivost virusnega vektorja je to, da kaže sposobnost okužbe širokega sprektra celičnih linij. Poleg tega narava adenovirusa je taka, da ne pride do integracije v genom gostiteljskega organizma, kar sčasoma privede do zmanjševanja ravni virusnega genoma v celicah. Da bi olajšali učinkovito dostavo pSIQ v celice, ki kažejo zelo nizko učinkovitost transfekcije, so uporabili adenovirusni pakirni sistem. Vektor pSIQ z EGFP so in vitro integrirali z vektorjem pAd/PL-DEST. Poleg tega pripravili so tudi adenovirusni vektor pENTR-EUI, ki se odziva na Teb. pENTR-EUI, ki nosi zapis za EGFP, je bil uporabljen za proizvodnjo adenovirusa (Ad/EUI-EGFP) po združitvi s vektorjem pAd/PL-DEST. Izražanje EGFP v pENTR-EUI je bilo kontrolirano z sistemom Gal4/UAS, kar je služilo kot kontrola za primerjavo sistema SIQ. Po različnih eksperimentih so dokazali, da je bil potreben vsaj 10x višji MOI (razmerje med številom transducirajočih vektorjev in številom celic) Ad/EUI-EGFP, da bi dosegli enakovreden odziv celic, okuženih z Ad/SQI-EGFP [5].

	Poročali so, da je intravensko injiciran adenovirus zelo nalezljiv za jetra, kamor virus najprej pride preko jetrne vene in se infiltrira v jetrne celice [6]. Da bi preverili ali je Ad/SIQ-EGFP, ki so ga uporabljali za okužbo keratinocitov HaCaT, uporaben tudi v raziskavah in vivo, so v repno veno miši injicirali 100 µL adenovirusa s povečano koncentracijo virusnih delcev. Po 24 urah okužbe z Ad/SIQ-EGFP so enkrat dnevno v 24-urnih intervalih z intraperitonealno injekcijo vbrizgali 100 µL PBS ali enako količino Teb (1mmol/L) raztopljenega v PBS. En dan po injiciranju kemičnega dražljaja so eviscerirali jetra, da bi preverili izražanje EGFP. Kot je bilo pričakovano samo pri jetrih, ki so bila okužena z virusom so pokazale pozitiven odziv na Teb za razliko od jeter, ki niso bila okužena. Še pomembnejše je bilo opažanje, da okužba z virusom v odsotnosti zdravljenja s Teb ni provzročila nobene zaznavne ekspresije EGFP. Pomembno je omeniti tudi to, da pri miših z virusno okužbo z uporabo Ad/SIQ-EGFP niso odkrili nobenih opaznih okvar jeter, niti po dolgotrajnem rednem dajanju Teb 3 tedne. Treba je omeniti, da preklopno stikalo SIQ presega sistem EUI, ki temelji na Gal4/UAS, in je primerljiv s konstitutivnim ekspresijskim sistemom, ki izhaja iz CMV in vivo [7].


	== ~~Sofisticirano transgensko preklapljanje lahko dosežemo s kombinacijo SIQ in genskega stikala cumate~~ ==		== Povezave do kazal po področjih: ==
	Čeprav je SIQ pokazal svojo visoko vsestranskost v celičnih linijah, pridobljenih iz človeka, obstaja proctor za izboljšave z vključitvijo drugih genskih regulacijskih elementov, ki jih je mogoče nadzorovati z drugimi kemičnimi ligandi. To vključuje recimo razvoj ortogonalnega genskega stikala, kjer lahko dva ali več različnih induktorjev uravnava izražanje transgena, ne da bi se med seboj motili. Na splošno kemičnih genskih stikal ni mogoče na hitro izklopiti zaradi dolgotrajnih učinkov kemičnih induktorjev na transgen. Da bi dosegli pospešeno supresijo ekspresije tarčnega gena, so v preklopno stikalo SIQ uvedli od kumata odvisen transgenski represor [8].

	~~Gensko stikalo na osnovi kumata je sestavljeno iz dveh glavnih komponent: represorskega modula CymR~~ in ~~zaporedja CuO, na katero se veže CymR~~ in inhibira ekspresijo transgena. Kumat (4-izopropilbenzojska kislina) se neposredno veže na CymR in ga loči od CuO, kar provzroči derepresijo transgenske ekspresije. Golnilno zaporedje pSIQ so povezali s CymR preko zaporedja peptida 2A P2A ter so CuO, dolžine 28 baznih parvov, dodali neposredno pred mestom začetka transkripcije transgena pSIQ. Takšna ureditev omogoča hkratno izražanje gonilnega zaporedja SIQ in represorja CymR. Ta konstrukt imenovali so pSIQmate, ki je bil sestavljen iz 9001 nukleotida.		* [[Kazalo KEM\|Kemija]]
			* [[Kazalo BMB\|Biokemija in molekularna biologija]]
			* [[Kazalo KIT\|Kemijsko inženirstvo in tehnologija]]
			* [[Kazalo TEV\|Tehniška varnost]]

	Da bi preizkusili odzivnost SIQmate na oba induktorja, so začasno transficirali celice HEK293 z pSIQmate-EGFP in jih nato obdelali s Teb ali kumatom posamično, pa tudi v kombinaciji. Rezultati obdelave celic so pokazali, da je prišlo do florescence EGFP samo v primerih uporabe obeh kemikalij sočasno. Poleg tega pokazalo se je, da so kloni, ki so bili obdelani samo s Teb, pokazali obrobno povišanje fluorescenčnih signalov. Ti signali niso bili dovolj močni, da bi jih lahko zaznali s fluorescenčno mikroskopijo in so zaradi tega naredili ponovno kvantifikacijo ampak z merjenjem aktivnosti luciferaze. Ta pojav je verjetno posledica občasnega odvajanja CymR od CuO ne glede na kumat, kar je pogost pojav med regulatorji transkripcije [9].		== Uporabno ==
			* [[Leksikon KEM\|(Bio)kemijski leksikon]]
	Po ponovni kvantifikaciji z merjenjem aktivnosti luciferaze, je SIQmate pokazal znatno nižjo občutljivost na kemične dražljaje v primerjavi s SIQ (približno 0,2-kratna razlika). Iz the razlogov obstaja možnost potrebe nadaljnje optimizacije za povečanje robustnosti transgenske aktivacije v sistemu SIQmate.		* [[Tabela odpornosti materialov]] (proti kemikalijam, avtoklaviranje, mikrovalovi)
			* [http://delloyd.50megs.com/moreinfo/buffers2.html Priprava pufrskih raztopin] (tabele, recepti)
	== ~~Zaključek~~ ==
	Obstaja več meril, ki jih je treba upoštevati, preden se oblikuje novo, kemično zasnovano transgensko preklopno stikalo. Vsak sistem za regulacijo transgenov ne sme biti toksičen za celice in organizme, mora biti izjemno občutljiv in natančno moduliran s pravilnim odmerkom spojin, ki delujejo kot kemični dražljaji [~~10].~~

	Usodna napaka binarne lasnosti transgenskih preklopnih stikal je, da je težko pričakovati, da bo dosegla enakomerno dostavo dveh ločenih vektorjev v ciljne celice in tkiva hkrati. Posledica tega je nastajajoča populacija celic z neenakomerno porazdeljenimi plazmidi. Čeprav se lahko raziskovalci izognejo proizvodnji neželene heterogene populacije celic z vzpostavitvijo stabilne celične linije, je to naporen in dolgotrajen proces [10]. Zato bi bila izdelava zanesljivega in vsestranskega singularnega transgenskega stikala zaželena na področju predkliničnih in bioloških raziskav. Dokazali so, da je preklopno stikalo SIQ boljše od EUI Sistema na osnovi Gal4/UAS v smislu večje občutljivosti na kemične dražljaje, nižje bazalne ekspresije in večje vsestranskosti. Takšen sistem najde široko uporabo, vključno s poskusi prehodne transfekcije, vzpostavitvijo stabilnih celičnih linij in proizvodnjo adenovirusa, pri čemer je za vse potreben le en krog subkloniranja transgenov v pSIQ.


