Odkritje kratke lasnične RNA (shRNA) - Revision history

AljaZottel: /* Zgodovina pred poskusi z uporabo shRNA */

2012-04-05T14:10:17Z

Zgodovina pred poskusi z uporabo shRNA

← Older revision		Revision as of 14:10, 5 April 2012
Line 5:		Line 5:


	Lin-4 in let-7 sta molekuli miRNA. Lin-4 so odkrili že davnega 1993. Ugotovili so, da je dolg okoli 20 nukleotidov in da nastane iz prekurzorske molekule, ki vsebuje lasnično zanko. Z različnimi poskusi so dokazali, da je lin-4 ključen za postembrionalni razvoj in da negativno regulira gene za določene proteine (gen lin-14 in lin-28). Mehanizem takrat še ni bil znan. Nekaj let kasneje so odkrili let-7 RNA, ki je približno iste velikosti kot lin-4 in prekurzor prav tako vsebuje lasnično zanko. Let-7 prav tako negativno regulira nekatere gene (lin-14...). Podobno kot lin-4, tudi let-7 sodeluje pri postembrionalnem razvoju (Lee et al. 1993, Pasquinelli et al. 2000, Relahart et al. 2000). Mehanizem je takrat prav tako bil neznan.		Lin-4 in let-7 sta molekuli miRNA v C elegans. Lin-4 so odkrili že davnega 1993. Ugotovili so, da je dolg okoli 20 nukleotidov in da nastane iz prekurzorske molekule, ki vsebuje lasnično zanko. Z različnimi poskusi so dokazali, da je lin-4 ključen za postembrionalni razvoj in da negativno regulira gene za določene proteine (gen lin-14 in lin-28). Mehanizem takrat še ni bil znan. Nekaj let kasneje so odkrili let-7 RNA, ki je približno iste velikosti kot lin-4 in prekurzor prav tako vsebuje lasnično zanko. Let-7 prav tako negativno regulira nekatere gene (lin-14...). Podobno kot lin-4, tudi let-7 sodeluje pri postembrionalnem razvoju (Lee et al. 1993, Pasquinelli et al. 2000, Relahart et al. 2000). Mehanizem je takrat prav tako bil neznan.

	Čez par let so odkrili RNAi, njen mehanizem preko delovanja proteinov Dicer in RISC, tarčnega ciljanja mRNA in pojasnili, da sta lin-4 in let-7 miRNA. Kmalu zatem so znanstveniki želeli z uporabo umetne RNA inducirati inhibicijo določenih genov. Sprva so to poskušali z dsRNA. Prvi eksperimenti so potekali na C. Elegans. (Grishok et al. 2001, Hutvanger et al. 2001, Ketting et al. 2001). Pri poskusu so v črve injecirali dsRNA in opazovali odgovor. Opazili so, da se dsRNA spremeni v siRNA dolg približno 22nt. Si RNA nato sproži uničenje mRNA. Ključni pri omenjenem poskusu sta bila lin-4 in let-7. Znanstveniki so sklepali, da je prekurzor lin-4 in let-7 analogen dsRNA in miRNA istih prekurzorejv analogen siRNA. Za to obstaja več dokazov. Na kratko, za oba precesa so potrebni isti proteini (DCER-1, alg 1 in 2, red-1). Kmalu so podoben poskus izvedli na sesalcih, a je bil zaradi antivirusnega poskusa negativen. Pri sesalcih se zaradi dsRNA, posledično interferona, aktivira protein kinaza PKR. PKR nato sproži protivirusni odgovor in vodi celico v apoptozo (Gil in Esteban 2000). Tudi če v somatskih celicah zavremo PKR odziv, dsRNA sproži nespecifični odziv genske represije (Abraham et al., 1999; Paddison et al. 2001). Znanstveniki so zato skušali najti drugo pot, ki bi temeljila na istem principu. Ena izmed teh je bila konstrukcija shRNA z značilno lasnično zanko. Ta naj bi mimificirala prekurzorje miRNA, ki tudi vsebujejo lasnično zanko. Sh RNA tako v celici sproži RNAi odgovor. Do prvih uporab shRNA pri znanstvenih poskusih je prišlo leta 2002. Paddison et al., Brummelkamp et al., Paul et al., Sui et al.,Yu et al., Zeng et al., so ločeno injicirali spremenjeno dsRNA, ki je spominjala na endogeno shRNA in ni sprožila antivirusnega odgovora.

