Negativna avtoregulacija pospeši odzivni čas transkripcijskih omrežij - Revision history

Tjaša Lapanja: /* Potek eksperimenta in rezultati */

2017-01-15T18:57:54Z

Potek eksperimenta in rezultati

← Older revision		Revision as of 18:57, 15 January 2017
Line 33:		Line 33:
	Eksperimentalni podatki se tako ob začetku merjenja dobro skladajo z matematičnim modelom, kasneje, okrog 0,5 celičnega cikla pa se začnejo od matematičnega modela oddaljevati, porast produkta postane še hitrejši, kot je bilo predvidevano, nato pa začne nihati. Avtorji domnevajo, da je za omenjeno opažanje kriva prisotnost aTc in dimerizacija represorja. V začetni stopnji so namreč vsi represorji inaktivirani z aTc, ko pa se aTc odtitrira iz sistema z vezavo na TetR, bi mogli novonastali prosti TetR zavreti transkripcijo. Pride pa lahko do disociacije dimerov in ponovnega povezovanja, pri čemer se lahko povežejo pari , kjer je en TetR vezan z aTc, drugi pa ne. Tak dimer je neaktiven kot represor, zato dobimo več neaktivnih represorjev in počasnejšo represijo, dokler se število represorjev dodatno ne poveča.		Eksperimentalni podatki se tako ob začetku merjenja dobro skladajo z matematičnim modelom, kasneje, okrog 0,5 celičnega cikla pa se začnejo od matematičnega modela oddaljevati, porast produkta postane še hitrejši, kot je bilo predvidevano, nato pa začne nihati. Avtorji domnevajo, da je za omenjeno opažanje kriva prisotnost aTc in dimerizacija represorja. V začetni stopnji so namreč vsi represorji inaktivirani z aTc, ko pa se aTc odtitrira iz sistema z vezavo na TetR, bi mogli novonastali prosti TetR zavreti transkripcijo. Pride pa lahko do disociacije dimerov in ponovnega povezovanja, pri čemer se lahko povežejo pari , kjer je en TetR vezan z aTc, drugi pa ne. Tak dimer je neaktiven kot represor, zato dobimo več neaktivnih represorjev in počasnejšo represijo, dokler se število represorjev dodatno ne poveča.

	Če pa aTc ni odstranjen iz sistema se ~~tet~~ represor popolnoma inaktivira in prekine zanko, sistem nato deluje kot enostavno, ne-avtoregulirano vezje z vzponskim časom enakim enemu celičnemu ciklu.		Če pa aTc ni odstranjen iz sistema se Tet represor popolnoma inaktivira in prekine zanko, sistem nato deluje kot enostavno, ne-avtoregulirano vezje z vzponskim časom enakim enemu celičnemu ciklu.

	==Diskusija in zaključki==		==Diskusija in zaključki==

Tjaša Lapanja: /* Potek eksperimenta in rezultati */

2017-01-15T18:57:22Z

Potek eksperimenta in rezultati

← Older revision		Revision as of 18:57, 15 January 2017
Line 30:		Line 30:
	Delovanje enostavne transkripcijske enote in negativno avtoreguliranega vezja je bilo preverjeno v fluorimetru z več vdolbinicami, ki omogoča avtomatizirano merjenje fluorescence in celične gostote v nekajminutnih intervalih. Celice so bile dodane v medij z anhidrotetraciklinom (aTc), ki inaktivira TetR in s tem omogoči sintezo GFP. Po kratki lag fazi so se celice začele obnašati zelo podobno računalniškem modelu preproste represirane transkripcijske enote, polovico stacionarne koncentracije GFP so dosegle v času enega celičnega cikla.		Delovanje enostavne transkripcijske enote in negativno avtoreguliranega vezja je bilo preverjeno v fluorimetru z več vdolbinicami, ki omogoča avtomatizirano merjenje fluorescence in celične gostote v nekajminutnih intervalih. Celice so bile dodane v medij z anhidrotetraciklinom (aTc), ki inaktivira TetR in s tem omogoči sintezo GFP. Po kratki lag fazi so se celice začele obnašati zelo podobno računalniškem modelu preproste represirane transkripcijske enote, polovico stacionarne koncentracije GFP so dosegle v času enega celičnega cikla.