	~~== Literatura ==~~
	[1] J. Hong et al., “All-in-one IQ toggle switches with high versatilities for fine-tuning of transgene expression in mammalian cells and tissues,” Mol Ther Methods Clin Dev, vol. 32, no. 1, p. 101202, Mar. 2024, doi: 10.1016/j.omtm.2024.101202.
	[2] E. Vigna et al., “Robust and Efficient Regulation of Transgene Expression in Vivo by Improved Tetracycline-Dependent Lentiviral Vectors,” Molecular Therapy, vol. 5, no. 3, pp. 252–261, Mar. 2002, doi: 10.1006/mthe.2002.0542.
	[3] C.-A. Lo, A. W. Greben, and B. E. Chen, “Generating stable cell lines with quantifiable protein production using CRISPR/Cas9-mediated knock-in,” Biotechniques, vol. 62, no. 4, pp. 165–174, Apr. 2017, doi: 10.2144/000114534.
	[4] ~~C. A. Merrick~~, ~~J. Zhao~~, ~~and S. J. Rosser, “Serine Integrases: Advancing Synthetic Biology,” ACS Synth Biol, vol. 7, no. 2, pp. 299–310, Feb. 2018, doi: 10.1021/acssynbio.7b00308.~~
	[5] J. T. Bulcha, Y. Wang, H. Ma, P. W. L. Tai, and G. Gao, “Viral vector platforms within the gene therapy landscape,” Signal Transduct Target Ther, vol. 6, no. 1, p. 53, Feb. 2021, doi: 10.1038/s41392-021-00487-6.
	[~~6] S. J. Duncan et al., “Infection of Mouse Liver by Human Adenovirus Type 5,” Journal of General Virology, vol. 40, no. 1, pp. 45–61, Jul. 1978, doi~~: ~~10.1099~~/~~0022-1317-40-1-45.~~
	[7] S. Lee et al., “Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switches for Regulated Transgene Expression in Cells and Adult Rodent Tissues,” Mol Ther Nucleic Acids, vol. 5, p. e367, 2016, doi: 10.1038/~~mtna.2016.74.~~
	~~[8] A. Mullick et al., “The cumate gene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells,” BMC Biotechnol, vol~~. ~~6, no~~. ~~1, p. 43, 2006, doi: 10.1186~~/~~1472-6750-6-43.~~
	~~[9] A. Raj and A. van Oudenaarden, “Nature, Nurture, or Chance: Stochastic Gene Expression and Its Consequences,” Cell, vol. 135, no. 2, pp. 216–226, Oct. 2008, doi: 10.1016~~/~~j.cell.2008~~.~~09.050.~~
	~~[10~~] ~~Y. Suzuki and Y. Suzuki~~, ~~“Gene Regulatable Lentiviral Vector System,” in Viral Gene Therapy, InTech, 2011. doi: 10.5772/18155.~~

Ena Kartal at 14:52, 12 May 2024

2024-05-12T14:52:54Z

← Older revision		Revision as of 14:52, 12 May 2024
Line 1:		Line 1:
	Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2329050124000184?via%3Dihub#bib15]		Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2329050124000184?via%3Dihub#bib15# All-in-one IQ toggle switches with high versatilities for fine-tuning of transgene expression in mammalian cells and tissues]

Ena Kartal at 14:51, 12 May 2024

2024-05-12T14:51:11Z

← Older revision		Revision as of 14:51, 12 May 2024
Line 1:		Line 1:
	~~== Wiki Fakultete za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerze v Ljubljani ==~~		Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2329050124000184?via%3Dihub#bib15]

	~~Dobrodošli na glavni strani wikija [http://www.fkkt.uni-lj.si/ FKKT UL]!~~

	~~Namen tega [http://sl.wikipedia~~.~~org/wiki/Wiki wikija] je, da učiteljem in študentom omogoči interaktivno sodelovanje pri vsebinah~~, ki ~~sodijo v sklop kemije~~, ~~biokemije~~, ~~kemijskega inženirstva~~ in ~~tehnologije~~. ~~Wiki lahko uporabljate~~ za ~~opise študijskih predmetov in vsebin~~, ~~za leksikone posameznih področij~~, ~~za opise tehnik in tehnologij~~, ~~za laboratorijske priročnike in dnevnike in še marsikaj drugega~~.		== Uvod ==
			Doslej razvita transgena stikala izkoriščajo zunanje dražljaje, ki jih lahko spreminjamo, kot so hormoni, kemikalije, težke kovine, toplota, svetloba ipd. Med genskimi stikali, ki so odvisni od majhnih molekul, je sistem Tet-On/Off (izkorišča tetraciklin ali njegove derivate, kot sta doksiciklin in minociklin) veljalo za najmočnejšo metodo za induciranje izražanja transgenov. Pogosto opažena nesprejemljiva stopnja pušččanja tega sistema poskušali so odpraviti z uporabo enovektorskega pristopa optimiziranega za proizvodnjo lentivirusa. Sistem 'vse v enem' Tet-Off je zmanjšal bazalno puščanje, vendar na račun moči indukcije transgena. Zaradi tega so razvili represibilni binarni transgenski indukcijski sistem, stikalo Q (ali SIQ), pridobljeno iz glive Neurospora crassa. SIQ ni pokazalo nobenega puščanja pri izražanju transgena v celicah sesalcev, hkrati pa je ohranjalo visoko občutljivost na kemični induktor [1,2].

	Za ~~vpisovanje novih podatkov in ustvarjanje novih strani se morate najprej [[Registracija\|registrirati]]~~. ~~Registracija~~ je ~~ročna~~, ~~vpisane registracijske podatke pa [mailto:wiki~~.~~sysop@fkkt~~.~~uni~~-~~lj.si administrator~~] ~~preverja~~.		Za izdelavo novega SIQ so uporabljali vektor pENTR-EUI. Pred tem so dokazali, da je bilo singularno gensko stikalo (EUI) na osnovi Gal4/UAS uspešno implementirano za transgensko indukcijo v človeških celičnih linijah, vendar je transgenska inducibilnost sistema Gal4/UAS na splošno šibkejša ter je zelo občutljiv na metilacijo, kar lahko provzroči utišanje transgena po zaporednih generacijah. Na osnovi tega so za izdelavo novega sistema uporabili podoben vektor z uvedbo določenih sprememb, kot je recimo takoimenovani pogonski modul, ki je ključen za izražanje komponent potrebnih za vezavo na elemente ojačevalca 13 x QUAS, ki nato inducirajo transkripcijo transgena le, če ga stimulirajo kemični dražljaji. Končni vektor pSIQ je bil zasnovan tako, da izgubi tako pUC ori kot dva izbirna markerja po rekombinaciji z vektorjem pAd/PL-DEST za pripravo adenovirusa [1].

	~~Wiki FKKT UL poganja [http://en~~.~~wikipedia.org/wiki/MediaWiki Mediawiki]~~, ki je ~~verjetno najbolj znano programje v svetu wikijev in ki ga uporablja tudi [http://sl~~.~~wikipedia.org/wiki/Glavna_stran Wikipedija]. O njegovi uporabi boste zlahka našli vse tiste informacije~~, ki so ~~potrebne za osnovno delo~~ z ~~wikijem; nekaj jih~~ je ~~zbranih~~ na ~~strani [http://wiki~~.~~fkkt~~.~~uni~~-lj.~~si/index.php/Help:Contents Pomoč~~].		== SIQ omogoča enostavno ustvarjanje stabilnih celičnih linij ==
			Vektor pSIQ vsebuje prepoznavno meto serin integraze (phiC31) attB, ki omogoča generiranje stabilnih celičnih linij z rekombinacijo na osnovi integraze. V preskusni vektor so kot transgen vstavili zapis za EGFP, ki je odvisen od odmerka tebufenozida (Teb). S kontransfekcijo vektora pSIQ, ki kodira transgen EGFP, z ekspresijskim vektorjem integraze v HEK293-attP-Bla celicah so potrdili njihovo pravilno implantacijo na mesto attP gostiteljskega genoma. Potem so dokazali, da je raven izražanja EGFP naraščala z neprekinjenim dodajanjem Teb in je dosegla plato po 48 urah. Poleg tega vzpostavljena celična linija se je odzvala izključno na eksogene kemične dražljaje, kar so dokazali z opaženo postopno zmanjševanje ravni EGFP po odstranitvi Teb. Natančnost SIQ so dokazali tudi z generiranjem druge stabilne celične linije s istim transgenom in vsemi komponentami SIQ razen pogonskega modula (CMV-QFDBD-2x AD-VP16-EcR-poly(A)). Čeprav je prišlo do integracije na identičen attP lokus HEK293-attP-Bla celičnih linij, te brez pogonskega modula niso pokazale nobenega odziva na dražljaje z uporabo Teb. Pomembno je omeniti tudi to, da je SIQ-EGFP brez dodajanja Teb prikazala le zanemarljivo raven izražanja EGFP [1,3,4].