			Čez par let so odkrili RNAi, njen mehanizem preko delovanja proteinov Dicer in RISC, tarčnega ciljanja mRNA in pojasnili, da sta lin-4 in let-7 miRNA. Kmalu zatem so znanstveniki želeli z uporabo umetne RNA inducirati inhibicijo določenih genov. Sprva so to poskušali z dsRNA. Prvi eksperimenti so potekali na C. Elegans. (Grishok et al. 2001, Hutvanger et al. 2001, Ketting et al. 2001). Pri poskusu so v gliste injecirali dsRNA in opazovali odgovor. Opazili so, da se dsRNA spremeni v siRNA dolg približno 22nt. Si RNA nato sproži uničenje mRNA. Ključni pri omenjenem poskusu sta bila lin-4 in let-7. Znanstveniki so sklepali, da je prekurzor lin-4 in let-7 analogen dsRNA in miRNA istih prekurzorejv analogen siRNA. Za to obstaja več dokazov. Na kratko, za oba precesa so potrebni isti proteini (DCER-1, alg 1 in 2, red-1). Kmalu so podoben poskus izvedli na sesalcih, a je bil zaradi antivirusnega poskusa negativen. Pri sesalcih se zaradi dsRNA, posledično interferona, aktivira protein kinaza PKR. PKR nato sproži protivirusni odgovor in vodi celico v apoptozo (Gil in Esteban 2000). Tudi če v somatskih celicah zavremo PKR odziv, dsRNA sproži nespecifični odziv genske represije (Abraham et al., 1999; Paddison et al. 2001). Znanstveniki so zato skušali najti drugo pot, ki bi temeljila na istem principu. Ena izmed teh je bila konstrukcija shRNA z značilno lasnično zanko. Ta naj bi mimificirala prekurzorje miRNA, ki tudi vsebujejo lasnično zanko. Sh RNA tako v celici sproži RNAi odgovor. Do prvih uporab shRNA pri znanstvenih poskusih je prišlo leta 2002. Paddison et al., Brummelkamp et al., Paul et al., Sui et al.,Yu et al., Zeng et al., so ločeno injicirali spremenjeno dsRNA, ki je spominjala na endogeno shRNA in ni sprožila antivirusnega odgovora.

	== Raziskave, ki so privedle do ustvarjanja trajnih celičnih linij sesalcev s pomočjo shRNA ==		== Raziskave, ki so privedle do ustvarjanja trajnih celičnih linij sesalcev s pomočjo shRNA ==