	Za opazovanje regulacije z drugim, avtoreguliranim vezjem, so morali pred začetkom meritve odstraniti začetno koncentracijo aktivnega represorja, prisotnega v sistemu, kar so dosegli z dodatkom aTc, potem pa s titracijo odstraniti še presežni aTc. Ob dodatku v gojičče se anhidrotetraciklin z močno afiniteto (10<sup>12</sup> M<sup>-1</sup>) veže na TetR in ga inaktivira, kar omogoči začetek transkripcije z začetnega stanja nizke koncentracije aktivnega represorja. Ob dodatku aTc se začne povečevati količina TetR-GFP do točke , ko je ves aTc vezan na protein in s tem s odstranjen iz sistema. Od tega trenutka dalje je TetR-GFP prost, da zavre lastno izražanje, opazovati je možno kinetiko autoreguliranega sistema. Tako kot model tudi eksperimentalni rezultati kažejo, da je vzponski čas koncentracije GFP pri negativno avtoreguliranem vezju mnogo krajši kot pri enostavni negativno regulirani enoti, okrog 0,2 celičnega cikla.		Za opazovanje regulacije z drugim, avtoreguliranim vezjem, so morali pred začetkom meritve odstraniti začetno koncentracijo aktivnega represorja, prisotnega v sistemu, kar so dosegli z dodatkom aTc, potem pa s titracijo odstraniti še presežni aTc. Ob dodatku v gojičče se anhidrotetraciklin z močno afiniteto (10<sup>12</sup> M<sup>-1</sup>) veže na TetR in ga inaktivira, kar omogoči začetek transkripcije z začetnega stanja nizke koncentracije aktivnega represorja. Ob dodatku aTc se začne povečevati količina TetR-GFP do točke, ko je ves aTc vezan na protein in s tem s odstranjen iz sistema. Od tega trenutka dalje je TetR-GFP prost, da zavre lastno izražanje, opazovati je možno kinetiko autoreguliranega sistema. Tako kot model tudi eksperimentalni rezultati kažejo, da je vzponski čas koncentracije GFP pri negativno avtoreguliranem vezju mnogo krajši kot pri enostavni negativno regulirani enoti, okrog 0,2 celičnega cikla.
	Eksperimentalni podatki se tako ob začetku merjenja dobro skladajo z matematičnim modelom, kasneje, okrog 0,5 celičnega cikla pa se začnejo od matematičnega modela oddaljevati, porast produkta postane še hitrejši, kot je bilo predvidevano, nato pa začne nihati. Avtorji domnevajo, da je za omenjeno opažanje kriva prisotnost aTc in dimerizacija represorja. V začetni stopnji so namreč vsi represorji inaktivirani z aTc, ko pa se aTc odtitrira iz sistema z vezavo na TetR, bi mogli novonastali prosti TetR zavreti transkripcijo. Pride pa lahko do disociacije dimerov in ponovnega povezovanja, pri čemer se lahko povežejo pari , kjer je en TetR vezan z aTc, drugi pa ne. Tak dimer je neaktiven kot represor, zato dobimo več neaktivnih represorjev in počasnejšo represijo, dokler se število represorjev dodatno ne poveča.		Eksperimentalni podatki se tako ob začetku merjenja dobro skladajo z matematičnim modelom, kasneje, okrog 0,5 celičnega cikla pa se začnejo od matematičnega modela oddaljevati, porast produkta postane še hitrejši, kot je bilo predvidevano, nato pa začne nihati. Avtorji domnevajo, da je za omenjeno opažanje kriva prisotnost aTc in dimerizacija represorja. V začetni stopnji so namreč vsi represorji inaktivirani z aTc, ko pa se aTc odtitrira iz sistema z vezavo na TetR, bi mogli novonastali prosti TetR zavreti transkripcijo. Pride pa lahko do disociacije dimerov in ponovnega povezovanja, pri čemer se lahko povežejo pari , kjer je en TetR vezan z aTc, drugi pa ne. Tak dimer je neaktiven kot represor, zato dobimo več neaktivnih represorjev in počasnejšo represijo, dokler se število represorjev dodatno ne poveča.

	Če pa aTc ni odstranjen iz sistema se tet represor popolnoma inaktivira in prekine zanko, sistem nato deluje kot enostavno, ne-avtoregulirano vezje z vzponskim časom enakim enemu celičnemu ciklu.		Če pa aTc ni odstranjen iz sistema se tet represor popolnoma inaktivira in prekine zanko, sistem nato deluje kot enostavno, ne-avtoregulirano vezje z vzponskim časom enakim enemu celičnemu ciklu.