	~~Želimo vam veliko veselja~~ z uporabo ~~novega wikija!~~		== Preklopno stikalo SIQ lahko preuredimo v sistem za dostavo genov posredovani z adenovirusi ==
			Sistemi za dostavo genov, posredovani z adenovirusi, so bili v veliki meri uporabljeni za klinične aplikacije. Glavna pomanjkljivost virusnega vektorja je to, da kaže sposobnost okužbe širokega sprektra celičnih linij. Poleg tega narava adenovirusa je taka, da ne pride do integracije v genom gostiteljskega organizma, kar sčasoma privede do zmanjševanja ravni virusnega genoma v celicah. Da bi olajšali učinkovito dostavo pSIQ v celice, ki kažejo zelo nizko učinkovitost transfekcije, so uporabili adenovirusni pakirni sistem. Vektor pSIQ z EGFP so in vitro integrirali z vektorjem pAd/PL-DEST. Poleg tega pripravili so tudi adenovirusni vektor pENTR-EUI, ki se odziva na Teb. pENTR-EUI, ki nosi zapis za EGFP, je bil uporabljen za proizvodnjo adenovirusa (Ad/EUI-EGFP) po združitvi s vektorjem pAd/PL-DEST. Izražanje EGFP v pENTR-EUI je bilo kontrolirano z sistemom Gal4/UAS, kar je služilo kot kontrola za primerjavo sistema SIQ. Po različnih eksperimentih so dokazali, da je bil potreben vsaj 10x višji MOI (razmerje med številom transducirajočih vektorjev in številom celic) Ad/EUI-EGFP, da bi dosegli enakovreden odziv celic, okuženih z Ad/SQI-EGFP [5].

			Poročali so, da je intravensko injiciran adenovirus zelo nalezljiv za jetra, kamor virus najprej pride preko jetrne vene in se infiltrira v jetrne celice [6]. Da bi preverili ali je Ad/SIQ-EGFP, ki so ga uporabljali za okužbo keratinocitov HaCaT, uporaben tudi v raziskavah in vivo, so v repno veno miši injicirali 100 µL adenovirusa s povečano koncentracijo virusnih delcev. Po 24 urah okužbe z Ad/SIQ-EGFP so enkrat dnevno v 24-urnih intervalih z intraperitonealno injekcijo vbrizgali 100 µL PBS ali enako količino Teb (1mmol/L) raztopljenega v PBS. En dan po injiciranju kemičnega dražljaja so eviscerirali jetra, da bi preverili izražanje EGFP. Kot je bilo pričakovano samo pri jetrih, ki so bila okužena z virusom so pokazale pozitiven odziv na Teb za razliko od jeter, ki niso bila okužena. Še pomembnejše je bilo opažanje, da okužba z virusom v odsotnosti zdravljenja s Teb ni provzročila nobene zaznavne ekspresije EGFP. Pomembno je omeniti tudi to, da pri miših z virusno okužbo z uporabo Ad/SIQ-EGFP niso odkrili nobenih opaznih okvar jeter, niti po dolgotrajnem rednem dajanju Teb 3 tedne. Treba je omeniti, da preklopno stikalo SIQ presega sistem EUI, ki temelji na Gal4/UAS, in je primerljiv s konstitutivnim ekspresijskim sistemom, ki izhaja iz CMV in vivo [7].


	== ~~Povezave do kazal po področjih:~~ ==		== Sofisticirano transgensko preklapljanje lahko dosežemo s kombinacijo SIQ in genskega stikala cumate ==
			Čeprav je SIQ pokazal svojo visoko vsestranskost v celičnih linijah, pridobljenih iz človeka, obstaja proctor za izboljšave z vključitvijo drugih genskih regulacijskih elementov, ki jih je mogoče nadzorovati z drugimi kemičnimi ligandi. To vključuje recimo razvoj ortogonalnega genskega stikala, kjer lahko dva ali več različnih induktorjev uravnava izražanje transgena, ne da bi se med seboj motili. Na splošno kemičnih genskih stikal ni mogoče na hitro izklopiti zaradi dolgotrajnih učinkov kemičnih induktorjev na transgen. Da bi dosegli pospešeno supresijo ekspresije tarčnega gena, so v preklopno stikalo SIQ uvedli od kumata odvisen transgenski represor [8].

	* [[Kazalo KEM\|Kemija]]		Gensko stikalo na osnovi kumata je sestavljeno iz dveh glavnih komponent: represorskega modula CymR in zaporedja CuO, na katero se veže CymR in inhibira ekspresijo transgena. Kumat (4-izopropilbenzojska kislina) se neposredno veže na CymR in ga loči od CuO, kar provzroči derepresijo transgenske ekspresije. Golnilno zaporedje pSIQ so povezali s CymR preko zaporedja peptida 2A P2A ter so CuO, dolžine 28 baznih parvov, dodali neposredno pred mestom začetka transkripcije transgena pSIQ. Takšna ureditev omogoča hkratno izražanje gonilnega zaporedja SIQ in represorja CymR. Ta konstrukt imenovali so pSIQmate, ki je bil sestavljen iz 9001 nukleotida.
	* [[Kazalo BMB\|Biokemija in ~~molekularna biologija]]~~
	* [[Kazalo KIT\|Kemijsko inženirstvo in ~~tehnologija]]~~
	* [[Kazalo TEV\|Tehniška varnost]]

	== ~~Uporabno~~ ==		Da bi preizkusili odzivnost SIQmate na oba induktorja, so začasno transficirali celice HEK293 z pSIQmate-EGFP in jih nato obdelali s Teb ali kumatom posamično, pa tudi v kombinaciji. Rezultati obdelave celic so pokazali, da je prišlo do florescence EGFP samo v primerih uporabe obeh kemikalij sočasno. Poleg tega pokazalo se je, da so kloni, ki so bili obdelani samo s Teb, pokazali obrobno povišanje fluorescenčnih signalov. Ti signali niso bili dovolj močni, da bi jih lahko zaznali s fluorescenčno mikroskopijo in so zaradi tega naredili ponovno kvantifikacijo ampak z merjenjem aktivnosti luciferaze. Ta pojav je verjetno posledica občasnega odvajanja CymR od CuO ne glede na kumat, kar je pogost pojav med regulatorji transkripcije [9].
	* [[~~Leksikon KEM\|(Bio)kemijski leksikon~~]]
	* [[~~Tabela odpornosti materialov~~]] ~~(proti kemikalijam~~, ~~avtoklaviranje~~, ~~mikrovalovi)~~		Po ponovni kvantifikaciji z merjenjem aktivnosti luciferaze, je SIQmate pokazal znatno nižjo občutljivost na kemične dražljaje v primerjavi s SIQ (približno 0,2-kratna razlika). Iz the razlogov obstaja možnost potrebe nadaljnje optimizacije za povečanje robustnosti transgenske aktivacije v sistemu SIQmate.
	* [~~http~~://~~delloyd~~.~~50megs~~.~~com~~/~~moreinfo~~/~~buffers2~~.~~html Priprava pufrskih raztopin~~] ~~(tabele~~, ~~recepti)~~
			== Zaključek ==
			Obstaja več meril, ki jih je treba upoštevati, preden se oblikuje novo, kemično zasnovano transgensko preklopno stikalo. Vsak sistem za regulacijo transgenov ne sme biti toksičen za celice in organizme, mora biti izjemno občutljiv in natančno moduliran s pravilnim odmerkom spojin, ki delujejo kot kemični dražljaji [10].

			Usodna napaka binarne lasnosti transgenskih preklopnih stikal je, da je težko pričakovati, da bo dosegla enakomerno dostavo dveh ločenih vektorjev v ciljne celice in tkiva hkrati. Posledica tega je nastajajoča populacija celic z neenakomerno porazdeljenimi plazmidi. Čeprav se lahko raziskovalci izognejo proizvodnji neželene heterogene populacije celic z vzpostavitvijo stabilne celične linije, je to naporen in dolgotrajen proces [10]. Zato bi bila izdelava zanesljivega in vsestranskega singularnega transgenskega stikala zaželena na področju predkliničnih in bioloških raziskav. Dokazali so, da je preklopno stikalo SIQ boljše od EUI Sistema na osnovi Gal4/UAS v smislu večje občutljivosti na kemične dražljaje, nižje bazalne ekspresije in večje vsestranskosti. Takšen sistem najde široko uporabo, vključno s poskusi prehodne transfekcije, vzpostavitvijo stabilnih celičnih linij in proizvodnjo adenovirusa, pri čemer je za vse potreben le en krog subkloniranja transgenov v pSIQ.