AnaDolinar: /* Bi-funkcionalna shRNA */

2012-04-04T20:16:45Z

Bi-funkcionalna shRNA

← Older revision		Revision as of 20:16, 4 April 2012
Line 47:		Line 47:
	Gre za najnovejšo tehnologijo, ki so jo opisali šele leta 2009 in je še vedno v razvoju. Bi-funkcionalna shRNA je sintetična majhna RNA, s pomočjo katere bi lahko manipulirali in vplivali na delovanje shRNA v celici. Razvili so jo, da bi z njeno pomočjo pospeši in povečali učinkovitost utišanja genov. Njena glavna prednost je ta, da je sestavljena iz dveh shRNA molekul, ki se lahko posamič vežeta ena na t.i. cepitveno-odvisen in druga na cepitveno-neodvisen RISC. Celotna bi-funkcionalna shRNA sestoji iz dveh stebličastih shRNA, ki se zaključita z lasnično zanko. V celico vstavijo ustrezen plazmidni vektor iz katerega se nato prepiše. Ena shRNA ima v celoti ujemajoči se verigi, deluje kot navadna shRNA in se na enak način pripne na cepitveno-odvisen del RISC-a. Druga ima na sredini dva neujemajoča se dela, locirana na 9.-12. bazni par, ki omogočata vezavo na cepitveno-neodvisen RICS. Ko se končna produkta obeh shRNA vežeta na mRNA, tako hkrati inducirata transkripcijo in poskrbita za degradacijo mRNA. S takšnim, dopolnjujočim se delovanjem, poteka utišanje genov hitreje in bistveno učinkovitejše.		Gre za najnovejšo tehnologijo, ki so jo opisali šele leta 2009 in je še vedno v razvoju. Bi-funkcionalna shRNA je sintetična majhna RNA, s pomočjo katere bi lahko manipulirali in vplivali na delovanje shRNA v celici. Razvili so jo, da bi z njeno pomočjo pospeši in povečali učinkovitost utišanja genov. Njena glavna prednost je ta, da je sestavljena iz dveh shRNA molekul, ki se lahko posamič vežeta ena na t.i. cepitveno-odvisen in druga na cepitveno-neodvisen RISC. Celotna bi-funkcionalna shRNA sestoji iz dveh stebličastih shRNA, ki se zaključita z lasnično zanko. V celico vstavijo ustrezen plazmidni vektor iz katerega se nato prepiše. Ena shRNA ima v celoti ujemajoči se verigi, deluje kot navadna shRNA in se na enak način pripne na cepitveno-odvisen del RISC-a. Druga ima na sredini dva neujemajoča se dela, locirana na 9.-12. bazni par, ki omogočata vezavo na cepitveno-neodvisen RICS. Ko se končna produkta obeh shRNA vežeta na mRNA, tako hkrati inducirata transkripcijo in poskrbita za degradacijo mRNA. S takšnim, dopolnjujočim se delovanjem, poteka utišanje genov hitreje in bistveno učinkovitejše.

	[[http://ars.sciencedirect.com/content/image/1-s2.0-S0169409X09000969-gr5.jpg Bi-funkcionalna shRNA]]		[http://ars.sciencedirect.com/content/image/1-s2.0-S0169409X09000969-gr5.jpg Bi-funkcionalna shRNA]

	== Primerjava siRNA in miRNA s shRNA ==		== Primerjava siRNA in miRNA s shRNA ==

Taja Karner: /* Primerjava siRNA in miRNA s shRNA */

2012-04-04T17:30:49Z

Primerjava siRNA in miRNA s shRNA

← Older revision		Revision as of 17:30, 4 April 2012
Line 51:		Line 51:
	== Primerjava siRNA in miRNA s shRNA ==		== Primerjava siRNA in miRNA s shRNA ==

