No problem - Revision history

Marija Srnko: /* Regulacijska naprava */

2017-11-27T07:37:19Z

Regulacijska naprava

← Older revision		Revision as of 07:37, 27 November 2017
Line 54:		Line 54:

	'''4. Pretvorba glutamata v glutamin'''		'''4. Pretvorba glutamata v glutamin'''
	Zadnja regulacijska stopnja je pretvorba glutamata v glutamin, ki jo vrši glutamin sintetaza. Sintetizirali so novo biokocko BB_K2275009. Ponovno so uporabili vektor pSB1C3 ter vanj s pomočjo restrikcijskih mest ''Hind''III in ''Pst''I vključili gen glnA (zapis za glutamin sintetazo) iz ''Pseudomonas putida''. V nasprotju z glutamat dehidrogenazo se je glutamin sintetaza po liziranju celic nahajala pretežno v supernatantu. Z kalorimetričnim testom za detekcijo glutamina so pokazali, da se ~~glnA lahko~~ uspešno izraža v ''E. coli'' MG1655 ter vrši pretvorbo glutamata v glutamin.		Zadnja regulacijska stopnja je pretvorba glutamata v glutamin, ki jo vrši glutamin sintetaza. Sintetizirali so novo biokocko BB_K2275009. Ponovno so uporabili vektor pSB1C3 ter vanj s pomočjo restrikcijskih mest ''Hind''III in ''Pst''I vključili gen glnA (zapis za glutamin sintetazo) iz ''Pseudomonas putida''. V nasprotju z glutamat dehidrogenazo se je glutamin sintetaza po liziranju celic nahajala pretežno v supernatantu. Z kalorimetričnim testom za detekcijo glutamina so pokazali, da se glutamin sintetaza uspešno izraža v ''E. coli'' MG1655 ter vrši pretvorbo glutamata v glutamin.

Marija Srnko: /* Regulacijska naprava */

2017-11-27T07:08:23Z

Regulacijska naprava

← Older revision		Revision as of 07:08, 27 November 2017
Line 39:		Line 39:

	'''1. Pretvorba nitrata v nitrit'''		'''1. Pretvorba nitrata v nitrit'''
	Pretvorba zahteva prisotnost minimalno štirih encimov v štiri stopenjski reakciji. V prvi stopnji nitratna reduktaza (NaR) pretvori nitrat v nitrit. Skupina genov, ki zapisujejo za NaR je naravno prisotna v divjem tipu ''E.coli'' MG1655. Celice so gojili v gojiščih z različnimi koncentracijami nitrata ter spremljali upad koncentracije v določenem časovnem obdobju. Z ~~Greissovo reakcijo~~ so določili, da je odstotek pretvorbe nitrata v nitrit v območju 18-30 %.		Pretvorba zahteva prisotnost minimalno štirih encimov v štiri stopenjski reakciji. V prvi stopnji nitratna reduktaza (NaR) pretvori nitrat v nitrit. Skupina genov, ki zapisujejo za NaR je naravno prisotna v divjem tipu ''E.coli'' MG1655. Celice so gojili v gojiščih z različnimi koncentracijami nitrata ter spremljali upad koncentracije v določenem časovnem obdobju. Z Greissovim testom so določili, da je odstotek pretvorbe nitrata v nitrit v območju 18-30 %.


Line 62:		Line 62:


	Tekom projekta so uporabli naslednje biološke [http://2017.igem.org/Team:NCKU_Tainan/Parts dele].		Tekom projekta so uporabli naslednje biološke [http://2017.igem.org/Team:NCKU_Tainan/Parts dele].