			== Literatura ==
			[1] J. Hong et al., “All-in-one IQ toggle switches with high versatilities for fine-tuning of transgene expression in mammalian cells and tissues,” Mol Ther Methods Clin Dev, vol. 32, no. 1, p. 101202, Mar. 2024, doi: 10.1016/j.omtm.2024.101202.
			[2] E. Vigna et al., “Robust and Efficient Regulation of Transgene Expression in Vivo by Improved Tetracycline-Dependent Lentiviral Vectors,” Molecular Therapy, vol. 5, no. 3, pp. 252–261, Mar. 2002, doi: 10.1006/mthe.2002.0542.
			[3] C.-A. Lo, A. W. Greben, and B. E. Chen, “Generating stable cell lines with quantifiable protein production using CRISPR/Cas9-mediated knock-in,” Biotechniques, vol. 62, no. 4, pp. 165–174, Apr. 2017, doi: 10.2144/000114534.
			[4] C. A. Merrick, J. Zhao, and S. J. Rosser, “Serine Integrases: Advancing Synthetic Biology,” ACS Synth Biol, vol. 7, no. 2, pp. 299–310, Feb. 2018, doi: 10.1021/acssynbio.7b00308.
			[5] J. T. Bulcha, Y. Wang, H. Ma, P. W. L. Tai, and G. Gao, “Viral vector platforms within the gene therapy landscape,” Signal Transduct Target Ther, vol. 6, no. 1, p. 53, Feb. 2021, doi: 10.1038/s41392-021-00487-6.
			[6] S. J. Duncan et al., “Infection of Mouse Liver by Human Adenovirus Type 5,” Journal of General Virology, vol. 40, no. 1, pp. 45–61, Jul. 1978, doi: 10.1099/0022-1317-40-1-45.
			[7] S. Lee et al., “Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switches for Regulated Transgene Expression in Cells and Adult Rodent Tissues,” Mol Ther Nucleic Acids, vol. 5, p. e367, 2016, doi: 10.1038/mtna.2016.74.
			[8] A. Mullick et al., “The cumate gene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells,” BMC Biotechnol, vol. 6, no. 1, p. 43, 2006, doi: 10.1186/1472-6750-6-43.
			[9] A. Raj and A. van Oudenaarden, “Nature, Nurture, or Chance: Stochastic Gene Expression and Its Consequences,” Cell, vol. 135, no. 2, pp. 216–226, Oct. 2008, doi: 10.1016/j.cell.2008.09.050.
			[10] Y. Suzuki and Y. Suzuki, “Gene Regulatable Lentiviral Vector System,” in Viral Gene Therapy, InTech, 2011. doi: 10.5772/18155.

WikiSysop at 15:22, 14 January 2019

2019-01-14T15:22:14Z

← Older revision	Revision as of 15:22, 14 January 2019
Line 1:	Line 1:
		== Wiki Fakultete za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerze v Ljubljani ==

		Dobrodošli na glavni strani wikija [http://www.fkkt.uni-lj.si/ FKKT UL]!

		Namen tega [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wiki wikija] je, da učiteljem in študentom omogoči interaktivno sodelovanje pri vsebinah, ki sodijo v sklop kemije, biokemije, kemijskega inženirstva in tehnologije. Wiki lahko uporabljate za opise študijskih predmetov in vsebin, za leksikone posameznih področij, za opise tehnik in tehnologij, za laboratorijske priročnike in dnevnike in še marsikaj drugega.

		Za vpisovanje novih podatkov in ustvarjanje novih strani se morate najprej [[Registracija\|registrirati]]. Registracija je ročna, vpisane registracijske podatke pa [mailto:wiki.sysop@fkkt.uni-lj.si administrator] preverja.

		Wiki FKKT UL poganja [http://en.wikipedia.org/wiki/MediaWiki Mediawiki], ki je verjetno najbolj znano programje v svetu wikijev in ki ga uporablja tudi [http://sl.wikipedia.org/wiki/Glavna_stran Wikipedija]. O njegovi uporabi boste zlahka našli vse tiste informacije, ki so potrebne za osnovno delo z wikijem; nekaj jih je zbranih na strani [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Help:Contents Pomoč].

		Želimo vam veliko veselja z uporabo novega wikija!


		== Povezave do kazal po področjih: ==

		* [[Kazalo KEM\|Kemija]]
		* [[Kazalo BMB\|Biokemija in molekularna biologija]]
		* [[Kazalo KIT\|Kemijsko inženirstvo in tehnologija]]
		* [[Kazalo TEV\|Tehniška varnost]]

		== Uporabno ==
		* [[Leksikon KEM\|(Bio)kemijski leksikon]]
		* [[Tabela odpornosti materialov]] (proti kemikalijam, avtoklaviranje, mikrovalovi)
		* [http://delloyd.50megs.com/moreinfo/buffers2.html Priprava pufrskih raztopin] (tabele, recepti)

Karmenzbogar: Removing all content from page

2019-01-08T22:54:08Z

Removing all content from page

← Older revision		Revision as of 22:54, 8 January 2019
Line 1:		Line 1:
	~~Izvorni članek: Levskaya, A. et al. Engineering Escherichia coli to see light, Nature, 438, 441–442 (2005). [https://www.nature.com/articles/nature04405]~~


	~~== Uvod ==~~
	Študenti Univerze v Teksasu so leta 2005 v sodelovanju s Kalifornijsko Univerzo v San Franciscu pod vodstvom Christopher-ja Voigt pripravili prve bakterijske fotografije v sklopu tekmovanja (Intercollegiate Genetically Engineered Machine competition) na MIT (Massachusetts Institute of Technology). S pomočjo sintezne biologije so zasnovali bakterijski sistem, ki preklaplja med različnimi stanji pod svetlobo v rdečem območju vidnega spektra. S pomočjo projekcije svetlobe na biološki film so proizvedli visoko ločljivo dvodimenzionalno živo sliko (100 megapikslov na kvadratni palec) [1].

	~~== Odziv na svetlobo ==~~
	Ustvarili so svetlobni senzor, ki deluje v ''Escherichia coli''. Enterobakterije, kot je ''E. coli'', same po sebi niso sposobne zaznavati svetlobe, ker v njih ne najdemo fotoreceptorjev. Medtem ko rastline, alge in cianobakterije vsebujejo proteinske fotoreceptorje, znane kot fitokromi in jih uporabljajo za nadzor fotosinteze ter fototakse. Zato so uporabili fitokrom iz cianobakterije ''Synechocystis'' in sicer tako, da so ustvarili himere z bakterijsko histidin kinazo [1].

	Fitokrom sestavljata dve komponenti, membransko vezan zunajcelični senzor, ki se odziva na svetlobo in znotrajcelični regulator. Zato fitokromu rečemo dvokomponentni sistem. Znotrajcelični regulatorji v večini fitokromov ne uravnavajo izražanja genov direktno, saj nimajo DNA vezavnih domen. V ta namen so pripravili fitokrom s fuzijo fotoreceptorja cianobakterij Cph1 in histidin kinaze EnvZ.

	~~=== Sistem EnvZ-OmpR ===~~
	EnvZ je del dobro preučenega dvokomponentnega regulatornega sistema EnvZ-OmpR, ki ob pojavu osmotskega šoka uravnava izražanje porinov OmpC in OmpF. Ob visoki osmolarnosti je EnvZ podvržen avtofosforilaciji in prenese fosforilne skupine na OmpR preko tvorbe kompleksa. Ko se število fosforiliranih proteinov OmpR poveča, pride do vezave le-tega na aktivatorska mesta promotorja ''ompC'' in spodbujeno je izražanje porina OmpC. Pri nizki osmolarnosti se poveča izražanje porina OmpF, ki ima večji premer por in tako poveča difuzijo hranil ob osmotskem šoku [1], [2].