	siRNA je krajša in ima to posebnost, da se lahko nalaga na RICS brez, da bi šla preko vmesnega Dicer encimskega kompleksa. Komplementarno mRNA lahko cepi tako v citoplazmi kot v jedru. Ker so se pojavljali problemi ob uporabi siRNA pri poskusih ''in vivo'', so razvili novo, shRNA, ki je večja in lahko zato utiša večje dele genov. Nastane lahko s pomočjo transkripcije iz dsDNA z lasničnim zavojem, ki jo v celico dodamo preko ekspresorskega vektorja. Ko se shRNA enkrat veže na RISC, se utišanje genov nadaljuje po enakem mehanizmu kot pri siRNA. ShRNA v celici lahko nastane s transkripcijo iz ekspresorskega vektorja, ki ga v celico moramo dodati, medtem ko lahko siRNA nastane samo iz prekurzorja, ki je lahko bodisi shRNA ali pa dsRNA. Na splošno naj bi bilo delovanje shRNA učinkovitejše, ker jo celica sama sintetizira v jedru, medtem ko so za siRNA ugotovili, da se je v dveh dneh po vbrizgavanju, manj kot 1 % vseh siRNA vključil v mehanizem celice. Vendar pa vsem tem trditvam ne moremo povsem zaupati, saj so pri različnih raziskavah dobili precej različne rezultate. Prednost siRNA je v tem, da že majhna koncentracija teh molekul lahko zavre zapis nekega gena, medtem ko pri shRNA za isti efekt potrebujemo več molekul. Sklepamo lahko, da imata obe svoje prednosti in slabost. Za razliko od teh dveh ~~RNAs~~, je miRNA endogena in sodeluje ~~tudi~~ pri številnih drugih celičnih procesih. Njena posebnost je tudi ta, da v nasprotju z drugima dvema ni potrebno popolno ujemanje z mRNA. Utiša lahko že gen, s katerim imata le delno komplementarno verigo, zato lahko vpliva na bistveno večje število genov. Lahko pa celo vpliva na samo DNA in tako regulira izražanje genov že pred nastankom mRNA.		siRNA je krajša in ima to posebnost, da se lahko nalaga na RICS brez, da bi šla preko vmesnega Dicer encimskega kompleksa. Komplementarno mRNA lahko cepi tako v citoplazmi kot v jedru. Ker so se pojavljali problemi ob uporabi siRNA pri poskusih ''in vivo'', so razvili novo, shRNA, ki je večja in lahko zato utiša večje dele genov. Nastane lahko s pomočjo transkripcije iz dsDNA z lasničnim zavojem, ki jo v celico dodamo preko ekspresorskega vektorja. Ko se shRNA enkrat veže na RISC, se utišanje genov nadaljuje po enakem mehanizmu kot pri siRNA. ShRNA v celici lahko nastane s transkripcijo iz ekspresorskega vektorja, ki ga v celico moramo dodati, medtem ko lahko siRNA nastane samo iz prekurzorja, ki je lahko bodisi shRNA ali pa dsRNA. Na splošno naj bi bilo delovanje shRNA učinkovitejše, ker jo celica sama sintetizira v jedru, medtem ko so za siRNA ugotovili, da se je v dveh dneh po vbrizgavanju, manj kot 1 % vseh siRNA vključil v mehanizem celice. Vendar pa vsem tem trditvam ne moremo povsem zaupati, saj so pri različnih raziskavah dobili precej različne rezultate. Prednost siRNA je v tem, da že majhna koncentracija teh molekul lahko zavre zapis nekega gena, medtem ko pri shRNA za isti efekt potrebujemo več molekul. Sklepamo lahko, da imata obe svoje prednosti in slabost. Za razliko od teh dveh majhnih RNA, je miRNA endogena in sodeluje še pri številnih drugih celičnih procesih. Njena posebnost je tudi ta, da v nasprotju z drugima dvema ni potrebno popolno ujemanje z mRNA. Utiša lahko že gen, s katerim imata le delno komplementarno verigo, zato lahko vpliva na bistveno večje število genov. Lahko pa celo vpliva na samo DNA in tako regulira izražanje genov že pred nastankom mRNA.

	== Viri ==		== Viri ==

Taja Karner: /* Bi-funkcionalna shRNA */

2012-04-04T17:27:54Z

Bi-funkcionalna shRNA

← Older revision		Revision as of 17:27, 4 April 2012
Line 45:		Line 45:
	== Bi-funkcionalna shRNA ==		== Bi-funkcionalna shRNA ==

	Gre za najnovejšo tehnologijo, ki so jo opisali šele leta 2009 in je še vedno v razvoju. Bi-funkcionalna shRNA je ~~sintetično majhno~~ RNA, s pomočjo katere bi lahko manipulirali in vplivali na delovanje shRNA v celici. Razvili so jo, da bi z njeno pomočjo pospeši in povečali učinkovitost utišanja genov. Njena glavna prednost je ta, da je sestavljena iz dveh shRNA molekul, ki se lahko posamič vežeta ena na t.i. cepitveno-odvisen in druga na cepitveno-neodvisen RISC. Celotna bi-funkcionalna shRNA sestoji iz dveh stebličastih shRNA ~~(stem-loop)~~, ki se zaključita z zanko. V celico vstavijo plazmidni vektor, . ~~Vstavljeni sta v miR-30~~ Ena ima v celoti ujemajoči verigi, deluje kot navadna shRNA in se na enak način pripne na cepitveno-odvisen del ~~RISCa~~. Druga ima na sredini dva neujemajoča se dela, locirana na 9.-12. bazni par, ki omogočata vezavo na cepitveno-neodvisen RICS. Ko se končna produkta obeh shRNA vežeta na mRNA, tako hkrati inducirata transkripcijo in poskrbita za degradacijo mRNA~~. poskrbi, da prepis ne poteka~~. S takšnim, dopolnjujočim se delovanjem, poteka utišanje genov hitreje in bistveno učinkovitejše.		Gre za najnovejšo tehnologijo, ki so jo opisali šele leta 2009 in je še vedno v razvoju. Bi-funkcionalna shRNA je sintetična majhna RNA, s pomočjo katere bi lahko manipulirali in vplivali na delovanje shRNA v celici. Razvili so jo, da bi z njeno pomočjo pospeši in povečali učinkovitost utišanja genov. Njena glavna prednost je ta, da je sestavljena iz dveh shRNA molekul, ki se lahko posamič vežeta ena na t.i. cepitveno-odvisen in druga na cepitveno-neodvisen RISC. Celotna bi-funkcionalna shRNA sestoji iz dveh stebličastih shRNA, ki se zaključita z lasnično zanko. V celico vstavijo ustrezen plazmidni vektor iz katerega se nato prepiše. Ena shRNA ima v celoti ujemajoči se verigi, deluje kot navadna shRNA in se na enak način pripne na cepitveno-odvisen del RISC-a. Druga ima na sredini dva neujemajoča se dela, locirana na 9.-12. bazni par, ki omogočata vezavo na cepitveno-neodvisen RICS. Ko se končna produkta obeh shRNA vežeta na mRNA, tako hkrati inducirata transkripcijo in poskrbita za degradacijo mRNA. S takšnim, dopolnjujočim se delovanjem, poteka utišanje genov hitreje in bistveno učinkovitejše.