	== ''' Literatura ''' ==		== ''' Literatura ''' ==

Marija Srnko: /* Določitev koncentracije nitrata */

2017-11-27T07:07:25Z

Določitev koncentracije nitrata

← Older revision		Revision as of 07:07, 27 November 2017
Line 25:		Line 25:
	== '''Določitev koncentracije nitrata ''' ==		== '''Določitev koncentracije nitrata ''' ==

	Za detekcijo nitrata so uporabili biokocko ~~K381001~~ (BCCS-Bristol, 2010). Biokocka je nitratni reporter s promotorjem yeaR, močnim RBS ter GFP reporterskim genom. Aktivnost promotorja regulirata dva proteina, ki sta naravno prisotna v E.Coli, in sicer NsrR in NarL. Vezan protein NsrR ovira vezavo RNA polimeraze. Vezava nitrata oziroma dušikovega oksida pa povzroči njegovo sprostitev in DNA ter aktivacijo transkripcije. Aktivacijo promotorja sproža tudi fosforiliran NarL. Forsforilacija NarL proteina poteče ob prisotnosti nitrata oziroma dušikovega oksida. Lin in sodelavci so pokazali, da je aktivacija PyeaR odvisna od kombinacije aktivacije s fosforiliranim NarL in represije z NsrR proteinom [Lin, 2007].		Za detekcijo nitrata so uporabili biokocko BB_K381001 (BCCS-Bristol, 2010). Biokocka je nitratni reporter s promotorjem yeaR, močnim RBS ter GFP reporterskim genom. Aktivnost promotorja regulirata dva proteina, ki sta naravno prisotna v E.Coli, in sicer NsrR in NarL. Vezan protein NsrR ovira vezavo RNA polimeraze. Vezava nitrata oziroma dušikovega oksida pa povzroči njegovo sprostitev in DNA ter aktivacijo transkripcije. Aktivacijo promotorja sproža tudi fosforiliran NarL. Forsforilacija NarL proteina poteče ob prisotnosti nitrata oziroma dušikovega oksida. Lin in sodelavci so pokazali, da je aktivacija PyeaR odvisna od kombinacije aktivacije s fosforiliranim NarL in represije z NsrR proteinom [Lin, 2007].

Marija Srnko: /* Detekcija nitrata */

2017-11-27T06:38:02Z

Detekcija nitrata

← Older revision		Revision as of 06:38, 27 November 2017
Line 23:		Line 23:
	Po sprejetju signala (ga sproži uporabnik preko mobilne aplikacije oziroma se aktivira sama ob zaznani povišani koncentraciji nitrata), ki prične regulacijska škatla delovat po naslednjem mehanizmu. Črpalke prečrpajo vodo v regulacijsko škatlo. V regulacijski škatli pretočni sistem s filtri omogoči fizično očiščenje vode (filtracija). Čista voda se nato zbere v koritih, kjer poteče ob pomoči bakterijskih celic pretvorba nitrata v glutamin. Analiza očiščene vode je pokazala, da se odstrani do 98 & nitrata.		Po sprejetju signala (ga sproži uporabnik preko mobilne aplikacije oziroma se aktivira sama ob zaznani povišani koncentraciji nitrata), ki prične regulacijska škatla delovat po naslednjem mehanizmu. Črpalke prečrpajo vodo v regulacijsko škatlo. V regulacijski škatli pretočni sistem s filtri omogoči fizično očiščenje vode (filtracija). Čista voda se nato zbere v koritih, kjer poteče ob pomoči bakterijskih celic pretvorba nitrata v glutamin. Analiza očiščene vode je pokazala, da se odstrani do 98 & nitrata.