	==Diskusija in zaključki==		==Diskusija in zaključki==

Tjaša Lapanja at 18:55, 15 January 2017

2017-01-15T18:55:14Z

← Older revision		Revision as of 18:55, 15 January 2017
Line 1:		Line 1:
			[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12417193 Negative Autoregulation Speeds the Response Times of Transcription Networks]

	Genske regulatorne mreže predstavljajo pomemben dejavnik pri uravnavanja delovanja celice, zato je razumevanje njihove regulacije pomembno tako pri proučevanju delovanja različnih celičnih procesov, kot tudi pri uvajanju novih vezij z metodami sintezne biologije.		Genske regulatorne mreže predstavljajo pomemben dejavnik pri uravnavanja delovanja celice, zato je razumevanje njihove regulacije pomembno tako pri proučevanju delovanja različnih celičnih procesov, kot tudi pri uvajanju novih vezij z metodami sintezne biologije.

Line 22:		Line 24:
	Dve različni vezji, enostavno transkripcijsko vezje in negativno regulirano vezje, sta bili dizajnirani tako, da sta dosegli enako koncentracijo v stacionarnem stanju. Za dosego tega cilja so uporabili promotorja z različno maksimalno hitrostjo produkcije.		Dve različni vezji, enostavno transkripcijsko vezje in negativno regulirano vezje, sta bili dizajnirani tako, da sta dosegli enako koncentracijo v stacionarnem stanju. Za dosego tega cilja so uporabili promotorja z različno maksimalno hitrostjo produkcije.

	Prvo vezje sestavlja enostavno represirana transkripcijska enota. Uporabljena sta dva plazmida, na prvem je zapis za TetR represor, ki se konstitutivno izraža, na drugem pa GFP protein pod kontrolo tet promotorja, ki ga represira TetR. Ob dodatku anhidrotetraciklina (aTc), ki se veže na TetR in s tem prepreči vezavo na tet promotor, se aktivira izražanje GFP. Za analizo negativne regulacije so uporabili negativno regulirano vezje, ki sta ga predstavila Becskei in Serrano (Nature, 2000). Vključuje tetraciklinski represor (TetR), fuziran s proteinom GFP pod kontrolo lambda promotorja z dvema tetraciklinskima operatorjema. Delovanje vezij so preverjali v ''E.coli'' DH5α, ki izraža lacI.		Prvo vezje sestavlja enostavno represirana transkripcijska enota. Uporabljena sta dva plazmida, na prvem je zapis za TetR represor, ki se konstitutivno izraža, na drugem pa GFP protein pod kontrolo tet promotorja, ki ga represira TetR. Ob dodatku anhidrotetraciklina (aTc), ki se veže na TetR in s tem prepreči vezavo na tet promotor, se aktivira izražanje GFP. Za analizo negativne regulacije so uporabili negativno regulirano vezje, ki sta ga predstavila Becskei in Serrano <ref name="serrano">Serrano L, Becksei A. [http://www.nature.com/nature/journal/v405/n6786/full/405590a0.html Engineering stability in gene networks by autoregulation]. Nature 2000 (Vol. 405), 590-593.</ref>. Vključuje tetraciklinski represor (TetR), fuziran s proteinom GFP pod kontrolo lambda promotorja z dvema tetraciklinskima operatorjema. Delovanje vezij so preverjali v ''E.coli'' DH5α, ki izraža lacI.

	===Potek eksperimenta in rezultati===		===Potek eksperimenta in rezultati===

	Delovanje enostavne transkripcijske enote in negativno avtoreguliranega vezja je bilo preverjeno v fluorimetru z več vdolbinicami, ki omogoča avtomatizirano merjenje fluorescence in celične gostote v nekajminutnih intervalih. Celice so bile dodane v medij z anhidrotetraciklinom ( aTc), ki inaktivira TetR in s tem omogoči sintezo GFP. Po kratki lag fazi so se celice začele obnašati zelo podobno računalniškem modelu preproste represirane transkripcijske enote, polovico stacionarne koncentracije GFP so dosegle v času enega celičnega cikla.		Delovanje enostavne transkripcijske enote in negativno avtoreguliranega vezja je bilo preverjeno v fluorimetru z več vdolbinicami, ki omogoča avtomatizirano merjenje fluorescence in celične gostote v nekajminutnih intervalih. Celice so bile dodane v medij z anhidrotetraciklinom (aTc), ki inaktivira TetR in s tem omogoči sintezo GFP. Po kratki lag fazi so se celice začele obnašati zelo podobno računalniškem modelu preproste represirane transkripcijske enote, polovico stacionarne koncentracije GFP so dosegle v času enega celičnega cikla.