	[[http://ars.sciencedirect.com/content/image/1-s2.0-S0169409X09000969-gr5.jpg Bi-funkcionalna shRNA]]		[[http://ars.sciencedirect.com/content/image/1-s2.0-S0169409X09000969-gr5.jpg Bi-funkcionalna shRNA]]

EvaKnapič: /* Raziskave, ki so privedle do ustvarjanja trajnih celičnih linij sesalcev s pomočjo shRNA */

2012-04-02T20:22:30Z

Raziskave, ki so privedle do ustvarjanja trajnih celičnih linij sesalcev s pomočjo shRNA

← Older revision		Revision as of 20:22, 2 April 2012
Line 14:		Line 14:

	Raziskovalci so želeli testirati možnost, da bi s posnemanjem lasnične RNA uspeli zmanipulirati gene tako, da bi določeni ostali utišani pri podvojevanju celic in pri dedovanju.		Raziskovalci so želeli testirati možnost, da bi s posnemanjem lasnične RNA uspeli zmanipulirati gene tako, da bi določeni ostali utišani pri podvojevanju celic in pri dedovanju.


	=== shRNA sproži utišanje genov v celicah ''Drosophila'' ===		=== shRNA sproži utišanje genov v celicah ''Drosophila'' ===
Line 29:		Line 28:
	Primerjali so tudi uspešnost različno dolgih shRNA. Največja učinkovitost se je pokazala pri shRNA dolgih od 25-29bp, znatno zmanjšanje pa se je pokazalo pri dupleksih krajših od 22bp.		Primerjali so tudi uspešnost različno dolgih shRNA. Največja učinkovitost se je pokazala pri shRNA dolgih od 25-29bp, znatno zmanjšanje pa se je pokazalo pri dupleksih krajših od 22bp.
	Delovanje shRNA so potrdili še na rakavih celicah človeka, epitelnih celicah opic in fibroblastih glodalcev.		Delovanje shRNA so potrdili še na rakavih celicah človeka, epitelnih celicah opic in fibroblastih glodalcev.



	=== Sinteza shRNA ===		=== Sinteza shRNA ===

			==== Sinteza shRNA ''in vitro'' – uporaba T7 RNA polimeraze ====

	==== Sinteza shRNA ''in vitro'' – uporaba T7 RNA ~~polimeraza~~ ====

	Transkripcijske templete za sintezo shRNA in siRNA so pripravili s pomočjo DNA sinteze. Tako sintetizirane shRNA in siRNA so preizkušali tako na celicah ''Drosophila'' in embrionalnih celicah človeških ledvic. Obe RNA sta pokazali enako učinkovitost kot njuni kemijsko sintetizirani različici. Problem se je pojavil pri sprožitvi sinteze, saj T7 polimeraza za začetek potrebuje dva gvanozinska ostanka, ki ju je potrebno dodati, da se sinteza lahko začne, ta pa lahko vplivata na delovanje siRNA. Zato je bolj uporabna sinteza shRNA, ki jo potem Dicer preoblikuje v aktivno obliko siRNA.		Transkripcijske templete za sintezo shRNA in siRNA so pripravili s pomočjo DNA sinteze. Tako sintetizirane shRNA in siRNA so preizkušali tako na celicah ''Drosophila'' in embrionalnih celicah človeških ledvic. Obe RNA sta pokazali enako učinkovitost kot njuni kemijsko sintetizirani različici. Problem se je pojavil pri sprožitvi sinteze, saj T7 polimeraza za začetek potrebuje dva gvanozinska ostanka, ki ju je potrebno dodati, da se sinteza lahko začne, ta pa lahko vplivata na delovanje siRNA. Zato je bolj uporabna sinteza shRNA, ki jo potem Dicer preoblikuje v aktivno obliko siRNA.