	== '''~~Detekcija~~ nitrata''' ==		== '''Določitev koncentracije nitrata ''' ==

	Za detekcijo nitrata so uporabili biokocko K381001 (BCCS-Bristol, 2010). Biokocka je nitratni reporter s promotorjem yeaR, močnim RBS ter GFP reporterskim genom. Aktivnost promotorja regulirata dva proteina, ki sta naravno prisotna v E.Coli, in sicer NsrR in NarL. Vezan protein NsrR ovira vezavo RNA polimeraze. Vezava nitrata oziroma dušikovega oksida pa povzroči njegovo sprostitev in DNA ter aktivacijo transkripcije. Aktivacijo promotorja sproža tudi fosforiliran NarL. Forsforilacija NarL proteina poteče ob prisotnosti nitrata oziroma dušikovega oksida. Lin in sodelavci so pokazali, da je aktivacija PyeaR odvisna od kombinacije aktivacije s fosforiliranim NarL in represije z NsrR proteinom [Lin, 2007].		Za detekcijo nitrata so uporabili biokocko K381001 (BCCS-Bristol, 2010). Biokocka je nitratni reporter s promotorjem yeaR, močnim RBS ter GFP reporterskim genom. Aktivnost promotorja regulirata dva proteina, ki sta naravno prisotna v E.Coli, in sicer NsrR in NarL. Vezan protein NsrR ovira vezavo RNA polimeraze. Vezava nitrata oziroma dušikovega oksida pa povzroči njegovo sprostitev in DNA ter aktivacijo transkripcije. Aktivacijo promotorja sproža tudi fosforiliran NarL. Forsforilacija NarL proteina poteče ob prisotnosti nitrata oziroma dušikovega oksida. Lin in sodelavci so pokazali, da je aktivacija PyeaR odvisna od kombinacije aktivacije s fosforiliranim NarL in represije z NsrR proteinom [Lin, 2007].
Line 29:		Line 29:


	V teoriji biokocka BB_K381001 v odsotnosti nitrata ne bi smela fluorescirat, a so poskusi pokazali, da prihaja v manjši meri do emitiranje fluorescence tudi v odsotnosti aktivacijskega signala. Da bi zmanjšali šum ter izboljšali občutljivost detekcije nitrata so biokocki BB_K381001 dodali vezavno mesto za NsrR. S tem so želeli povečali represijo transkripcije v odsotnosti nitrata. Dodatno vezavno mesto so v prvem primeru vnesli pred in v drugem primeru za RBS. Oba konstrukta sta v odsotnosti nitrata emitirala fluorescenco nižje intenzitete, v primerjavi z biokocko K381001. Boljši med omenjenima, pa je bil konstrukt z dodanim zaporedjem za RBS. Uspešnost spremenjene biokocke za zaznavo nitrata so preverili, tako da so liofiliziranim celicam E. coli dodali gojišča z različnimi koncentracijami nitrata ter merili intenziteto emitirane svetlobe. S poskusom so pokazali, da je z novo biokocko moč zaznati tudi koncentracije manjše od 10 nM. Slednji podatek je ključen predvsem iz stališča, da so maksimalne koncentracije nitrata v ribogojnih vodah v 1 mM območju.		V teoriji biokocka BB_K381001 v odsotnosti nitrata ne bi smela fluorescirat, a so poskusi pokazali, da prihaja v manjši meri do emitiranje fluorescence tudi v odsotnosti aktivacijskega signala. Da bi zmanjšali šum ter izboljšali občutljivost detekcije nitrata so biokocki BB_K381001 dodali vezavno mesto za NsrR. S tem so želeli povečali represijo transkripcije v odsotnosti nitrata. Dodatno vezavno mesto so v prvem primeru vnesli pred in v drugem primeru za RBS. Oba konstrukta sta v odsotnosti nitrata emitirala fluorescenco nižje intenzitete, v primerjavi z biokocko K381001. Boljši med omenjenima, pa je bil konstrukt z dodanim zaporedjem za RBS. Uspešnost spremenjene biokocke za zaznavo nitrata so preverili, tako da so liofiliziranim celicam E. coli dodali gojišča z različnimi koncentracijami nitrata ter merili intenziteto emitirane svetlobe. S poskusom so pokazali, da je z novo biokocko moč zaznati tudi koncentracije manjše od 10 nM. Slednji podatek je ključen predvsem iz stališča, da so maksimalne koncentracije nitrata v ribogojnih vodah v 1 mM območju.