	Za opazovanje regulacije z drugim, avtoreguliranim vezjem, so morali pred začetkom meritve odstraniti začetno koncentracijo aktivnega represorja, prisotnega v sistemu, kar so dosegli z dodatkom aTc, potem pa s titracijo odstraniti še presežni aTc. Ob dodatku v gojičče se anhidrotetraciklin z močno afiniteto (10<sup>12</sup> M<sup>-1</sup>) veže na TetR in ga inaktivira, kar omogoči začetek transkripcije z začetnega stanja nizke koncentracije aktivnega represorja. Ob dodatku aTc se začne povečevati količina TetR-GFP do točke , ko je ves aTc vezan na protein in s tem s odstranjen iz sistema. Od tega trenutka dalje je TetR-GFP prost, da zavre lastno izražanje, opazovati je možno kinetiko autoreguliranega sistema. Tako kot model tudi eksperimentalni rezultati kažejo, da je vzponski čas koncentracije GFP pri negativno avtoreguliranem vezju mnogo krajši kot pri enostavni negativno regulirani enoti, okrog 0,2 celičnega cikla.		Za opazovanje regulacije z drugim, avtoreguliranim vezjem, so morali pred začetkom meritve odstraniti začetno koncentracijo aktivnega represorja, prisotnega v sistemu, kar so dosegli z dodatkom aTc, potem pa s titracijo odstraniti še presežni aTc. Ob dodatku v gojičče se anhidrotetraciklin z močno afiniteto (10<sup>12</sup> M<sup>-1</sup>) veže na TetR in ga inaktivira, kar omogoči začetek transkripcije z začetnega stanja nizke koncentracije aktivnega represorja. Ob dodatku aTc se začne povečevati količina TetR-GFP do točke , ko je ves aTc vezan na protein in s tem s odstranjen iz sistema. Od tega trenutka dalje je TetR-GFP prost, da zavre lastno izražanje, opazovati je možno kinetiko autoreguliranega sistema. Tako kot model tudi eksperimentalni rezultati kažejo, da je vzponski čas koncentracije GFP pri negativno avtoreguliranem vezju mnogo krajši kot pri enostavni negativno regulirani enoti, okrog 0,2 celičnega cikla.
Line 42:		Line 44:
	Alternativa negativni avtoregulacije je uvedba hitrejše razgradnje produkta, ki prav tako omogoča uporabo močnega promotorja za dosego nižjega stacionarnega stanja in s tem hitrega porasta koncentracije produkta ob začetku transkripcije. Slaba stran sistema je predvsem povečano metabolno breme, saj je potrebno produkt zaradi povečane razgradnje konstantno proizvajati. Vseeno se ta strategija uporablja za produkcijo transkripcijskih faktorjev, predvsem pri evkariontih.		Alternativa negativni avtoregulacije je uvedba hitrejše razgradnje produkta, ki prav tako omogoča uporabo močnega promotorja za dosego nižjega stacionarnega stanja in s tem hitrega porasta koncentracije produkta ob začetku transkripcije. Slaba stran sistema je predvsem povečano metabolno breme, saj je potrebno produkt zaradi povečane razgradnje konstantno proizvajati. Vseeno se ta strategija uporablja za produkcijo transkripcijskih faktorjev, predvsem pri evkariontih.

	Negativna avtoregulacija je prisotna pri mnogih celičnih mehanizmih, pomembnih za metabolizem in preživetje, kjer je ključna hitra odzivnost sistema. Primer so SOS DNA popravni mehanizmi ter geni za porabo arabinoze in drugi geni, ki se aktivirajo ob glukoznem stradanju. Njeno razumevanje izboljša poznavanje delovanja genskih regulatornih mrež, hkrati pa ima potencial za uporabo v sintezni biologiji.		Negativna avtoregulacija je prisotna pri mnogih celičnih mehanizmih, pomembnih za metabolizem in preživetje, kjer je ključna hitra odzivnost sistema. Primer so SOS DNA popravni mehanizmi ter geni za porabo arabinoze in drugi geni, ki se aktivirajo ob glukoznem stradanju. Njeno razumevanje izboljša poznavanje delovanja genskih regulatornih mrež, hkrati pa ima potencial za uporabo v sintezni biologiji.<ref name="rosenfeld">Rosenfeld N, Elowitz B. M., Alon U. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12417193 Negative Autoregulation Speeds the Response Times of Transcription Networks]. J. Mol. Biol (2002) 323, 785-793.</ref>

