Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah - Revision history

Bor Kunstelj: /* Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo */

2025-05-05T18:46:09Z

Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo

← Older revision		Revision as of 18:46, 5 May 2025
Line 25:		Line 25:

	== Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==		== Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==
	Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavno domeno (RBD<sup>om</sup>) iz virusa SARS-CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBD<sup>om</sup> . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBD<sup>om</sup> so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C ~~namesto~~ pri ~~30°C~~ . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši.		Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavno domeno (RBD<sup>om</sup>) iz virusa SARS-CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBD<sup>om</sup> . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBD<sup>om</sup> so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C in 30°C, a so bili z izolacijo uspešni le pri kvasovkah gojenih pri 18°C, kar je v skladu s pričakovanji. V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši.
	Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBD<sup>om</sup> proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].		Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBD<sup>om</sup> proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].

Bor Kunstelj: /* Zaključek */

2025-05-05T18:43:22Z

Zaključek

← Older revision		Revision as of 18:43, 5 May 2025
Line 29:		Line 29:

	== Zaključek ==		== Zaključek ==
	V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev.		V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk ''Komagataella phaffii'' in ''Saccharomyces cerevisiae''. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. Avtorje je presenetilo, da je le 94-bp dolga promotorska sekvenca lahko delovala, kot močan sintetični inducibilni promotor, ki je po svoji moči presegel vse naravne kvasne promotorje.

	== Literatura ==		== Literatura ==

Bor Kunstelj: /* Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo */

2025-05-05T18:18:47Z

Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo

← Older revision		Revision as of 18:18, 5 May 2025
Line 25:		Line 25:

	== Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==		== Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==
	Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor ~~vezavni protein~~ RBD<sup>om</sup> iz virusa SARS-CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBD<sup>om</sup> . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBD<sup>om</sup> so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši.		Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavno domeno (RBD<sup>om</sup>) iz virusa SARS-CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBD<sup>om</sup> . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBD<sup>om</sup> so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši.
	Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBD<sup>om</sup> proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].		Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBD<sup>om</sup> proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].

Bor Kunstelj: /* Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo */

2025-05-05T18:17:50Z

Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo

← Older revision		Revision as of 18:17, 5 May 2025
Line 25:		Line 25:

	== Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==		== Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==
	Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavni protein RBD<sup>om</sup> iz virusa CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBD<sup>om</sup> . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBD<sup>om</sup> so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši.		Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavni protein RBD<sup>om</sup> iz virusa SARS-CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBD<sup>om</sup> . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBD<sup>om</sup> so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši.
	Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBD<sup>om</sup> proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].		Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBD<sup>om</sup> proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].

Bor Kunstelj: /* Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah */

2025-05-04T18:31:35Z

Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah

← Older revision		Revision as of 18:31, 4 May 2025
Line 8:		Line 8:

	== Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==		== Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==
	Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (''angl.'' enhanced green fluorescent protein). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot >100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (''angl.'' ~~transcriptional readthrough~~) [1].		Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu ''Komagataella phaffii'' (prej poznana kot ''Pichia pastoris''). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator ''phlO''. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem ''KpAOX1''. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (''angl. enhanced green fluorescent protein''). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot >100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (''angl. transcriptional readthrough'') [1].

	== Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==		== Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==

Bor Kunstelj: /* Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo */

2025-05-04T14:50:37Z

Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo

← Older revision		Revision as of 14:50, 4 May 2025
Line 25:		Line 25:

	== Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==		== Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo ==
	Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavni protein ~~RBDom~~ iz virusa CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali ~~RBDom~~ . Zaradi precejšnje nestabilnosti ~~RBDom~~ so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši.		Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavni protein RBD<sup>om</sup> iz virusa CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBD<sup>om</sup> . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBD<sup>om</sup> so raziskovalci gojili produkcijski sev ''K. phaffii'' pri 18°C namesto pri 30°C . V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši.
	Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden ~~RBDom~~ proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].		Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBD<sup>om</sup> proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].

	== Zaključek ==		== Zaključek ==

Bor Kunstelj: /* Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov */

2025-05-04T14:42:21Z

Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov

← Older revision		Revision as of 14:42, 4 May 2025
Line 11:		Line 11:

	== Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==		== Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov ==
	Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z ~~opsrednjim~~ promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel >100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator [1].		Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v ''Saccharomyces cerevisiae''. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z osrednjim promotorjem ''ScGAL1'' fuziran z operatorjem ''phlO'' je dosegel >100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator [1].

	== Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==		== Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==

Bor Kunstelj: /* Uvod */

2025-05-04T14:37:26Z

Uvod

← Older revision		Revision as of 14:37, 4 May 2025
Line 2:		Line 2:

	== Uvod ==		== Uvod ==
	Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi[1].		Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem ''S. cerevisiae'', že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi [1].

	== Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==		== Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah ==

Bor Kunstelj: /* Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja */

2025-05-04T14:37:12Z

Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja

← Older revision		Revision as of 14:37, 4 May 2025
Line 15:		Line 15:
	== Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==		== Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja ==
	Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za >2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za >3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono.		Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje ''phlO'', ''tetO2'' in ''luxO''. Dve ponovitvi operatorja ''phlO'' povečata ekspresijo GFP za >2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za >3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono.
	Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč.		Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah ''luxO'' ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del ''luxO'' zamenjali z ostalimi ''luxO'' variantami iz bakterije ''Aliivibrio fischeri''. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč [1].


	== Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==		== Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==

Bor Kunstelj: /* Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev */

2025-05-04T14:36:58Z

Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev

← Older revision		Revision as of 14:36, 4 May 2025
Line 20:		Line 20:
	== Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==		== Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev ==
	Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom.		Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest ''phlO'' ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom.
	Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja.		Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja [1].

	== Ekspresijski sistemi brez induktorja ==		== Ekspresijski sistemi brez induktorja ==