	~~=== Fikocianobilin ===~~
	Dodatno, fitokromi imajo linearne tetrapirolne prostetične skupine, ki omogočajo absorpcijo vidne svetlobe in se imenujejo bilini. Bilini izhajajo iz od kisika odvisnega odpiranja obroča hema. Cianobakterije Synechocystis imajo zapis za dva encima, ki prispevata k pretvorbi hema v fikocianobilin (PCB). Ta dva encima sta hem oksigenaza (HO1) in fikocianobilin: feredoksin oksidoreduktaza (PcyA), ki katalizirata pretvorbo hema v biliverdin IXa (BV) oziroma BV v PCB. [3]

	V E. coli PCB ni naravno sintetiziran, zato je bila njegova biosintezna pot uvedena preko plazmida pPL-PCB, ki je bil pridobljen od J. C. Lagarias in je bil predhodno pripravljen za biosintezo fitokroma v bakterijah. Plazmid vsebuje mesto začetka replikacije p15a in vsebuje gena ''ho1'' in ''pcyA'', za pretvorbo hema v PCB, pod kontrolo promotorja Para/lac. Zamenjali so le odpornost na kanamicin z odpornostjo na ampicilin [1].

	~~== Testiranje aktivnosti fitokromov ==~~
	Za pregledovanje aktivnosti fotoreceptorjev so uporabili E. coli RU1012 [MC4100 ara + Φ(OmpC-''lacZ'') 10-25 Δ''envZ'' :: KanR]. Sev ima v kromosomu zapis za promotor ''ompC'', fuziran z ''lacZ'' reporterjem.

	Iz cianobakterije Synechocystis so izolirali fitokrom Cph1. Pred tem so izvedli poravnavo CLUSTALW različnih fitokromov Cph1 z EnvZ. Izdelali so knjižnico s spreminjanjem števila aminokislin Cph1 (+/- 9 aminokislin). S spreminjanjem števila aminokislin Cph1 so konstruirali vrsto himer z variabilno dolžino dela, ki povezuje fotoreceptor z znotrajceličnim regulatorjem, saj dolžina in sestava peptida lahko vpliva na signalno transdukcijo. Število aminokislin pri EnvZ je bilo ohranjeno in sicer zadnjih 229 aminokislin.
	Himerne fitokrome so ligirali v plazmid pPOROTet. Plazmid vsebuje tetraciklinski promotor, odpornost na kloramfenikol in mesto začetka replikacije ColE1. Najprej je bila histidin kinazna domena ''envZ'' ligirana v ogrodje pPROTet in s tem so tvorili plazmid pPRO-HK. Fragment envZ so pomnožili s pomočjo reakcije PCR z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki so vsebovali restrikcijska mesta NdeI in XbaI. Sledila je ligacija preko teh restrikcijskih mest v ogrodje. Fragmente fitokromov so nato vstavili preko KpnI in NdeI restrikcisjkih mest [1].

	~~=== Millerjev poskus ===~~
	Seve RU1012, transformirane s pPL-PCB in plazmidom, ki kodira eno od himer, so gojili čez noč. Kulture so bile razredčene in izpostavljene širokemu spektru svetlobe (ena ploščica s 24 luknjicami) oziroma zaščitene pred svetlobo (druga ploščica zavita v aluminijasto folijo). Nato so izvedli Millerjev poskus, kjer gre za določanje koncentracije β-galaktozidaze. Poleg laktoze, lahko cepi tudi sintetično spojino o-nitrofenil-β-D-galaktozid (ONPG) in kot produkt nastane galaktoza in o-nitrofenol, ki ima rumeno barvo. Kadar je ONPG v reakciji presežen nad encimom, je proizvodnja o-nitrofenola na enoto časa sorazmerna koncentraciji β-galaktozidaze. Tako se lahko za določitev koncentracije encima uporabi rumena barva. Eksperiment je zasnovan tako, da se promotor združi z genom ''lacZ''. Celice so tako zbrali za analizo izražanja β-galaktozidaze pod kontrolo promotorja ''ompC'' [1], [4].

	Izkazalo se je, da je najbolj aktivna himera Cph8, ki pa ima eno aminokislino manj kot himera, ki se je izkazala za najbolj aktivno po poravnavi. Ta vsebuje prvih 517 aminokislin Cph1 in zadnjih 229 aminokislin EnvZ. Himera je bila ligirana v pPRO-HK in pri tem so tvorili pCPH8. V domeni Cph1 ni bilo nobenih substitucij aminokislin, medtem ko obstaja mutacija I v V na mestu 136 domene EnvZ. Millerjev poskus je pokazal, da je Cph8 v prisotnosti PCB v temi aktivna in na svetlobi neaktivna. V odsotnosti Cph8 ni svetlobno odvisne aktivnosti in obstaja konstitutivna aktivnost, kadar je izražena samo domena histidin kinaze EnvZ, ali kadar ni inducirana presnovna pot PCB [1].

	~~== Snemanje bakterijskih fotografij ==~~
	Vse bakterijske slike so bile posnete z uporabo E. coli, seva CP919, ki je izpeljan iz RU1012 in nosi dodaten transpozon. Transpozon povzroči inaktivacijo genov rbsK in rbsB, ki zapisujeta za ribokinazo ter protein, ki veže ribozo. Sev je bil transformiran s pPCB in pCPH8, kar je ustvarilo svetlobno občutljiv sev za poskuse bakterijske fotografije. Bakterije so gojili na agarnih ploščah. Ob aktivaciji s svetlobo je prišlo do izražanja LacZ, ki pa katalizira tvorbo stabilne črne oborine iz S-gal (3,4-cikloheksenoskuletin-β-D-galaktopiranozid). Rdeča svetloba poganja senzor v stanje, v katerem je avtofosforilacija EnvZ inhibirana, kar zavre izražanje genov in tako ne pride do tvorbe črne spojine. Na območju svetlobe se zato pojavijo svetli deli, na temnih območjih pa temni deli slike. Z naraščajočo intenzivnostjo svetlobe so pokazali tudi stopenjski odziv sistema. Aktivnost pri najbolj intenzivni svetlobi je bila minimalna [1].

	~~=== Kamera ===~~
	Bakterijska kamera, ki se uporablja za snemanje slik je sestavljena iz vira svetlobe, ki je 100W svetilka in slikovnega projektorja z objektivom za ostrenje slike. Slednji je nameščen 75 mm nad 632 nm ozkim optičnim pasovnim filtrom. Pod filtrom je 35-milimetrski diapozitiv, na katerega je posneta fotografija, ki je nameščena na električni pogon, ki se uporablja za nastavitev ostrine. Slika je projicirana 38 cm pod objektiv v inkubator in na veliko ploščo, ki vsebuje biofilm [1].

	~~== Napredki v bakterijski fotografiji ==~~
	Leta 2017 je Christopher A. Voigt s sodelavci objavil publikacijo v kateri opisujejo gensko kodiran sistem, ki daje E. coli zmožnost razlikovanja med rdečo, zeleno in modro (RGB) svetlobo ter se odziva s spreminjanjem izražanja genov. Ta sistem so uporabili za izdelavo barvnih fotografij na ploščah bakterijske kulture z nadzorovanjem proizvodnje pigmentov.
	Barvno fotografijo so dosegli z združitvijo svetlobnih senzorjev, ki se odzivajo na različne valovne dolžine. Rdeči in zeleni senzorji temeljijo na fitokromih s fikocianobilinom (PCB). Rdeča svetloba je zaznana s Cph8, ki jo vklopi infrardeča (705 nm) svetloba in izključena z rdečo (650 nm) svetlobo. Ta senzor je bil prej uporabljen za ustvarjanje črno-belih bakterijskih fotografij (opisano zgoraj). Senzor zelene svetlobe temelji na Synechocystis CcaSR, ki se vklopi z zeleno (535 nm) svetlobo in izklopi pri daljno rdeči (672 nm) svetlobi. Senzor modre svetlobe uporablja himerno histidin kinazo (YF1), ki vsebuje flavin mononukleotid (FMN). Izklopi se s svetlobo pri 470 nm in je vklopljen v njeni odsotnosti. Šlo pa je za sistem kjer pride do izražanja encimov, ki so ustvarjajo barvne pigmente na ploščici. Rdeče, zelene in modre barve so proizvedli z izražanjem glukuronidaze (GusA), β-galaktozidaze (LacZ) in monooksigenaze (bFMO) in dodatkom IPTG ter Rose-gluc, X-Gal, ali triptofana (Trp) [5] .
	~~Več podrobnosti najdete v publikaciji na spletni strani revije Nature: https://www.nature.com/articles/nchembio.2390~~

	~~== Zaključek ==~~
	Njihovo ustvarjanje novega genetskega vezja leta 2005 s funkcijo obdelave slik z izražanjem črnega barvila prikazuje uporabnost ter dostopnost orodij in metod, poleg tega pa napredek v nastajajočem polju sintezne biologije. Prostorski in časovni nadzor izražanja genov v posameznih celicah in populacijah bi se lahko uporabil za preučevanje signalnih poti, večceličnih signalnih omrežij, izdelavi kompozitov bioloških materialov ter v bakterijski mikrolitografiji. Razmišljali so v smeri, da bi namesto izdelave črnega pigmenta bakterije sintetizirale proteine, kot je pajkova mreža.
	Do leta 2017 je opazen viden napredek v bakterijski fotografiji in uporabi svetlobnih senzorjev v druge namene. Posamezni senzorji svetlobe so bili uporabljeni za induciranje lize, urejanje genoma in tudi biomedicinske aplikacije. Popolno izkoriščanje celotnega spektra svetlobnih senzorjev hkrati v posameznih celicah zagotavlja številne gumbe, s katerimi lahko nadziramo celice hitro in, prostorsko in od daleč.