			==Viri==
			<references />

Tjaša Lapanja at 18:10, 15 January 2017

2017-01-15T18:10:07Z

← Older revision		Revision as of 18:10, 15 January 2017
Line 42:		Line 42:
	Alternativa negativni avtoregulacije je uvedba hitrejše razgradnje produkta, ki prav tako omogoča uporabo močnega promotorja za dosego nižjega stacionarnega stanja in s tem hitrega porasta koncentracije produkta ob začetku transkripcije. Slaba stran sistema je predvsem povečano metabolno breme, saj je potrebno produkt zaradi povečane razgradnje konstantno proizvajati. Vseeno se ta strategija uporablja za produkcijo transkripcijskih faktorjev, predvsem pri evkariontih.		Alternativa negativni avtoregulacije je uvedba hitrejše razgradnje produkta, ki prav tako omogoča uporabo močnega promotorja za dosego nižjega stacionarnega stanja in s tem hitrega porasta koncentracije produkta ob začetku transkripcije. Slaba stran sistema je predvsem povečano metabolno breme, saj je potrebno produkt zaradi povečane razgradnje konstantno proizvajati. Vseeno se ta strategija uporablja za produkcijo transkripcijskih faktorjev, predvsem pri evkariontih.

	Negativna avtoregulacija je prisotna pri mnogih celičnih mehanizmih, pomembnih za metabolizem in preživetje , kjer je ključna hitra odzivnost sistema. Primer so SOS DNA popravni mehanizmi ter geni za porabo arabinoze in drugi geni, ki se aktivirajo ob glukoznem stradanju. Njeno razumevanje izboljša poznavanje delovanja genskih regulatornih mrež, hkrati pa ima potencial za uporabo v sintezni biologiji.		Negativna avtoregulacija je prisotna pri mnogih celičnih mehanizmih, pomembnih za metabolizem in preživetje, kjer je ključna hitra odzivnost sistema. Primer so SOS DNA popravni mehanizmi ter geni za porabo arabinoze in drugi geni, ki se aktivirajo ob glukoznem stradanju. Njeno razumevanje izboljša poznavanje delovanja genskih regulatornih mrež, hkrati pa ima potencial za uporabo v sintezni biologiji.

Tjaša Lapanja at 18:09, 15 January 2017

2017-01-15T18:09:51Z

← Older revision		Revision as of 18:09, 15 January 2017
Line 1:		Line 1:
	Genske regulatorne mreže predstavljajo pomemben dejavnik pri uravnavanja delovanja celice, zato je razumevanje njihove regulacije pomembno tako pri proučevanju delovanja različnih celičnih procesov, kot tudi pri uvajanju novih vezij z metodami sintezne biologije.		Genske regulatorne mreže predstavljajo pomemben dejavnik pri uravnavanja delovanja celice, zato je razumevanje njihove regulacije pomembno tako pri proučevanju delovanja različnih celičnih procesov, kot tudi pri uvajanju novih vezij z metodami sintezne biologije.

	Pri proučevanju regulatornih mrež opazimo pogost motiv negativne avtoregulacije, kjer transkripcijski faktorji negativno regulirajo lastno transkripcijo. Omenjen sistem je, na primer, pri E.coli prisoten pri več kot 40% transkripcijskih faktorjev, pri čemer gre večinoma za globalne transkripcijske faktorje, ki sodelujejo pri odzivu na stres in regulaciji metabolizma.		Pri proučevanju regulatornih mrež opazimo pogost motiv negativne avtoregulacije, kjer transkripcijski faktorji negativno regulirajo lastno transkripcijo. Omenjen sistem je, na primer, pri ''E.coli'' prisoten pri več kot 40% transkripcijskih faktorjev, pri čemer gre večinoma za globalne transkripcijske faktorje, ki sodelujejo pri odzivu na stres in regulaciji metabolizma.

	Dokazali so, da negativna avtoregulacija zmanjša razlike v koncentraciji transkripcijskih faktorjev med celicami v stacionarni fazi, v članku pa avtorji predstavljajo nov pogled na pomen negativne avtoregulacije, vpliv na kinetiko transkripcije.		Dokazali so, da negativna avtoregulacija zmanjša razlike v koncentraciji transkripcijskih faktorjev med celicami v stacionarni fazi, v članku pa avtorji predstavljajo nov pogled na pomen negativne avtoregulacije, vpliv na kinetiko transkripcije.
Line 22:		Line 22:
	Dve različni vezji, enostavno transkripcijsko vezje in negativno regulirano vezje, sta bili dizajnirani tako, da sta dosegli enako koncentracijo v stacionarnem stanju. Za dosego tega cilja so uporabili promotorja z različno maksimalno hitrostjo produkcije.		Dve različni vezji, enostavno transkripcijsko vezje in negativno regulirano vezje, sta bili dizajnirani tako, da sta dosegli enako koncentracijo v stacionarnem stanju. Za dosego tega cilja so uporabili promotorja z različno maksimalno hitrostjo produkcije.