Taja Karner: /* Viri */

2012-04-02T20:19:08Z

Viri

← Older revision		Revision as of 20:19, 2 April 2012
Line 70:		Line 70:
	5. Paddison P.J. ''et al.'': Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. ''Genes and Development'', 2002, letn. 16, str. 948-58.		5. Paddison P.J. ''et al.'': Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. ''Genes and Development'', 2002, letn. 16, str. 948-58.

	6. Donald D. Ron ''et al.'': siRNA vs. shRNA: similarities and differences, ''Advanced Drug Delivery Reviews'', 2009, št. 61, 746-759		6. Donald D. Ron ''et al.'': siRNA vs. shRNA: similarities and differences, ''Advanced Drug Delivery Reviews'', 2009, št. 61, str. 746-759

	7. Wang Z. ''et al.'': RNA Interference and Cancer Therapy, ''Expert reviews'', 2011, št. 28, 2983-2995		7. Wang Z. ''et al.'': RNA Interference and Cancer Therapy, ''Expert reviews'', 2011, št. 28, str. 2983-2995



	[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]		[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Taja Karner: /* Bi-funkcionalna shRNA */

2012-04-02T20:17:48Z

Bi-funkcionalna shRNA

← Older revision		Revision as of 20:17, 2 April 2012
Line 52:		Line 52:
	Gre za najnovejšo tehnologijo, ki so jo opisali šele leta 2009 in je še vedno v razvoju. Bi-funkcionalna shRNA je sintetično majhno RNA, s pomočjo katere bi lahko manipulirali in vplivali na delovanje shRNA v celici. Razvili so jo, da bi z njeno pomočjo pospeši in povečali učinkovitost utišanja genov. Njena glavna prednost je ta, da je sestavljena iz dveh shRNA molekul, ki se lahko posamič vežeta ena na t.i. cepitveno-odvisen in druga na cepitveno-neodvisen RISC. Celotna bi-funkcionalna shRNA sestoji iz dveh stebličastih shRNA (stem-loop), ki se zaključita z zanko. V celico vstavijo plazmidni vektor, . Vstavljeni sta v miR-30 Ena ima v celoti ujemajoči verigi, deluje kot navadna shRNA in se na enak način pripne na cepitveno-odvisen del RISCa. Druga ima na sredini dva neujemajoča se dela, locirana na 9.-12. bazni par, ki omogočata vezavo na cepitveno-neodvisen RICS. Ko se končna produkta obeh shRNA vežeta na mRNA, tako hkrati inducirata transkripcijo in poskrbita za degradacijo mRNA. poskrbi, da prepis ne poteka. S takšnim, dopolnjujočim se delovanjem, poteka utišanje genov hitreje in bistveno učinkovitejše.		Gre za najnovejšo tehnologijo, ki so jo opisali šele leta 2009 in je še vedno v razvoju. Bi-funkcionalna shRNA je sintetično majhno RNA, s pomočjo katere bi lahko manipulirali in vplivali na delovanje shRNA v celici. Razvili so jo, da bi z njeno pomočjo pospeši in povečali učinkovitost utišanja genov. Njena glavna prednost je ta, da je sestavljena iz dveh shRNA molekul, ki se lahko posamič vežeta ena na t.i. cepitveno-odvisen in druga na cepitveno-neodvisen RISC. Celotna bi-funkcionalna shRNA sestoji iz dveh stebličastih shRNA (stem-loop), ki se zaključita z zanko. V celico vstavijo plazmidni vektor, . Vstavljeni sta v miR-30 Ena ima v celoti ujemajoči verigi, deluje kot navadna shRNA in se na enak način pripne na cepitveno-odvisen del RISCa. Druga ima na sredini dva neujemajoča se dela, locirana na 9.-12. bazni par, ki omogočata vezavo na cepitveno-neodvisen RICS. Ko se končna produkta obeh shRNA vežeta na mRNA, tako hkrati inducirata transkripcijo in poskrbita za degradacijo mRNA. poskrbi, da prepis ne poteka. S takšnim, dopolnjujočim se delovanjem, poteka utišanje genov hitreje in bistveno učinkovitejše.