	~~== Viri in literatura ==~~
	~~[1] Levskaya, A. et al. Engineering Escherichia coli to see light, Nature, 438, 441–442 (2005).~~

	~~[2] Sheng Jian Cai and Masayori Inouye, EnvZ-OmpR Interaction and Osmoregulation in Escherichia coli, The Journal of Biological Chemistry, 277, 24155-24161 (2002).~~

	~~[3] G. A. Gambetta and J. C. Lagarias, Genetic engineering of phytochrome biosynthesis in bacteria, Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 10566–10571 (2001).~~

	~~[4] Smale ST., Beta-galactosidase assay, Cold Spring Harb Protoc. (2010).~~

	~~[5] J. Fernandez-Rodriguez, F. Moser, M. Song and C. A. Voigt, Engineering RGB color vision into Escherichia coli, Nature Chemical Biology, 13, 706–708 (2017)~~

Karmenzbogar: /* Millerjev poskus */

2019-01-08T22:21:35Z

Millerjev poskus

← Older revision		Revision as of 22:21, 8 January 2019
Line 25:		Line 25:

	=== Millerjev poskus ===		=== Millerjev poskus ===
	Seve RU1012, transformirane s pPL-PCB in plazmidom, ki kodira eno od himer, so gojili čez noč. Kulture so bile razredčene in izpostavljene širokemu spektru svetlobe (ena ploščica s 24 luknjicami) oziroma zaščitene pred svetlobo (druga ploščica zavita v aluminijasto folijo). Nato so izvedli Millerjev poskus, kjer gre za določanje koncentracije β-galaktozidaze. Poleg laktoze, lahko cepi tudi sintetično spojino o-nitrofenil-β-D-galaktozid (ONPG) in kot produkt nastane galaktoza in o-nitrofenol, ki ima rumeno barvo. Kadar je ONPG v reakciji presežen nad encimom, je proizvodnja o-nitrofenola na enoto časa sorazmerna koncentraciji β-galaktozidaze. Tako se lahko za določitev koncentracije encima uporabi rumena barva. Eksperiment je zasnovan tako, da se promotor združi z genom lacZ. Celice so tako zbrali za analizo izražanja β-galaktozidaze pod kontrolo promotorja ompC [1], [4].		Seve RU1012, transformirane s pPL-PCB in plazmidom, ki kodira eno od himer, so gojili čez noč. Kulture so bile razredčene in izpostavljene širokemu spektru svetlobe (ena ploščica s 24 luknjicami) oziroma zaščitene pred svetlobo (druga ploščica zavita v aluminijasto folijo). Nato so izvedli Millerjev poskus, kjer gre za določanje koncentracije β-galaktozidaze. Poleg laktoze, lahko cepi tudi sintetično spojino o-nitrofenil-β-D-galaktozid (ONPG) in kot produkt nastane galaktoza in o-nitrofenol, ki ima rumeno barvo. Kadar je ONPG v reakciji presežen nad encimom, je proizvodnja o-nitrofenola na enoto časa sorazmerna koncentraciji β-galaktozidaze. Tako se lahko za določitev koncentracije encima uporabi rumena barva. Eksperiment je zasnovan tako, da se promotor združi z genom ''lacZ''. Celice so tako zbrali za analizo izražanja β-galaktozidaze pod kontrolo promotorja ''ompC'' [1], [4].

	Izkazalo se je, da je najbolj aktivna himera Cph8, ki pa ima eno aminokislino manj kot himera, ki se je izkazala za najbolj aktivno po poravnavi. Ta vsebuje prvih 517 aminokislin Cph1 in zadnjih 229 aminokislin EnvZ. Himera je bila ligirana v pPRO-HK in pri tem so tvorili pCPH8. V domeni Cph1 ni bilo nobenih substitucij aminokislin, medtem ko obstaja mutacija I v V na mestu 136 domene EnvZ. Millerjev poskus je pokazal, da je Cph8 v prisotnosti PCB v temi aktivna in na svetlobi neaktivna. V odsotnosti Cph8 ni svetlobno odvisne aktivnosti in obstaja konstitutivna aktivnost, kadar je izražena samo domena histidin kinaze EnvZ, ali kadar ni inducirana presnovna pot PCB [1].		Izkazalo se je, da je najbolj aktivna himera Cph8, ki pa ima eno aminokislino manj kot himera, ki se je izkazala za najbolj aktivno po poravnavi. Ta vsebuje prvih 517 aminokislin Cph1 in zadnjih 229 aminokislin EnvZ. Himera je bila ligirana v pPRO-HK in pri tem so tvorili pCPH8. V domeni Cph1 ni bilo nobenih substitucij aminokislin, medtem ko obstaja mutacija I v V na mestu 136 domene EnvZ. Millerjev poskus je pokazal, da je Cph8 v prisotnosti PCB v temi aktivna in na svetlobi neaktivna. V odsotnosti Cph8 ni svetlobno odvisne aktivnosti in obstaja konstitutivna aktivnost, kadar je izražena samo domena histidin kinaze EnvZ, ali kadar ni inducirana presnovna pot PCB [1].

Karmenzbogar: /* Testiranje aktivnosti fitokromov */

2019-01-08T22:19:15Z

Testiranje aktivnosti fitokromov

← Older revision		Revision as of 22:19, 8 January 2019
Line 19:		Line 19:

	== Testiranje aktivnosti fitokromov ==		== Testiranje aktivnosti fitokromov ==
	Za pregledovanje aktivnosti fotoreceptorjev so uporabili E. coli RU1012 [MC4100 ara + Φ(OmpC-lacZ) 10-25 ~~ΔenvZ~~ :: KanR]. Sev ima v kromosomu zapis za promotor ompC, fuziran z lacZ reporterjem.		Za pregledovanje aktivnosti fotoreceptorjev so uporabili E. coli RU1012 [MC4100 ara + Φ(OmpC-''lacZ'') 10-25 Δ''envZ'' :: KanR]. Sev ima v kromosomu zapis za promotor ''ompC'', fuziran z ''lacZ'' reporterjem.

	Iz cianobakterije Synechocystis so izolirali fitokrom Cph1. Pred tem so izvedli poravnavo CLUSTALW različnih fitokromov Cph1 z EnvZ. Izdelali so knjižnico s spreminjanjem števila aminokislin Cph1 ( 9 aminokislin). S spreminjanjem števila aminokislin Cph1 so konstruirali vrsto himer z variabilno dolžino dela, ki povezuje fotoreceptor z znotrajceličnim regulatorjem, saj dolžina in sestava peptida lahko vpliva na signalno transdukcijo. Število aminokislin pri EnvZ je bilo ohranjeno in sicer zadnjih 229 aminokislin.		Iz cianobakterije Synechocystis so izolirali fitokrom Cph1. Pred tem so izvedli poravnavo CLUSTALW različnih fitokromov Cph1 z EnvZ. Izdelali so knjižnico s spreminjanjem števila aminokislin Cph1 (+/- 9 aminokislin). S spreminjanjem števila aminokislin Cph1 so konstruirali vrsto himer z variabilno dolžino dela, ki povezuje fotoreceptor z znotrajceličnim regulatorjem, saj dolžina in sestava peptida lahko vpliva na signalno transdukcijo. Število aminokislin pri EnvZ je bilo ohranjeno in sicer zadnjih 229 aminokislin.
	Himerne fitokrome so ligirali v plazmid pPOROTet. Plazmid vsebuje tetraciklinski promotor, odpornost na kloramfenikol in mesto začetka replikacije ColE1. Najprej je bila histidin kinazna domena envZ ligirana v ogrodje pPROTet in s tem so tvorili plazmid pPRO-HK. Fragment envZ so pomnožili s pomočjo reakcije PCR z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki so vsebovali restrikcijska mesta NdeI in XbaI. Sledila je ligacija preko teh restrikcijskih mest v ogrodje. Fragmente fitokromov so nato vstavili preko KpnI in NdeI restrikcisjkih mest [1].		Himerne fitokrome so ligirali v plazmid pPOROTet. Plazmid vsebuje tetraciklinski promotor, odpornost na kloramfenikol in mesto začetka replikacije ColE1. Najprej je bila histidin kinazna domena ''envZ'' ligirana v ogrodje pPROTet in s tem so tvorili plazmid pPRO-HK. Fragment envZ so pomnožili s pomočjo reakcije PCR z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki so vsebovali restrikcijska mesta NdeI in XbaI. Sledila je ligacija preko teh restrikcijskih mest v ogrodje. Fragmente fitokromov so nato vstavili preko KpnI in NdeI restrikcisjkih mest [1].

