Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov - Revision history

Nika Mikulič: /* RAZISKAVA O VPLIVU NA OMEJITEV HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV S POMOČJO CRISPR PRI BAKTERIJAH STAPHYLOCOCCUS */

2019-04-15T18:25:10Z

RAZISKAVA O VPLIVU NA OMEJITEV HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV S POMOČJO CRISPR PRI BAKTERIJAH STAPHYLOCOCCUS

← Older revision		Revision as of 18:25, 15 April 2019
Line 24:		Line 24:
	Ker je že obstajala hipoteza, da so pri tem procesu pomembni tudi Cas geni, so v istem mutantu WT<sub>Φ858</sub><sup>+S1S2</sup> izbrisali gen ''cas5'' ali ''cas7''. Bakterija z izbrisanim genom ''cas5'' ni bila več odporna na fag 858, iz česar so sklepali, da Cas5 deluje kot nukleaza (ker vsebuje HNH-nukleazni motiv). V bakteriji z inaktiviranim genom ''cas7'' pa je odpornost na fag 858 ostala nespremenjena. Predvidevali so, da je Cas7 vpleten v sintezo in/ali insercijo dodatnih vmesnikov in ponovitev.		Ker je že obstajala hipoteza, da so pri tem procesu pomembni tudi Cas geni, so v istem mutantu WT<sub>Φ858</sub><sup>+S1S2</sup> izbrisali gen ''cas5'' ali ''cas7''. Bakterija z izbrisanim genom ''cas5'' ni bila več odporna na fag 858, iz česar so sklepali, da Cas5 deluje kot nukleaza (ker vsebuje HNH-nukleazni motiv). V bakteriji z inaktiviranim genom ''cas7'' pa je odpornost na fag 858 ostala nespremenjena. Predvidevali so, da je Cas7 vpleten v sintezo in/ali insercijo dodatnih vmesnikov in ponovitev.

	===RAZISKAVA O ~~VPLIVU NA OMEJITEV~~ HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV ~~S POMOČJO~~ CRISPR ~~PRI BAKTERIJAH ''STAPHYLOCOCCUS''~~===		===RAZISKAVA O OMEJITVI HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV Z DELOVANJEM ZAPOREDJA CRISPR NA PLAZMIDNO DNA===

	Pri odkrivanju vloge, ki jo pri omejevanju horizontalnega prenosa genov, predvsem s konjugacijo in transformacijo, igra mehanizem CRISPR, je pomemben del prispevala raziskava L. A. Marraffinija in E. J. Sontheimerja iz leta 2008. Raziskave sta se lotila zaradi vse večjega porasta bakterij ''Staphylococcus aureus'', rezistentnih na antibiotika meticilin in vankomicin, ki je posledica horizontalnega prenosa plazmidov iz bakterij ''Staphylococcus epidermis''. Gre za najpogostejši vrsti bakterij pri bolnišničnih okužbah.		Pri odkrivanju vloge, ki jo pri omejevanju horizontalnega prenosa genov, predvsem s konjugacijo in transformacijo, igra mehanizem CRISPR, je pomemben del prispevala raziskava L. A. Marraffinija in E. J. Sontheimerja iz leta 2008. Raziskave sta se lotila zaradi vse večjega porasta bakterij ''Staphylococcus aureus'', rezistentnih na antibiotika meticilin in vankomicin, ki je posledica horizontalnega prenosa plazmidov iz bakterij ''Staphylococcus epidermis''. Gre za najpogostejši vrsti bakterij pri bolnišničnih okužbah.

Nika Mikulič: /* UVOD */

2019-04-15T17:37:31Z

UVOD

← Older revision		Revision as of 17:37, 15 April 2019
Line 1:		Line 1:
	==UVOD==		==UVOD==
	Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas ~~(iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)~~. Tak imunski sistem vase integrira kose (vmesnike) DNA bakteriofaga, za zagotovitev odpornosti nanj pa potrebuje tudi proteine Cas. Sistem CRISPR/Cas deluje na plazmidno DNA in ne na sprocesirano RNA, ~~kot~~ je to sicer značilno za evkarionte.		Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas. Tak imunski sistem vase integrira kose (vmesnike) DNA bakteriofaga, za zagotovitev odpornosti nanj pa potrebuje tudi proteine Cas. Sistem CRISPR/Cas deluje na plazmidno DNA in ne na sprocesirano RNA, kar je sicer značilno za evkarionte.

	== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==		== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==

Nika Mikulič: /* RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS */

2019-04-15T17:33:29Z

RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS

← Older revision		Revision as of 17:33, 15 April 2019
Line 18:		Line 18:
	Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z ''in silico'' analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije ''Streptococcus thermophilus'' za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.		Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z ''in silico'' analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije ''Streptococcus thermophilus'' za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.

	Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni ~~tudi~~ bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev ''Streptococcus thermophilus'' DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F1.large.jpg]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz DNA virusa.		Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev ''Streptococcus thermophilus'' DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F1.large.jpg]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz DNA virusa.

	Opazili so, da je bila od tega, kateri vmesnik se je v lokus CRISPR vstavil, odvisna tudi rezistenca na fage; pri sevih, v katerih je bil vstavljeni vmesnik 100 % enak zaporedju faga, se je pojavila odpornost. Ker sta faga 858 in 2972 93 % identična, so vmesniki iz bolj ohranjenih regij (vmesniki S3, S6, S7) povzročili odpornost na oba faga. V primerih, ko pa je bilo med 29 – 30 nukleotidi prisotnih 1 – 15 nukleotidnih polimorfizmov, pa tak vmesnik (vmesnik S1, S2, S4, S5 in S8) ni več povzročil rezistence na oba, ampak samo na fag, kateremu je bil izpostavljen. Prav tako je v mutantih, v katerih je bilo vstavljenih več vmesnikov, bila odpornost višja. Med seboj so primerjali tudi odpornost bakterij po tem, ko so iz lokusa CRISPR izbrisali ali dodali vmesnike (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F3.large.jpg]). Iz mutanta WT<sub>Φ858</sub><sup>+S1S2</sup> so odstranili vmesnika S1 in S2, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858. Ko so mutantu WT<sub>Φ2972</sub><sup>+S4</sup> zamenjali vmesnik S4 za S1 in S2, je bila bakterija odporna na fag 858. Mutantu WT<sub>Φ858</sub><sup>+S1S2</sup> so nato med gene Cas in CRIPSR1 vstavili zapis za eno samo ponovitev, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858, čeprav sta bila vmesnika S1 in S2 v lokusu še zmeraj prisotna. To dokazuje, da vmesniki sami po sebi ne povzročijo odpornosti.		Opazili so, da je bila od tega, kateri vmesnik se je v lokus CRISPR vstavil, odvisna tudi rezistenca na fage; pri sevih, v katerih je bil vstavljeni vmesnik 100 % enak zaporedju faga, se je pojavila odpornost. Ker sta faga 858 in 2972 93 % identična, so vmesniki iz bolj ohranjenih regij (vmesniki S3, S6, S7) povzročili odpornost na oba faga. V primerih, ko pa je bilo med 29 – 30 nukleotidi prisotnih 1 – 15 nukleotidnih polimorfizmov, pa tak vmesnik (vmesnik S1, S2, S4, S5 in S8) ni več povzročil rezistence na oba, ampak samo na fag, kateremu je bil izpostavljen. Prav tako je v mutantih, v katerih je bilo vstavljenih več vmesnikov, bila odpornost višja. Med seboj so primerjali tudi odpornost bakterij po tem, ko so iz lokusa CRISPR izbrisali ali dodali vmesnike (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F3.large.jpg]). Iz mutanta WT<sub>Φ858</sub><sup>+S1S2</sup> so odstranili vmesnika S1 in S2, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858. Ko so mutantu WT<sub>Φ2972</sub><sup>+S4</sup> zamenjali vmesnik S4 za S1 in S2, je bila bakterija odporna na fag 858. Mutantu WT<sub>Φ858</sub><sup>+S1S2</sup> so nato med gene Cas in CRIPSR1 vstavili zapis za eno samo ponovitev, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858, čeprav sta bila vmesnika S1 in S2 v lokusu še zmeraj prisotna. To dokazuje, da vmesniki sami po sebi ne povzročijo odpornosti.

Nika Mikulič: /* RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS */

2019-04-15T17:31:29Z

RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS

← Older revision		Revision as of 17:31, 15 April 2019
Line 16:		Line 16:
	===RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE ''STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS''===		===RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE ''STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS''===

	Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z in silico analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije ''Streptococcus thermophilus'' za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.		Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z ''in silico'' analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije ''Streptococcus thermophilus'' za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.

	Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni tudi bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev ''Streptococcus thermophilus'' DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F1.large.jpg]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz DNA virusa.		Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni tudi bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev ''Streptococcus thermophilus'' DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F1.large.jpg]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz DNA virusa.

Nika Mikulič: /* UVOD */

2019-04-15T17:29:39Z

UVOD

← Older revision		Revision as of 17:29, 15 April 2019
Line 1:		Line 1:
	==UVOD==		==UVOD==
	Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji ~~prokariontov~~, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je ~~zgolj nevtralen ali~~ celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas (iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins). Tak imunski sistem vase integrira kose (vmesnike) DNA bakteriofaga, za zagotovitev odpornosti nanj pa potrebuje tudi proteine Cas. Sistem CRISPR/Cas deluje na plazmidno DNA in ne na sprocesirano RNA, kot je to sicer značilno za evkarionte.		Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas (iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins). Tak imunski sistem vase integrira kose (vmesnike) DNA bakteriofaga, za zagotovitev odpornosti nanj pa potrebuje tudi proteine Cas. Sistem CRISPR/Cas deluje na plazmidno DNA in ne na sprocesirano RNA, kot je to sicer značilno za evkarionte.

	== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==		== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==

Nika Mikulič: /* UVOD */

2019-04-15T17:27:59Z

UVOD

← Older revision		Revision as of 17:27, 15 April 2019
Line 1:		Line 1:
	==UVOD==		==UVOD==
	Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji prokariontov, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je zgolj nevtralen ali celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas (iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins).		Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji prokariontov, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je zgolj nevtralen ali celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas (iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins). Tak imunski sistem vase integrira kose (vmesnike) DNA bakteriofaga, za zagotovitev odpornosti nanj pa potrebuje tudi proteine Cas. Sistem CRISPR/Cas deluje na plazmidno DNA in ne na sprocesirano RNA, kot je to sicer značilno za evkarionte.

	== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==		== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==

Nika Mikulič: /* UVOD */

2019-04-15T17:22:03Z

UVOD

← Older revision		Revision as of 17:22, 15 April 2019
Line 1:		Line 1:
	==UVOD==		==UVOD==
	Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji prokariontov, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je zgolj nevtralen ali celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas (iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins). ~~Tak imunski sistem prokariontov uporablja dele bakteriofagne DNK, ki~~		Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji prokariontov, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je zgolj nevtralen ali celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas (iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins).

	== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==		== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==

Nika Mikulič: /* UVOD */

2019-04-15T17:21:27Z

UVOD

← Older revision		Revision as of 17:21, 15 April 2019
Line 1:		Line 1:
	==UVOD==		==UVOD==
	Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji prokariontov, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je zgolj nevtralen ali celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas (iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins).		Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji prokariontov, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je zgolj nevtralen ali celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas (iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins). Tak imunski sistem prokariontov uporablja dele bakteriofagne DNK, ki

	== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==		== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==

Nika Mikulič: /* IMUNSKI SISTEM CRISPR/Cas */

2019-04-15T17:17:16Z

IMUNSKI SISTEM CRISPR/Cas

← Older revision		Revision as of 17:17, 15 April 2019
Line 12:		Line 12:
	===IMUNSKI SISTEM CRISPR/Cas===		===IMUNSKI SISTEM CRISPR/Cas===

	Sistem CRISPR/Cas deluje kot imunski sistem bakterij in arhej. Deluje tako, da koščke tuje ~~DNK~~ po vstopu v celico integrira v lokus CRISPR. Take koščke imenujemo vmesniki (prekinjajo pa jih t. i. ponovitve) in služijo kot nekakšen spomin imunskega sistema. Ta se v procesu transkripcije prepiše v molekulo crRNA (CRISPR RNA), ki usmerja proteine Cas na tarčno zaporedje. Proteini Cas so endonukleaze, ki tako prepoznajo specifično tujo ~~DNK~~, jo cepijo in razgradijo.		Sistem CRISPR/Cas deluje kot imunski sistem bakterij in arhej. Deluje tako, da koščke tuje DNA po vstopu v celico integrira v lokus CRISPR. Take koščke imenujemo vmesniki (prekinjajo pa jih t. i. ponovitve) in služijo kot nekakšen spomin imunskega sistema. Ta se v procesu transkripcije prepiše v molekulo crRNA (CRISPR RNA), ki usmerja proteine Cas na tarčno zaporedje. Proteini Cas so endonukleaze, ki tako prepoznajo specifično tujo DNA, jo cepijo in razgradijo.