	== '''Regulacijska naprava''' ==		== '''Regulacijska naprava''' ==

Marija Srnko: /* NO problem */

2017-11-27T06:37:45Z

NO problem

← Older revision		Revision as of 06:37, 27 November 2017
Line 3:		Line 3:
	== NO problem ==		== NO problem ==

	Povzeto po projektu ~~IGEM~~ skupine [http://2017.igem.org/Team:NCKU_Tainan/Description NCKU Tainan, 2017]		Povzeto po projektu iGEM skupine [http://2017.igem.org/Team:NCKU_Tainan/Description NCKU Tainan, 2017]

	(Marija Srnko)		(Marija Srnko)
Line 11:		Line 11:


	IGEM skupina NCKU Tainan, se je na ~~IGEM~~ tekmovanju 2017 lotila ekološkega problema, ki zadeva onesnaženost voda. Prekomerna koncentracija nitrata v vodi, namenjeni gojenju rib lahko povzroči zmanjšan prirastek oziroma v skrajnih primerih tudi smrt organizmov. Najpreprostejši in najcenejši ukrep za izogib težavam, je zamenjava umazane vode s podzemno vodo. Vodilo projekta ''NO problem'' je bila tako izgradnja oziroma sinteza biološkega sistema, ki bi bil sposoben zaznavati ter odstranjevati nitrat iz voda.		IGEM skupina NCKU Tainan, se je na iGEM tekmovanju 2017 lotila ekološkega problema, ki zadeva onesnaženost voda. Prekomerna koncentracija nitrata v vodi, namenjeni gojenju rib lahko povzroči zmanjšan prirastek oziroma v skrajnih primerih tudi smrt organizmov. Najpreprostejši in najcenejši ukrep za izogib težavam, je zamenjava umazane vode s podzemno vodo. Vodilo projekta ''NO problem'' je bila tako izgradnja oziroma sinteza biološkega sistema, ki bi bil sposoben zaznavati ter odstranjevati nitrat iz voda.

Marija Srnko: /* NO problem */

2017-11-27T05:53:13Z

NO problem

← Older revision		Revision as of 05:53, 27 November 2017
Line 11:		Line 11:


	IGEM ~~ekipa~~ NCKU Tainan, se je na IGEM tekmovanju 2017 lotila ekološkega problema, ki zadeva onesnaženost voda. Prekomerna koncentracija nitrata v vodi, namenjeni gojenju rib lahko povzroči zmanjšan prirastek oziroma v skrajnih primerih tudi smrt organizmov. Najpreprostejši in najcenejši ukrep za izogib težavam, je zamenjava umazane vode s podzemno vodo. Vodilo projekta ''NO problem'' je bila tako izgradnja oziroma sinteza biološkega sistema, ki bi bil sposoben zaznavati ter odstranjevati nitrat iz voda.		IGEM skupina NCKU Tainan, se je na IGEM tekmovanju 2017 lotila ekološkega problema, ki zadeva onesnaženost voda. Prekomerna koncentracija nitrata v vodi, namenjeni gojenju rib lahko povzroči zmanjšan prirastek oziroma v skrajnih primerih tudi smrt organizmov. Najpreprostejši in najcenejši ukrep za izogib težavam, je zamenjava umazane vode s podzemno vodo. Vodilo projekta ''NO problem'' je bila tako izgradnja oziroma sinteza biološkega sistema, ki bi bil sposoben zaznavati ter odstranjevati nitrat iz voda.


Line 21:		Line 21:

	Mobilna aplikacija omogoča grafično spremljanje temperature in pH vode ter koncentracijo nitrata. Prav tako omogoča usmerjanje čolna oziroma napotitev na specifično lokacijo ter reguliranje regulacijske škatle ter shranjevanje preteklih meritev.		Mobilna aplikacija omogoča grafično spremljanje temperature in pH vode ter koncentracijo nitrata. Prav tako omogoča usmerjanje čolna oziroma napotitev na specifično lokacijo ter reguliranje regulacijske škatle ter shranjevanje preteklih meritev.
	Po sprejetju signala (ga sproži uporabnik preko mobilne aplikacije oziroma se aktivira sama ob zaznani povišani koncentraciji nitrata), ki prične regulacijska škatla delovat po naslednjem mehanizmu. Črpalke prečrpajo vodo v regulacijsko škatlo. V regulacijski škatli pretočni sistem s filtri omogoči fizično očiščenje vode (filtracija). Čista voda se nato zbere v koritih, kjer poteče ob pomoči bakterijskih celic pretvorba nitrata v glutamin. Analiza očiščene vode je pokazala, da se odstrani do 98 & nitrata.		Po sprejetju signala (ga sproži uporabnik preko mobilne aplikacije oziroma se aktivira sama ob zaznani povišani koncentraciji nitrata), ki prične regulacijska škatla delovat po naslednjem mehanizmu. Črpalke prečrpajo vodo v regulacijsko škatlo. V regulacijski škatli pretočni sistem s filtri omogoči fizično očiščenje vode (filtracija). Čista voda se nato zbere v koritih, kjer poteče ob pomoči bakterijskih celic pretvorba nitrata v glutamin. Analiza očiščene vode je pokazala, da se odstrani do 98 & nitrata.