	=== Millerjev poskus ===		=== Millerjev poskus ===
	Seve RU1012, transformirane s pPL-PCB in plazmidom, ki kodira eno od himer, so gojili čez noč. Kulture so bile razredčene in izpostavljene širokemu spektru svetlobe (ena ploščica s 24 luknjicami) oziroma zaščitene pred svetlobo (druga ploščica zavita v aluminijasto folijo). Nato so izvedli Millerjev poskus, kjer gre za določanje koncentracije β-galaktozidaze. Poleg laktoze, lahko cepi tudi sintetično spojino o-nitrofenil-β-D-galaktozid (ONPG) in kot produkt nastane galaktoza in o-nitrofenol, ki ima rumeno barvo. Kadar je ONPG v reakciji presežen nad encimom, je proizvodnja o-nitrofenola na enoto časa sorazmerna koncentraciji β-galaktozidaze. Tako se lahko za določitev koncentracije encima uporabi rumena barva. Eksperiment je zasnovan tako, da se promotor združi z genom lacZ. Celice so tako zbrali za analizo izražanja β-galaktozidaze pod kontrolo promotorja ompC [1], [4].		Seve RU1012, transformirane s pPL-PCB in plazmidom, ki kodira eno od himer, so gojili čez noč. Kulture so bile razredčene in izpostavljene širokemu spektru svetlobe (ena ploščica s 24 luknjicami) oziroma zaščitene pred svetlobo (druga ploščica zavita v aluminijasto folijo). Nato so izvedli Millerjev poskus, kjer gre za določanje koncentracije β-galaktozidaze. Poleg laktoze, lahko cepi tudi sintetično spojino o-nitrofenil-β-D-galaktozid (ONPG) in kot produkt nastane galaktoza in o-nitrofenol, ki ima rumeno barvo. Kadar je ONPG v reakciji presežen nad encimom, je proizvodnja o-nitrofenola na enoto časa sorazmerna koncentraciji β-galaktozidaze. Tako se lahko za določitev koncentracije encima uporabi rumena barva. Eksperiment je zasnovan tako, da se promotor združi z genom lacZ. Celice so tako zbrali za analizo izražanja β-galaktozidaze pod kontrolo promotorja ompC [1], [4].

	Izkazalo se je, da je najbolj aktivna himera Cph8, ki pa ima eno aminokislino manj kot himera, ki se je izkazala za najbolj aktivno po poravnavi. Ta vsebuje prvih 517 aminokislin Cph1 in zadnjih 229 aminokislin EnvZ. Himera je bila ligirana v pPRO-HK in pri tem so tvorili pCPH8. V domeni Cph1 ni bilo nobenih substitucij aminokislin, medtem ko obstaja mutacija ~~IV~~ na mestu 136 domene EnvZ. Millerjev poskus je pokazal, da je Cph8 v prisotnosti PCB v temi aktivna in na svetlobi neaktivna. V odsotnosti Cph8 ni svetlobno odvisne aktivnosti in obstaja konstitutivna aktivnost, kadar je izražena samo domena histidin kinaze EnvZ, ali kadar ni inducirana presnovna pot PCB [1].		Izkazalo se je, da je najbolj aktivna himera Cph8, ki pa ima eno aminokislino manj kot himera, ki se je izkazala za najbolj aktivno po poravnavi. Ta vsebuje prvih 517 aminokislin Cph1 in zadnjih 229 aminokislin EnvZ. Himera je bila ligirana v pPRO-HK in pri tem so tvorili pCPH8. V domeni Cph1 ni bilo nobenih substitucij aminokislin, medtem ko obstaja mutacija I v V na mestu 136 domene EnvZ. Millerjev poskus je pokazal, da je Cph8 v prisotnosti PCB v temi aktivna in na svetlobi neaktivna. V odsotnosti Cph8 ni svetlobno odvisne aktivnosti in obstaja konstitutivna aktivnost, kadar je izražena samo domena histidin kinaze EnvZ, ali kadar ni inducirana presnovna pot PCB [1].

	== Snemanje bakterijskih fotografij ==		== Snemanje bakterijskih fotografij ==

Karmenzbogar: /* Odziv na svetlobo */

2019-01-08T22:09:50Z

Odziv na svetlobo

← Older revision		Revision as of 22:09, 8 January 2019
Line 6:		Line 6:

	== Odziv na svetlobo ==		== Odziv na svetlobo ==
	Ustvarili so svetlobni senzor, ki deluje v Escherichia coli. Enterobakterije, kot je E. coli, same po sebi niso sposobne zaznavati svetlobe, ker v njih ne najdemo fotoreceptorjev. Medtem ko rastline, alge in cianobakterije vsebujejo proteinske fotoreceptorje, znane kot fitokromi in jih uporabljajo za nadzor fotosinteze ter fototakse. Zato so uporabili fitokrom iz cianobakterije Synechocystis in sicer tako, da so ustvarili himere z bakterijsko histidin kinazo [1].		Ustvarili so svetlobni senzor, ki deluje v ''Escherichia coli''. Enterobakterije, kot je ''E. coli'', same po sebi niso sposobne zaznavati svetlobe, ker v njih ne najdemo fotoreceptorjev. Medtem ko rastline, alge in cianobakterije vsebujejo proteinske fotoreceptorje, znane kot fitokromi in jih uporabljajo za nadzor fotosinteze ter fototakse. Zato so uporabili fitokrom iz cianobakterije ''Synechocystis'' in sicer tako, da so ustvarili himere z bakterijsko histidin kinazo [1].

	Fitokrom sestavljata dve komponenti, membransko vezan zunajcelični senzor, ki se odziva na svetlobo in znotrajcelični regulator. Zato fitokromu rečemo dvokomponentni sistem. Znotrajcelični regulatorji v večini fitokromov ne uravnavajo izražanja genov direktno, saj nimajo DNA vezavnih domen. V ta namen so pripravili fitokrom s fuzijo fotoreceptorja cianobakterij Cph1 in histidin kinaze EnvZ.		Fitokrom sestavljata dve komponenti, membransko vezan zunajcelični senzor, ki se odziva na svetlobo in znotrajcelični regulator. Zato fitokromu rečemo dvokomponentni sistem. Znotrajcelični regulatorji v večini fitokromov ne uravnavajo izražanja genov direktno, saj nimajo DNA vezavnih domen. V ta namen so pripravili fitokrom s fuzijo fotoreceptorja cianobakterij Cph1 in histidin kinaze EnvZ.

	=== Sistem EnvZ-OmpR ===		=== Sistem EnvZ-OmpR ===
	EnvZ je del dobro preučenega dvokomponentnega regulatornega sistema EnvZ-OmpR, ki ob pojavu osmotskega šoka uravnava izražanje porinov OmpC in OmpF. Ob visoki osmolarnosti je EnvZ podvržen avtofosforilaciji in prenese fosforilne skupine na OmpR preko tvorbe kompleksa. Ko se število fosforiliranih proteinov OmpR poveča, pride do vezave le-tega na aktivatorska mesta promotorja ompC in spodbujeno je izražanje porina OmpC. Pri nizki osmolarnosti se poveča izražanje porina OmpF, ki ima večji premer por in tako poveča difuzijo hranil ob osmotskem šoku [1], [2].		EnvZ je del dobro preučenega dvokomponentnega regulatornega sistema EnvZ-OmpR, ki ob pojavu osmotskega šoka uravnava izražanje porinov OmpC in OmpF. Ob visoki osmolarnosti je EnvZ podvržen avtofosforilaciji in prenese fosforilne skupine na OmpR preko tvorbe kompleksa. Ko se število fosforiliranih proteinov OmpR poveča, pride do vezave le-tega na aktivatorska mesta promotorja ''ompC'' in spodbujeno je izražanje porina OmpC. Pri nizki osmolarnosti se poveča izražanje porina OmpF, ki ima večji premer por in tako poveča difuzijo hranil ob osmotskem šoku [1], [2].