	===RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE ''STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS''===		===RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE ''STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS''===

Nika Mikulič: /* RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS */

2019-04-15T17:16:43Z

RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS

← Older revision		Revision as of 17:16, 15 April 2019
Line 18:		Line 18:
	Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z in silico analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije ''Streptococcus thermophilus'' za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.		Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z in silico analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije ''Streptococcus thermophilus'' za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.

	Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni tudi bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev ''Streptococcus thermophilus'' DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F1.large.jpg]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz ~~DNK~~ virusa.		Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni tudi bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev ''Streptococcus thermophilus'' DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F1.large.jpg]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz DNA virusa.

	Opazili so, da je bila od tega, kateri vmesnik se je v lokus CRISPR vstavil, odvisna tudi rezistenca na fage; pri sevih, v katerih je bil vstavljeni vmesnik 100 % enak zaporedju faga, se je pojavila odpornost. Ker sta faga 858 in 2972 93 % identična, so vmesniki iz bolj ohranjenih regij (vmesniki S3, S6, S7) povzročili odpornost na oba faga. V primerih, ko pa je bilo med 29 – 30 nukleotidi prisotnih 1 – 15 nukleotidnih polimorfizmov, pa tak vmesnik (vmesnik S1, S2, S4, S5 in S8) ni več povzročil rezistence na oba, ampak samo na fag, kateremu je bil izpostavljen. Prav tako je v mutantih, v katerih je bilo vstavljenih več vmesnikov, bila odpornost višja. Med seboj so primerjali tudi odpornost bakterij po tem, ko so iz lokusa CRISPR izbrisali ali dodali vmesnike (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F3.large.jpg]). Iz mutanta WT<sub>Φ858</sub><sup>+S1S2</sup> so odstranili vmesnika S1 in S2, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858. Ko so mutantu WT<sub>Φ2972</sub><sup>+S4</sup> zamenjali vmesnik S4 za S1 in S2, je bila bakterija odporna na fag 858. Mutantu WT<sub>Φ858</sub><sup>+S1S2</sup> so nato med gene Cas in CRIPSR1 vstavili zapis za eno samo ponovitev, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858, čeprav sta bila vmesnika S1 in S2 v lokusu še zmeraj prisotna. To dokazuje, da vmesniki sami po sebi ne povzročijo odpornosti.		Opazili so, da je bila od tega, kateri vmesnik se je v lokus CRISPR vstavil, odvisna tudi rezistenca na fage; pri sevih, v katerih je bil vstavljeni vmesnik 100 % enak zaporedju faga, se je pojavila odpornost. Ker sta faga 858 in 2972 93 % identična, so vmesniki iz bolj ohranjenih regij (vmesniki S3, S6, S7) povzročili odpornost na oba faga. V primerih, ko pa je bilo med 29 – 30 nukleotidi prisotnih 1 – 15 nukleotidnih polimorfizmov, pa tak vmesnik (vmesnik S1, S2, S4, S5 in S8) ni več povzročil rezistence na oba, ampak samo na fag, kateremu je bil izpostavljen. Prav tako je v mutantih, v katerih je bilo vstavljenih več vmesnikov, bila odpornost višja. Med seboj so primerjali tudi odpornost bakterij po tem, ko so iz lokusa CRISPR izbrisali ali dodali vmesnike (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F3.large.jpg]). Iz mutanta WT<sub>Φ858</sub><sup>+S1S2</sup> so odstranili vmesnika S1 in S2, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858. Ko so mutantu WT<sub>Φ2972</sub><sup>+S4</sup> zamenjali vmesnik S4 za S1 in S2, je bila bakterija odporna na fag 858. Mutantu WT<sub>Φ858</sub><sup>+S1S2</sup> so nato med gene Cas in CRIPSR1 vstavili zapis za eno samo ponovitev, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858, čeprav sta bila vmesnika S1 in S2 v lokusu še zmeraj prisotna. To dokazuje, da vmesniki sami po sebi ne povzročijo odpornosti.