	Prvo vezje sestavlja enostavno represirana transkripcijska enota. Uporabljena sta dva plazmida, na prvem je zapis za TetR represor, ki se konstitutivno izraža, na drugem pa GFP protein pod kontrolo tet promotorja, ki ga represira TetR. Ob dodatku anhidrotetraciklina (aTc), ki se veže na TetR in s tem prepreči vezavo na tet promotor, se aktivira izražanje GFP. Za analizo negativne regulacije so uporabili negativno regulirano vezje, ki sta ga predstavila Becskei in Serrano (Nature, 2000). Vključuje tetraciklinski represor (TetR), fuziran s proteinom GFP pod kontrolo lambda promotorja z dvema tetraciklinskima operatorjema. Delovanje vezij so preverjali v ''e.coli'' DH5α, ki izraža lacI.		Prvo vezje sestavlja enostavno represirana transkripcijska enota. Uporabljena sta dva plazmida, na prvem je zapis za TetR represor, ki se konstitutivno izraža, na drugem pa GFP protein pod kontrolo tet promotorja, ki ga represira TetR. Ob dodatku anhidrotetraciklina (aTc), ki se veže na TetR in s tem prepreči vezavo na tet promotor, se aktivira izražanje GFP. Za analizo negativne regulacije so uporabili negativno regulirano vezje, ki sta ga predstavila Becskei in Serrano (Nature, 2000). Vključuje tetraciklinski represor (TetR), fuziran s proteinom GFP pod kontrolo lambda promotorja z dvema tetraciklinskima operatorjema. Delovanje vezij so preverjali v ''E.coli'' DH5α, ki izraža lacI.

	===Potek eksperimenta in rezultati===		===Potek eksperimenta in rezultati===

Tjaša Lapanja at 18:08, 15 January 2017

2017-01-15T18:08:34Z

← Older revision		Revision as of 18:08, 15 January 2017
Line 1:		Line 1:
			Genske regulatorne mreže predstavljajo pomemben dejavnik pri uravnavanja delovanja celice, zato je razumevanje njihove regulacije pomembno tako pri proučevanju delovanja različnih celičnih procesov, kot tudi pri uvajanju novih vezij z metodami sintezne biologije.

			Pri proučevanju regulatornih mrež opazimo pogost motiv negativne avtoregulacije, kjer transkripcijski faktorji negativno regulirajo lastno transkripcijo. Omenjen sistem je, na primer, pri E.coli prisoten pri več kot 40% transkripcijskih faktorjev, pri čemer gre večinoma za globalne transkripcijske faktorje, ki sodelujejo pri odzivu na stres in regulaciji metabolizma.

			Dokazali so, da negativna avtoregulacija zmanjša razlike v koncentraciji transkripcijskih faktorjev med celicami v stacionarni fazi, v članku pa avtorji predstavljajo nov pogled na pomen negativne avtoregulacije, vpliv na kinetiko transkripcije.

	==Modeliranje==		==Modeliranje==

Tjaša Lapanja: New page: ==Modeliranje== Za analizo vpliva avtoregulacije na kinetiko transkripcije so izvedli primerjavo dveh transkripcijskih vezij, preprostega vezja, ki se aktivira ob sprostitvi represorja z...

2017-01-15T18:07:35Z

New page: ==Modeliranje== Za analizo vpliva avtoregulacije na kinetiko transkripcije so izvedli primerjavo dveh transkripcijskih vezij, preprostega vezja, ki se aktivira ob sprostitvi represorja z...

New page

==Modeliranje==

Za analizo vpliva avtoregulacije na kinetiko transkripcije so izvedli primerjavo dveh transkripcijskih vezij, preprostega vezja, ki se aktivira ob sprostitvi represorja z DNA, in negativno avtoreguliranega vezja, katerega produkt zavira lastno izražanje. Vezji sta dizajnirani tako, da dosežeta enako stacionarno stanje.

V obeh modelih so koncentracijo proteina določali z razliko med produkcijo in redčenjem koncentracije proteina, ker pa so v modelu uporabili dolgožive proteine so predpostavili, da se koncentracija zmanjšuje le zaradi rasti celice in celičnih delitev, vpliv razgradnje pa so zanemarili. Kot merilo odzivnosti sistema je bil uporabljen vzponski čas, čas potreben, da se koncentracija proteina povzpne na polovico maksimalne koncentracije ob polno induciranem promotorju.
Za enostavno transkripcijsko enoto, ki od aktivacije naprej stalno proizvaja maksimalno količino transkripta, ob opisanih predpostavkah velja, da se razlika med koncentracijo proteina v celici in maksimalno koncentracijo proteina ob vsaki celični delitvi zmanjša za polovico. Vzponski čas enostavne transkripcijske enote je torej enak enemu celičnemu ciklu.