	=== Fikocianobilin ===		=== Fikocianobilin ===
	Dodatno, fitokromi imajo linearne tetrapirolne prostetične skupine, ki omogočajo absorpcijo vidne svetlobe in se imenujejo bilini. Bilini izhajajo iz od kisika odvisnega odpiranja obroča hema. Cianobakterije Synechocystis imajo zapis za dva encima, ki prispevata k pretvorbi hema v fikocianobilin (PCB). Ta dva encima sta hem oksigenaza (HO1) in fikocianobilin: feredoksin oksidoreduktaza (PcyA), ki katalizirata pretvorbo hema v biliverdin IXa (BV) oziroma BV v PCB. [3]		Dodatno, fitokromi imajo linearne tetrapirolne prostetične skupine, ki omogočajo absorpcijo vidne svetlobe in se imenujejo bilini. Bilini izhajajo iz od kisika odvisnega odpiranja obroča hema. Cianobakterije Synechocystis imajo zapis za dva encima, ki prispevata k pretvorbi hema v fikocianobilin (PCB). Ta dva encima sta hem oksigenaza (HO1) in fikocianobilin: feredoksin oksidoreduktaza (PcyA), ki katalizirata pretvorbo hema v biliverdin IXa (BV) oziroma BV v PCB. [3]
	V E. coli PCB ni naravno sintetiziran, zato je bila njegova biosintezna pot uvedena preko plazmida pPL-PCB, ki je bil pridobljen od J. C. Lagarias in je bil predhodno ~~konstruiran~~ za biosintezo fitokroma v bakterijah. Plazmid vsebuje mesto začetka replikacije p15a in vsebuje gena ho1 in pcyA, za pretvorbo hema v PCB, pod kontrolo Para/lac ~~promotorja~~. Zamenjali so le odpornost na kanamicin z odpornostjo na ampicilin [1].
			V E. coli PCB ni naravno sintetiziran, zato je bila njegova biosintezna pot uvedena preko plazmida pPL-PCB, ki je bil pridobljen od J. C. Lagarias in je bil predhodno pripravljen za biosintezo fitokroma v bakterijah. Plazmid vsebuje mesto začetka replikacije p15a in vsebuje gena ''ho1'' in ''pcyA'', za pretvorbo hema v PCB, pod kontrolo promotorja Para/lac. Zamenjali so le odpornost na kanamicin z odpornostjo na ampicilin [1].

	== Testiranje aktivnosti fitokromov ==		== Testiranje aktivnosti fitokromov ==

Karmenzbogar: /* Uvod */

2019-01-08T22:05:29Z

Uvod

← Older revision		Revision as of 22:05, 8 January 2019
Line 3:		Line 3:

	== Uvod ==		== Uvod ==
	Študenti Univerze v Teksasu so leta 2005 v sodelovanju s Kalifornijsko Univerzo v San Franciscu pod vodstvom Christopher-ja Voigt pripravili prve bakterijske fotografije v sklopu tekmovanja (Intercollegiate Genetically Engineered Machine competition) na MIT (Massachusetts Institute of Technology). S pomočjo sintezne biologije so zasnovali bakterijski sistem, ki preklaplja med različnimi stanji pod svetlobo v rdečem območju vidnega spektra. S pomočjo projekcije svetlobe na biološki film so proizvedli visoko ločljivo dvodimenzionalno živo sliko (100 megapikslov na kvadratni palec)[1].		Študenti Univerze v Teksasu so leta 2005 v sodelovanju s Kalifornijsko Univerzo v San Franciscu pod vodstvom Christopher-ja Voigt pripravili prve bakterijske fotografije v sklopu tekmovanja (Intercollegiate Genetically Engineered Machine competition) na MIT (Massachusetts Institute of Technology). S pomočjo sintezne biologije so zasnovali bakterijski sistem, ki preklaplja med različnimi stanji pod svetlobo v rdečem območju vidnega spektra. S pomočjo projekcije svetlobe na biološki film so proizvedli visoko ločljivo dvodimenzionalno živo sliko (100 megapikslov na kvadratni palec) [1].

	== Odziv na svetlobo ==		== Odziv na svetlobo ==

Karmenzbogar: /* Napredki v bakterijski fotografiji */

2019-01-08T22:03:48Z

Napredki v bakterijski fotografiji

← Older revision		Revision as of 22:03, 8 January 2019
Line 37:		Line 37:
	Leta 2017 je Christopher A. Voigt s sodelavci objavil publikacijo v kateri opisujejo gensko kodiran sistem, ki daje E. coli zmožnost razlikovanja med rdečo, zeleno in modro (RGB) svetlobo ter se odziva s spreminjanjem izražanja genov. Ta sistem so uporabili za izdelavo barvnih fotografij na ploščah bakterijske kulture z nadzorovanjem proizvodnje pigmentov.		Leta 2017 je Christopher A. Voigt s sodelavci objavil publikacijo v kateri opisujejo gensko kodiran sistem, ki daje E. coli zmožnost razlikovanja med rdečo, zeleno in modro (RGB) svetlobo ter se odziva s spreminjanjem izražanja genov. Ta sistem so uporabili za izdelavo barvnih fotografij na ploščah bakterijske kulture z nadzorovanjem proizvodnje pigmentov.
	Barvno fotografijo so dosegli z združitvijo svetlobnih senzorjev, ki se odzivajo na različne valovne dolžine. Rdeči in zeleni senzorji temeljijo na fitokromih s fikocianobilinom (PCB). Rdeča svetloba je zaznana s Cph8, ki jo vklopi infrardeča (705 nm) svetloba in izključena z rdečo (650 nm) svetlobo. Ta senzor je bil prej uporabljen za ustvarjanje črno-belih bakterijskih fotografij (opisano zgoraj). Senzor zelene svetlobe temelji na Synechocystis CcaSR, ki se vklopi z zeleno (535 nm) svetlobo in izklopi pri daljno rdeči (672 nm) svetlobi. Senzor modre svetlobe uporablja himerno histidin kinazo (YF1), ki vsebuje flavin mononukleotid (FMN). Izklopi se s svetlobo pri 470 nm in je vklopljen v njeni odsotnosti. Šlo pa je za sistem kjer pride do izražanja encimov, ki so ustvarjajo barvne pigmente na ploščici. Rdeče, zelene in modre barve so proizvedli z izražanjem glukuronidaze (GusA), β-galaktozidaze (LacZ) in monooksigenaze (bFMO) in dodatkom IPTG ter Rose-gluc, X-Gal, ali triptofana (Trp) [5] .		Barvno fotografijo so dosegli z združitvijo svetlobnih senzorjev, ki se odzivajo na različne valovne dolžine. Rdeči in zeleni senzorji temeljijo na fitokromih s fikocianobilinom (PCB). Rdeča svetloba je zaznana s Cph8, ki jo vklopi infrardeča (705 nm) svetloba in izključena z rdečo (650 nm) svetlobo. Ta senzor je bil prej uporabljen za ustvarjanje črno-belih bakterijskih fotografij (opisano zgoraj). Senzor zelene svetlobe temelji na Synechocystis CcaSR, ki se vklopi z zeleno (535 nm) svetlobo in izklopi pri daljno rdeči (672 nm) svetlobi. Senzor modre svetlobe uporablja himerno histidin kinazo (YF1), ki vsebuje flavin mononukleotid (FMN). Izklopi se s svetlobo pri 470 nm in je vklopljen v njeni odsotnosti. Šlo pa je za sistem kjer pride do izražanja encimov, ki so ustvarjajo barvne pigmente na ploščici. Rdeče, zelene in modre barve so proizvedli z izražanjem glukuronidaze (GusA), β-galaktozidaze (LacZ) in monooksigenaze (bFMO) in dodatkom IPTG ter Rose-gluc, X-Gal, ali triptofana (Trp) [5] .
	Več podrobnosti najdete v publikaciji na spletni strani revije Nature~~. [5~~ https://www.nature.com/articles/nchembio.2390]		Več podrobnosti najdete v publikaciji na spletni strani revije Nature: https://www.nature.com/articles/nchembio.2390

	== Zaključek ==		== Zaključek ==