	== '''Detekcija nitrata''' ==		== '''Detekcija nitrata''' ==

Marija Srnko at 18:51, 26 November 2017

2017-11-26T18:51:30Z

← Older revision		Revision as of 18:51, 26 November 2017
Line 72:		Line 72:


	'''
	== Literatura =='''		== ''' Literatura ''' ==


	- Lin, H. Y., Bledsoe, P. J., & Stewart, V. (2007). "Activation of yeaR-yoaG operon transcription by the nitrate-responsive regulator NarL is independent of oxygen-responsive regulator Fnr in Escherichia coli K-12." Journal of bacteriology, 189(21), 7539-7548.		- Lin, H. Y., Bledsoe, P. J., & Stewart, V. (2007). "Activation of yeaR-yoaG operon transcription by the nitrate-responsive regulator NarL is independent of oxygen-responsive regulator Fnr in Escherichia coli K-12." Journal of bacteriology, 189(21), 7539-7548.

Marija Srnko at 18:50, 26 November 2017

2017-11-26T18:50:35Z

← Older revision		Revision as of 18:50, 26 November 2017
Line 1:		Line 1:


	== NO ~~PROBLEM~~ ==		== NO problem ==

	Povzeto po projektu IGEM skupine [http://2017.igem.org/Team:NCKU_Tainan/Description NCKU Tainan, 2017]		Povzeto po projektu IGEM skupine [http://2017.igem.org/Team:NCKU_Tainan/Description NCKU Tainan, 2017]

Marija Srnko at 18:50, 26 November 2017

2017-11-26T18:50:12Z

← Older revision		Revision as of 18:50, 26 November 2017
Line 1:		Line 1:


			== NO PROBLEM ==

	Povzeto po projektu IGEM skupine [http://2017.igem.org/Team:NCKU_Tainan/Description NCKU Tainan, 2017]		Povzeto po projektu IGEM skupine [http://2017.igem.org/Team:NCKU_Tainan/Description NCKU Tainan, 2017]
Line 70:		Line 72:


			'''
	== Literatura ==		== Literatura =='''

	- Lin, H. Y., Bledsoe, P. J., & Stewart, V. (2007). "Activation of yeaR-yoaG operon transcription by the nitrate-responsive regulator NarL is independent of oxygen-responsive regulator Fnr in Escherichia coli K-12." Journal of bacteriology, 189(21), 7539-7548.		- Lin, H. Y., Bledsoe, P. J., & Stewart, V. (2007). "Activation of yeaR-yoaG operon transcription by the nitrate-responsive regulator NarL is independent of oxygen-responsive regulator Fnr in Escherichia coli K-12." Journal of bacteriology, 189(21), 7539-7548.

Marija Srnko at 18:49, 26 November 2017

2017-11-26T18:49:17Z

← Older revision		Revision as of 18:49, 26 November 2017
Line 1:		Line 1:

	~~== NO Problem ==~~

	Povzeto po projektu IGEM skupine [http://2017.igem.org/Team:NCKU_Tainan/Description NCKU Tainan, 2017]		Povzeto po projektu IGEM skupine [http://2017.igem.org/Team:NCKU_Tainan/Description NCKU Tainan, 2017]