Metoda TASER za detekijo nukleinskih kislin - Revision history

Srna Anastasovska: /* Delovanje molekulskega pretvornika */

2024-05-27T22:08:10Z

Delovanje molekulskega pretvornika

← Older revision		Revision as of 22:08, 27 May 2024
Line 22:		Line 22:
	==Delovanje molekulskega pretvornika==		==Delovanje molekulskega pretvornika==

	Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina dvoverižnega promotorja, da lahko ~~translacija~~ poteče. In vitro poskus je pokazal, da ~~translacija~~ ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu komplementarni. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom ''E.coli'' S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za ~~translacijo~~. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi metode TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz ''E.coli'' S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].		Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina dvoverižnega promotorja, da lahko trankripcija poteče. In vitro poskus je pokazal, da transkripcija ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu komplementarni. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom ''E.coli'' S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za transkripcijo. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi metode TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz ''E.coli'' S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].

	==Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč==		==Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč==

Srna Anastasovska: /* Izboljšanje sDNA */

2024-05-27T21:52:21Z

Izboljšanje sDNA

← Older revision		Revision as of 21:52, 27 May 2024
Line 18:		Line 18:
	==Izboljšanje sDNA==		==Izboljšanje sDNA==

	Pripravili so nekoliko začetnih oligonukleotidov različne dolžine, ki se vežejo na enoverižni del sDNA. Cilj je bil testirati, koliko bo močna translacija. sDNA sama po sebi, brez vezave tarčne molekule, ni sposobna aktivirati translacije. Za ~~sintezo proteinov~~ s T7 RNA polimerazo je nujno potrebno, da je promotor dvoverižen. Njihovi poskusi so pokazali, da je bila sinteza sfGFP večja, ko je bil začetni oligonuleotid daljši. Rezultat je posledica večje stabilnosti dvoverižne DNA, ko je več baznih parov[6].		Pripravili so nekoliko začetnih oligonukleotidov različne dolžine, ki se vežejo na enoverižni del sDNA. Cilj je bil testirati, koliko bo močna translacija. sDNA sama po sebi, brez vezave tarčne molekule, ni sposobna aktivirati translacije. Za transkripcijo s T7 RNA polimerazo je nujno potrebno, da je promotor dvoverižen. Njihovi poskusi so pokazali, da je bila sinteza sfGFP večja, ko je bil začetni oligonuleotid daljši. Rezultat je posledica večje stabilnosti dvoverižne DNA, ko je več baznih parov[6].

	==Delovanje molekulskega pretvornika==		==Delovanje molekulskega pretvornika==

Srna Anastasovska at 18:41, 27 May 2024

2024-05-27T18:41:53Z

← Older revision		Revision as of 18:41, 27 May 2024
Line 8:		Line 8:
	==Priprava sDNA==		==Priprava sDNA==
	Da bi prišlo do sinteze nekega reporteskega encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so bili bogati z uracilom. Po pomnoževanju so uporabili USER encim, s katerim so odstranili uracile in izpostavili enoverižni del sDNA, kjer se nahajata zapisa za TBS in T7 promotor[1].		Da bi prišlo do sinteze nekega reporteskega encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so bili bogati z uracilom. Po pomnoževanju so uporabili USER encim, s katerim so odstranili uracile in izpostavili enoverižni del sDNA, kjer se nahajata zapisa za TBS in T7 promotor[1].
	Potek reakcije TASER
			==Potek reakcije TASER==
	V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL ''E. coli'' tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL ''E. coli'' DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].		V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL ''E. coli'' tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL ''E. coli'' DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].

Srna Anastasovska at 18:40, 27 May 2024

2024-05-27T18:40:43Z

← Older revision		Revision as of 18:40, 27 May 2024
Line 7:		Line 7:

	==Priprava sDNA==		==Priprava sDNA==
	Da bi prišlo do sinteze nekega ~~reporterskega~~ encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za ~~reporterski~~ protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so ~~vsebovali zapis~~ za TBS in T7 promotor[1].		Da bi prišlo do sinteze nekega reporteskega encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so bili bogati z uracilom. Po pomnoževanju so uporabili USER encim, s katerim so odstranili uracile in izpostavili enoverižni del sDNA, kjer se nahajata zapisa za TBS in T7 promotor[1].
	Potek reakcije TASER		Potek reakcije TASER
	V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL ''E. coli'' tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL ''E. coli'' DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].		V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL ''E. coli'' tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL ''E. coli'' DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].

Srna Anastasovska: /* Delovanje molekulskega pretvornika */

2024-05-27T01:59:23Z

Delovanje molekulskega pretvornika

← Older revision		Revision as of 01:59, 27 May 2024
Line 21:		Line 21:
	==Delovanje molekulskega pretvornika==		==Delovanje molekulskega pretvornika==

	Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina ~~dvoverinega~~ promotorja, da lahko translacija poteče. In vitro poskus je pokazal, da translacija ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu komplementarni. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom ''E.coli'' S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za translacijo. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi metode TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz ''E.coli'' S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].		Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina dvoverižnega promotorja, da lahko translacija poteče. In vitro poskus je pokazal, da translacija ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu komplementarni. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom ''E.coli'' S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za translacijo. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi metode TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz ''E.coli'' S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].

	==Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč==		==Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč==

Srna Anastasovska at 01:58, 27 May 2024

2024-05-27T01:58:51Z

← Older revision		Revision as of 01:58, 27 May 2024
Line 1:		Line 1:
	METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN		METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN

	Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP (''ang .''loop-mediated isothermal amplification), RPA (''ang.'' recombinase polymerase amplificatons), HBA (''ang.''hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določene pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (''ang.'' Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].		Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP (''ang.''loop-mediated isothermal amplification), RPA (''ang.'' recombinase polymerase amplificatons), HBA (''ang.''hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določene pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (''ang.'' Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].