	[[http://ars.sciencedirect.com/content/image/1-s2.0-S0169409X09000969-gr5.jpg]]		[[http://ars.sciencedirect.com/content/image/1-s2.0-S0169409X09000969-gr5.jpg Bi-funkcionalna shRNA]]


	== Primerjava siRNA in miRNA s shRNA ==		== Primerjava siRNA in miRNA s shRNA ==

EvaKnapič: /* Sinteza shRNA in vitro – uporaba T7 RNA polimeraza */

2012-04-02T20:16:16Z

Sinteza shRNA in vitro – uporaba T7 RNA polimeraza

← Older revision		Revision as of 20:16, 2 April 2012
Line 38:		Line 38:
	==== Sinteza shRNA ''in vitro'' – uporaba T7 RNA polimeraza ====		==== Sinteza shRNA ''in vitro'' – uporaba T7 RNA polimeraza ====

	Transkripcijske templete za sintezo shRNA in siRNA so pripravili s pomočjo DNA sinteze. Tako sintetizirane shRNA in siRNA so preizkušali tako na celicah Drosophila in embrionalnih celicah človeških ledvic. Obe RNA sta pokazali enako učinkovitost kot njuni kemijsko sintetizirani različici. Problem se je pojavil pri sprožitvi sinteze, saj T7 polimeraza za začetek potrebuje dva gvanozinska ostanka, ki ju je potrebno dodati, da se sinteza lahko začne, ta pa lahko vplivata na delovanje siRNA. Zato je bolj uporabna sinteza shRNA, ki jo potem Dicer preoblikuje v aktivno obliko siRNA.		Transkripcijske templete za sintezo shRNA in siRNA so pripravili s pomočjo DNA sinteze. Tako sintetizirane shRNA in siRNA so preizkušali tako na celicah ''Drosophila'' in embrionalnih celicah človeških ledvic. Obe RNA sta pokazali enako učinkovitost kot njuni kemijsko sintetizirani različici. Problem se je pojavil pri sprožitvi sinteze, saj T7 polimeraza za začetek potrebuje dva gvanozinska ostanka, ki ju je potrebno dodati, da se sinteza lahko začne, ta pa lahko vplivata na delovanje siRNA. Zato je bolj uporabna sinteza shRNA, ki jo potem Dicer preoblikuje v aktivno obliko siRNA.


	==== Sinteza shRNA ''in vivo'' – uporaba RNA polimeraze III ====		==== Sinteza shRNA ''in vivo'' – uporaba RNA polimeraze III ====

EvaKnapič: /* shRNA sproži utišanje genov v celicah Drosophila */

2012-04-02T20:15:14Z

shRNA sproži utišanje genov v celicah Drosophila

← Older revision		Revision as of 20:15, 2 April 2012
Line 16:		Line 16:


	=== shRNA sproži utišanje genov v celicah Drosophila ===		=== shRNA sproži utišanje genov v celicah ''Drosophila'' ===