Pri negativno avtoreguliranem genskem vezju je produkcija proteina odvisna od koncentracije produkta. Avtorji so predpostavili, da aktivnost promotorja deluje po principu, ki sovpada z Michaelis-Mentenovo kinetiko. Produkcija proteina je odvisna od treh parametrov, produkcije ob polni aktivnosti, koncentracije produkta v celici in konstante disociacije represorja z lastnega promotorja. Ob uporabi močnega avtorepresorja se lahko konstanto disociacije zanemari. Ob analizi tako poenostavljene enačbe so ugotovili, da je vzponski čas koncentracije produkta negativno avtoregulirane transkripcijske enote 0,21 podvojitvenega časa . Vzponski čas lahko dodatno zmanjša kooperativnost med večimi represorji, analize so pokazale, da lahko ob kooperativnosti štirih represorjev vzponski čas zmanjšamo na 0,01 podvojitvenega časa.

Na delovanje represiranega sistema lahko vpliva tudi nekaj minutni zamik, ki nastane med iniciacijo transkripcije in oblikovanjem aktivnega represorja zaradi časa potrebnega za sintezo mRNA, translacijo, zvijanje proteina in nastanek kompleksov. Raziskovalci so z modelom pokazali, da ima ta zamik pomembno vlogo pri odzivnosti sistema. Večji kot je zamik med iniciacijo produkcije in nastankom aktivnega represorja, manjši je vzponski čas. Sistem ima tudi slabost, ki pa se pokaže predvsem v primeru, ko je promotor tako močan, da v času zamika že proizvede količino mRNA, primerljivo s koncentracijo v stacionarnem stanju, saj je v tem primeru v času, ko postanejo prvi represorji aktivni v procesu sinteze že velika količina novih represorjev, katerih nastanka ne moremo več zaustaviti. Tako dobimo velik presežek represorjev, kar je nezaželeno zaradi povečane cene produkcije, metabolnega bremena in možnih toksičnih vplivov presežne koncentracije represorja. Hkrati se velike koncentracije represorja le počasi redčijo iz sistema, ko ga izklopimo,kar poslabša odzivnost sistema.

==Eksperimentalna primerjava sistemov==

===Biološki sistemi in vezja===

Dve različni vezji, enostavno transkripcijsko vezje in negativno regulirano vezje, sta bili dizajnirani tako, da sta dosegli enako koncentracijo v stacionarnem stanju. Za dosego tega cilja so uporabili promotorja z različno maksimalno hitrostjo produkcije.

Prvo vezje sestavlja enostavno represirana transkripcijska enota. Uporabljena sta dva plazmida, na prvem je zapis za TetR represor, ki se konstitutivno izraža, na drugem pa GFP protein pod kontrolo tet promotorja, ki ga represira TetR. Ob dodatku anhidrotetraciklina (aTc), ki se veže na TetR in s tem prepreči vezavo na tet promotor, se aktivira izražanje GFP. Za analizo negativne regulacije so uporabili negativno regulirano vezje, ki sta ga predstavila Becskei in Serrano (Nature, 2000). Vključuje tetraciklinski represor (TetR), fuziran s proteinom GFP pod kontrolo lambda promotorja z dvema tetraciklinskima operatorjema. Delovanje vezij so preverjali v ''e.coli'' DH5α, ki izraža lacI.

===Potek eksperimenta in rezultati===

Delovanje enostavne transkripcijske enote in negativno avtoreguliranega vezja je bilo preverjeno v fluorimetru z več vdolbinicami, ki omogoča avtomatizirano merjenje fluorescence in celične gostote v nekajminutnih intervalih. Celice so bile dodane v medij z anhidrotetraciklinom ( aTc), ki inaktivira TetR in s tem omogoči sintezo GFP. Po kratki lag fazi so se celice začele obnašati zelo podobno računalniškem modelu preproste represirane transkripcijske enote, polovico stacionarne koncentracije GFP so dosegle v času enega celičnega cikla.