	==Postopek metode TASER==		==Postopek metode TASER==

Srna Anastasovska at 01:58, 27 May 2024

2024-05-27T01:58:34Z

← Older revision		Revision as of 01:58, 27 May 2024
Line 1:		Line 1:
	METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN		METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN

	Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP ( ''ang .'' loop-mediated isothermal amplification), RPA (''ang.'' recombinase polymerase amplificatons), HBA (''ang.''hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določene pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (''ang.'' Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].		Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP (''ang .''loop-mediated isothermal amplification), RPA (''ang.'' recombinase polymerase amplificatons), HBA (''ang.''hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določene pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (''ang.'' Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].

	==Postopek metode TASER==		==Postopek metode TASER==

Srna Anastasovska at 01:58, 27 May 2024

2024-05-27T01:58:12Z

← Older revision		Revision as of 01:58, 27 May 2024
Line 1:		Line 1:
	METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN		METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN

	Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP ( ang. loop-mediated isothermal amplification), RPA (ang. recombinase polymerase amplificatons), HBA (ang. hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določene pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (ang. Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].		Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP ( ''ang .'' loop-mediated isothermal amplification), RPA (''ang.'' recombinase polymerase amplificatons), HBA (''ang.''hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določene pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (''ang.'' Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].

	==Postopek metode TASER==		==Postopek metode TASER==
Line 9:		Line 9:
	Da bi prišlo do sinteze nekega reporterskega encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za reporterski protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so vsebovali zapis za TBS in T7 promotor[1].		Da bi prišlo do sinteze nekega reporterskega encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za reporterski protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so vsebovali zapis za TBS in T7 promotor[1].
	Potek reakcije TASER		Potek reakcije TASER
	V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL E. coli tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL E. coli DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].		V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL ''E. coli'' tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL ''E. coli'' DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].

	==Detekcija signala==		==Detekcija signala==
Line 21:		Line 21:
	==Delovanje molekulskega pretvornika==		==Delovanje molekulskega pretvornika==

	Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina dvoverinega promotorja, da lahko translacija poteče. In vitro poskus je pokazal, da translacija ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu ~~kmplementarni~~. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom E.coli S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za translacijo. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi ~~metod~~ TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz E.coli S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].		Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina dvoverinega promotorja, da lahko translacija poteče. In vitro poskus je pokazal, da translacija ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu komplementarni. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom ''E.coli'' S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za translacijo. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi metode TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz ''E.coli'' S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].

	==Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč==		==Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč==

Srna Anastasovska: /* Viri */

2024-05-27T01:37:55Z

Viri

← Older revision		Revision as of 01:37, 27 May 2024
Line 41:		Line 41:
	==Viri==		==Viri==
	[1] Y. J. Park, D. Song, D. Kim, TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter, Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 400, Part B (2024).		[1] Y. J. Park, D. Song, D. Kim, TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter, Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 400, Part B (2024).
	[2] J. Compton, Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350 (1991), pp. 91-92
			[2] J. Compton, Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350 (1991), pp. 91-92.

	[3] M.J. Broadhurst, T.J. Brooks, N.R. Pollock, Diagnosis of Ebola virus disease: past, present, and future, Clin. Microbiol. Rev. 29 (2016) 773–793.		[3] M.J. Broadhurst, T.J. Brooks, N.R. Pollock, Diagnosis of Ebola virus disease: past, present, and future, Clin. Microbiol. Rev. 29 (2016) 773–793.

	[4] N.K. Krishna, K.M. Cunnion, Role of molecular diagnostics in the management of infectious disease emergencies, Med. Clin. North Am. 96 (2012) 1067–1078.		[4] N.K. Krishna, K.M. Cunnion, Role of molecular diagnostics in the management of infectious disease emergencies, Med. Clin. North Am. 96 (2012) 1067–1078.
	[5] M. Merkx, B. Smith, M.C. Jewett, Engineering sensor proteins, ACS Sens., 4 (2019), pp. 3089-3091
	[6] A. Ujvári, C.T. Martin, Identification of a minimal binding element within the T7 RNA polymerase promoter J. Mol. Biol., 273 (1997), pp. 775-781		[5] M. Merkx, B. Smith, M.C. Jewett, Engineering sensor proteins, ACS Sens., 4 (2019), pp. 3089-3091.
	[7] V.I. Lyamichev, M.W. Kaiser, N.E. Lyamicheva, A.V. Vologodskii, J.G. Hall, W.P. Ma, et al., Experimental and theoretical analysis of the invasive signal amplification reaction Biochemistry, 39 (2000), pp. 9523-9532
			[6] A. Ujvári, C.T. Martin, Identification of a minimal binding element within the T7 RNA polymerase promoter J. Mol. Biol., 273 (1997), pp. 775-781.

			[7] V.I. Lyamichev, M.W. Kaiser, N.E. Lyamicheva, A.V. Vologodskii, J.G. Hall, W.P. Ma, et al., Experimental and theoretical analysis of the invasive signal amplification reaction Biochemistry, 39 (2000), pp. 9523-9532.

Srna Anastasovska at 01:36, 27 May 2024

2024-05-27T01:36:05Z

← Older revision		Revision as of 01:36, 27 May 2024
Line 1:		Line 1:
	METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN		METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN

	Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP ( ang. loop-mediated isothermal amplification), RPA (ang. recombinase polymerase amplificatons), HBA (ang. hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo ~~določne~~ pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (ang. Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].		Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP ( ang. loop-mediated isothermal amplification), RPA (ang. recombinase polymerase amplificatons), HBA (ang. hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določene pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (ang. Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].

	==Postopek metode TASER==		==Postopek metode TASER==