	Učinkovitost različnih kratkih lasničnih RNA, tako tistih s popolnim in nepopolnim ujemanjem s ciljnim substratom, so testirali na celicah Drosophila v S2 fazi.		Učinkovitost različnih kratkih lasničnih RNA, tako tistih s popolnim in nepopolnim ujemanjem s ciljnim substratom, so testirali na celicah ''Drosophila'' v S2 fazi.
	Za najbolj učinkovite so se izkazale tiste z enostavno lasnično strukturo ter s popolno homologijo do substrata. Na učinkovitost ni vplivala velikost zanke ali sekvenca na zanki.		Za najbolj učinkovite so se izkazale tiste z enostavno lasnično strukturo ter s popolno homologijo do substrata. Na učinkovitost ni vplivala velikost zanke ali sekvenca na zanki.
	Rezultati so pokazali, da Dicer prepozna in predela shRNA, ki posnema njegov naravni substrat(let-7) in tudi tiste s preprosto lasnično strukturo.		Rezultati so pokazali, da Dicer prepozna in predela shRNA, ki posnema njegov naravni substrat(let-7) in tudi tiste s preprosto lasnično strukturo.
	Zaključili so, da je lahko rekombinantna shRNA preko Dicer-ja procesirana v siRNA in s tem potrdili prvotno idejo, da kratka lasnična zanka sproži utišanje genov preko mehanizma RNAi.		Zaključili so, da je lahko rekombinantna shRNA preko Dicer-ja procesirana v siRNA in s tem potrdili prvotno idejo, da kratka lasnična zanka sproži utišanje genov preko mehanizma RNAi.


	=== Utišanje genov v sesalskih celicah ===		=== Utišanje genov v sesalskih celicah ===

Taja Karner: /* Sinteza shRNA */

2012-04-02T20:13:32Z

Sinteza shRNA

← Older revision		Revision as of 20:13, 2 April 2012
Line 33:		Line 33:


	== Sinteza shRNA ==		=== Sinteza shRNA ===



	=== Sinteza shRNA ''in vitro'' – uporaba T7 RNA polimeraza ===		==== Sinteza shRNA ''in vitro'' – uporaba T7 RNA polimeraza ====

	Transkripcijske templete za sintezo shRNA in siRNA so pripravili s pomočjo DNA sinteze. Tako sintetizirane shRNA in siRNA so preizkušali tako na celicah Drosophila in embrionalnih celicah človeških ledvic. Obe RNA sta pokazali enako učinkovitost kot njuni kemijsko sintetizirani različici. Problem se je pojavil pri sprožitvi sinteze, saj T7 polimeraza za začetek potrebuje dva gvanozinska ostanka, ki ju je potrebno dodati, da se sinteza lahko začne, ta pa lahko vplivata na delovanje siRNA. Zato je bolj uporabna sinteza shRNA, ki jo potem Dicer preoblikuje v aktivno obliko siRNA.		Transkripcijske templete za sintezo shRNA in siRNA so pripravili s pomočjo DNA sinteze. Tako sintetizirane shRNA in siRNA so preizkušali tako na celicah Drosophila in embrionalnih celicah človeških ledvic. Obe RNA sta pokazali enako učinkovitost kot njuni kemijsko sintetizirani različici. Problem se je pojavil pri sprožitvi sinteze, saj T7 polimeraza za začetek potrebuje dva gvanozinska ostanka, ki ju je potrebno dodati, da se sinteza lahko začne, ta pa lahko vplivata na delovanje siRNA. Zato je bolj uporabna sinteza shRNA, ki jo potem Dicer preoblikuje v aktivno obliko siRNA.


	=== Sinteza shRNA ''in vivo'' – uporaba RNA polimeraze III ===		==== Sinteza shRNA ''in vivo'' – uporaba RNA polimeraze III ====

	Preizkusili so želeli možnost sinteze na bolj naraven način z uporabo RNA polimeraze III. Promotorji RNA imajo dobro definirana začetna in končna mesta sinteze ter naravno sintetizirajo različne majhne in stabilne RNA. Dobro preučena promotorja U6 snRNA in H1 RNA sta omogočila manipuliranje promotorja do sinteze shRNA.		Preizkusili so želeli možnost sinteze na bolj naraven način z uporabo RNA polimeraze III. Promotorji RNA imajo dobro definirana začetna in končna mesta sinteze ter naravno sintetizirajo različne majhne in stabilne RNA. Dobro preučena promotorja U6 snRNA in H1 RNA sta omogočila manipuliranje promotorja do sinteze shRNA.
Line 49:		Line 49:

	Rezultati nakazujejo na to, da se lahko s pomočjo shRNA ustvari trajne celične linije sesalcev pri katerih je želeni gen trajno utišan.		Rezultati nakazujejo na to, da se lahko s pomočjo shRNA ustvari trajne celične linije sesalcev pri katerih je želeni gen trajno utišan.


	== Bi-funkcionalna shRNA ==		== Bi-funkcionalna shRNA ==