Za opazovanje regulacije z drugim, avtoreguliranim vezjem, so morali pred začetkom meritve odstraniti začetno koncentracijo aktivnega represorja, prisotnega v sistemu, kar so dosegli z dodatkom aTc, potem pa s titracijo odstraniti še presežni aTc. Ob dodatku v gojičče se anhidrotetraciklin z močno afiniteto (10<sup>12</sup> M<sup>-1</sup>) veže na TetR in ga inaktivira, kar omogoči začetek transkripcije z začetnega stanja nizke koncentracije aktivnega represorja. Ob dodatku aTc se začne povečevati količina TetR-GFP do točke , ko je ves aTc vezan na protein in s tem s odstranjen iz sistema. Od tega trenutka dalje je TetR-GFP prost, da zavre lastno izražanje, opazovati je možno kinetiko autoreguliranega sistema. Tako kot model tudi eksperimentalni rezultati kažejo, da je vzponski čas koncentracije GFP pri negativno avtoreguliranem vezju mnogo krajši kot pri enostavni negativno regulirani enoti, okrog 0,2 celičnega cikla.
Eksperimentalni podatki se tako ob začetku merjenja dobro skladajo z matematičnim modelom, kasneje, okrog 0,5 celičnega cikla pa se začnejo od matematičnega modela oddaljevati, porast produkta postane še hitrejši, kot je bilo predvidevano, nato pa začne nihati. Avtorji domnevajo, da je za omenjeno opažanje kriva prisotnost aTc in dimerizacija represorja. V začetni stopnji so namreč vsi represorji inaktivirani z aTc, ko pa se aTc odtitrira iz sistema z vezavo na TetR, bi mogli novonastali prosti TetR zavreti transkripcijo. Pride pa lahko do disociacije dimerov in ponovnega povezovanja, pri čemer se lahko povežejo pari , kjer je en TetR vezan z aTc, drugi pa ne. Tak dimer je neaktiven kot represor, zato dobimo več neaktivnih represorjev in počasnejšo represijo, dokler se število represorjev dodatno ne poveča.

Če pa aTc ni odstranjen iz sistema se tet represor popolnoma inaktivira in prekine zanko, sistem nato deluje kot enostavno, ne-avtoregulirano vezje z vzponskim časom enakim enemu celičnemu ciklu.

==Diskusija in zaključki==

Primerjava dveh sistemov za uravnavanje izražanja genov je pokazala, da negativno reguliran sistem poveča hitrost odziva za približno petkrat. Za enostavne transkripcijske kaskade z dolgoživimi proteini je namreč znano, da se na dani stimuli odziva zelo počasi. Prvi produkti sicer nastanejo že v roku minut, polovica maksimalne koncentracije pa je dosežena šele v času enega celičnega cikla.

Za razliko od tega pa se koncentracija proteinov pod avtoreguliranim promotorjem dvigne zelo hitro, polovico maksimalne koncentracije dosežejo že po petini celičnega cikla. Sistema se razlikujeta predvsem v moči promotorja, avtoregulirani sistem uporablja mnogo močnejši promotor, ki je odgovoren za hiter porast mRNA in posledično proteinov v celici. Zaradi negativne avtoregulacije, ki ob prisotnosti produkta inhibira transkripcijo se le ta kmalu upočasni in doseže stacionarno stanje. Koncentracija produkta ob stacionarnem stanju je enaka stacionarni koncentraciji produkta, ki ga proizvaja preprosto negativno regulirano vezje ob prisotnosti šibkejšega promotorja.
Omenjeno preprosto vezje bi ob uporabi močnega promotorja, uporabljenega v avtoreguliranem vezju doseglo enako visoko koncentracijo še hitreje avtoregulirano vezje, a bi bila koncentracija v stacionarnem stanju v tem primeru mnogo višja. Previsoka koncentracija proteina pa je nezaželena, saj predstavlja nepotrebna produkcija proteina metabolno breme, hkrati pa lahko protein doseže koncentracijo, pri kateri postane toksičen. Prevelika koncentracija proteina predstavlja težavo tudi pri odzivnosti sistema, saj je potrebno dolgo časa, da se razredči oziroma razgradi.

Alternativa negativni avtoregulacije je uvedba hitrejše razgradnje produkta, ki prav tako omogoča uporabo močnega promotorja za dosego nižjega stacionarnega stanja in s tem hitrega porasta koncentracije produkta ob začetku transkripcije. Slaba stran sistema je predvsem povečano metabolno breme, saj je potrebno produkt zaradi povečane razgradnje konstantno proizvajati. Vseeno se ta strategija uporablja za produkcijo transkripcijskih faktorjev, predvsem pri evkariontih.

Negativna avtoregulacija je prisotna pri mnogih celičnih mehanizmih, pomembnih za metabolizem in preživetje , kjer je ključna hitra odzivnost sistema. Primer so SOS DNA popravni mehanizmi ter geni za porabo arabinoze in drugi geni, ki se aktivirajo ob glukoznem stradanju. Njeno razumevanje izboljša poznavanje delovanja genskih regulatornih mrež, hkrati pa ima potencial za uporabo v sintezni biologiji.