PICasSO: - Revision history

Zarja Weingerl: /* Eksperimentalno delo */

2025-05-19T19:59:10Z

Eksperimentalno delo

← Older revision		Revision as of 19:59, 19 May 2025
Line 29:		Line 29:


	Za kvantitativno oceno učinkovitosti Cas-sponk so razvili FRET (Fluorescenčni resonančni prenos energije) sistem, ki omogoča merjenje bližine med DNA regijami v živih celicah. FRET analiza je bila razvita z uporabo dvo-plazmidnega sistema v bakterijskih celicah 'E. coli'. Ekspresijski plazmid je vseboval zapise za: fuzirana proteina tetR-Oct1(sponka), Oct1-mNeonGreen (FRET donor), tetR-mScarlet-I (FRET akceptor) pod kontrolo T7 promotorja in 15 ponovitev tetR vezavnega motiva. Drug plazmid pa je vseboval 15 ponovitev vezavnega mesta za Oct1. Pri uspešni vezavi sponke na oba plazmida pride do prostorske bližine donorja in akceptorja, kar omogoči meritev FRET signala, kot dokaz učinkovitega približanja plazmidov. FRET signal je povečana fluorescenčna emisija akceptorja (mScarlet-I), ki ni posledica njegovega neposrednega vzbujanja, temveč prenosa energije z donorja (mNeonGreen). Kot pozitivno kontrolo so uporabili fuzijo mNeonGreen-mScarlet-I, kot negativno pa plazmid brez ponovitev vezavnega mesta za Oct1. Pokazali so, da nižja koncentracija IPTG vodi v višjo FRET učinkovitost, kar so pripisali manjši celični obremenitve. Pozitivna kontrola je pokazala najvišji FRET signal, medtem ko je bila testna sponka značilno učinkovitejša od negativne kontrole. To je potrdilo uspešno delovanje sistema za prostorsko povezovanje DNA v bakterijskih celicah.		Za kvantitativno oceno učinkovitosti Cas-sponk so razvili FRET (Fluorescenčni resonančni prenos energije) sistem, ki omogoča merjenje bližine med DNA regijami v živih celicah. FRET analiza je bila razvita z uporabo dvo-plazmidnega sistema v bakterijskih celicah ''E. coli''. Ekspresijski plazmid je vseboval zapise za: fuzirana proteina tetR-Oct1(sponka), Oct1-mNeonGreen (FRET donor), tetR-mScarlet-I (FRET akceptor) pod kontrolo T7 promotorja in 15 ponovitev tetR vezavnega motiva. Drug plazmid pa je vseboval 15 ponovitev vezavnega mesta za Oct1. Pri uspešni vezavi sponke na oba plazmida pride do prostorske bližine donorja in akceptorja, kar omogoči meritev FRET signala, kot dokaz učinkovitega približanja plazmidov. FRET signal je povečana fluorescenčna emisija akceptorja (mScarlet-I), ki ni posledica njegovega neposrednega vzbujanja, temveč prenosa energije z donorja (mNeonGreen). Kot pozitivno kontrolo so uporabili fuzijo mNeonGreen-mScarlet-I, kot negativno pa plazmid brez ponovitev vezavnega mesta za Oct1. Pokazali so, da nižja koncentracija IPTG vodi v višjo FRET učinkovitost, kar so pripisali manjši celični obremenitve. Pozitivna kontrola je pokazala najvišji FRET signal, medtem ko je bila testna sponka značilno učinkovitejša od negativne kontrole. To je potrdilo uspešno delovanje sistema za prostorsko povezovanje DNA v bakterijskih celicah.

	=='''DaVinci'''==		=='''DaVinci'''==

Zarja Weingerl: /* Eksperimentalno delo */

2025-05-19T19:58:35Z

Eksperimentalno delo

← Older revision		Revision as of 19:58, 19 May 2025
Line 29:		Line 29:


	Za kvantitativno oceno učinkovitosti Cas-sponk so razvili FRET (Fluorescenčni resonančni prenos energije) sistem, ki omogoča merjenje bližine med DNA regijami v živih celicah. FRET analiza je bila razvita z uporabo dvo-plazmidnega sistema v bakterijskih celicah E. coli. Ekspresijski plazmid je vseboval zapise za: fuzirana proteina tetR-Oct1(sponka), Oct1-mNeonGreen (FRET donor), tetR-mScarlet-I (FRET akceptor) pod kontrolo T7 promotorja in 15 ponovitev tetR vezavnega motiva. Drug plazmid pa je vseboval 15 ponovitev vezavnega mesta za Oct1. Pri uspešni vezavi sponke na oba plazmida pride do prostorske bližine donorja in akceptorja, kar omogoči meritev FRET signala, kot dokaz učinkovitega približanja plazmidov. FRET signal je povečana fluorescenčna emisija akceptorja (mScarlet-I), ki ni posledica njegovega neposrednega vzbujanja, temveč prenosa energije z donorja (mNeonGreen). Kot pozitivno kontrolo so uporabili fuzijo mNeonGreen-mScarlet-I, kot negativno pa plazmid brez ponovitev vezavnega mesta za Oct1. Pokazali so, da nižja koncentracija IPTG vodi v višjo FRET učinkovitost, kar so pripisali manjši celični obremenitve. Pozitivna kontrola je pokazala najvišji FRET signal, medtem ko je bila testna sponka značilno učinkovitejša od negativne kontrole. To je potrdilo uspešno delovanje sistema za prostorsko povezovanje DNA v bakterijskih celicah.		Za kvantitativno oceno učinkovitosti Cas-sponk so razvili FRET (Fluorescenčni resonančni prenos energije) sistem, ki omogoča merjenje bližine med DNA regijami v živih celicah. FRET analiza je bila razvita z uporabo dvo-plazmidnega sistema v bakterijskih celicah 'E. coli'. Ekspresijski plazmid je vseboval zapise za: fuzirana proteina tetR-Oct1(sponka), Oct1-mNeonGreen (FRET donor), tetR-mScarlet-I (FRET akceptor) pod kontrolo T7 promotorja in 15 ponovitev tetR vezavnega motiva. Drug plazmid pa je vseboval 15 ponovitev vezavnega mesta za Oct1. Pri uspešni vezavi sponke na oba plazmida pride do prostorske bližine donorja in akceptorja, kar omogoči meritev FRET signala, kot dokaz učinkovitega približanja plazmidov. FRET signal je povečana fluorescenčna emisija akceptorja (mScarlet-I), ki ni posledica njegovega neposrednega vzbujanja, temveč prenosa energije z donorja (mNeonGreen). Kot pozitivno kontrolo so uporabili fuzijo mNeonGreen-mScarlet-I, kot negativno pa plazmid brez ponovitev vezavnega mesta za Oct1. Pokazali so, da nižja koncentracija IPTG vodi v višjo FRET učinkovitost, kar so pripisali manjši celični obremenitve. Pozitivna kontrola je pokazala najvišji FRET signal, medtem ko je bila testna sponka značilno učinkovitejša od negativne kontrole. To je potrdilo uspešno delovanje sistema za prostorsko povezovanje DNA v bakterijskih celicah.

	=='''DaVinci'''==		=='''DaVinci'''==

Zarja Weingerl: /* Eksperimentalno delo */

2025-05-19T19:56:35Z

Eksperimentalno delo

← Older revision		Revision as of 19:56, 19 May 2025
Line 17:		Line 17:

	=='''Eksperimentalno delo'''==		=='''Eksperimentalno delo'''==
	Za učinkovito kloniranje različnih vmesnikov, ki vsebujejo ~~''crRNA''~~ Cas12a, linker in »crRNA« SpCas9, je ekipa zasnovala vhodni vektor, ki vključuje promotor U6, ~~''tracrRNA''~~ Cas12a, bakterijski promotor za izražanje gena ccdB in ~~''tracrRNA''~~ SpCas9. Uspešna integracija vmesnika vodi do odstranitve gena ccdB, kar omogoča rast bakterij in tako služi kot pokazatelj uspešnega kloniranja.		Za učinkovito kloniranje različnih vmesnikov, ki vsebujejo »crRNA« Cas12a, linker in »crRNA« SpCas9, je ekipa zasnovala vhodni vektor, ki vključuje promotor U6, »tracrRNA« Cas12a, bakterijski promotor za izražanje gena ccdB in »tracrRNA« SpCas9. Uspešna integracija vmesnika vodi do odstranitve gena ccdB, kar omogoča rast bakterij in tako služi kot pokazatelj uspešnega kloniranja.


Line 23:		Line 23:


	Sledilo je testiranje katalitsko neaktivnih dCas. V svojem eksperimentu so uporabili dCas9 z vezanim aktivatorjem VP64. Pripravili so fgRNA, ki so vsebovale ~~''crRNA''~~ dMbCas12a, usmerjeno proti tetO zaporedju, ter ne ciljno ~~''crRNA''~~ dCas9. Zaporedje TetO je bilo nameščeno pred minimalnim promotorjem in genom za luciferazo. Ob vezavi dMbCas12a na tetO so pričakovali povečano izražanje luciferaze na račun prisotnosti aktivatorja VP64, v bližini promotorja. Žal nobena od testiranih fgRNA konstrukcij, razen pozitivne kontrole, ni povzročila spremembe v izražanju luciferaze.		Sledilo je testiranje katalitsko neaktivnih dCas. V svojem eksperimentu so uporabili dCas9 z vezanim aktivatorjem VP64. Pripravili so fgRNA, ki so vsebovale »crRNA« dMbCas12a, usmerjeno proti tetO zaporedju, ter ne ciljno »crRNA« dCas9. Zaporedje TetO je bilo nameščeno pred minimalnim promotorjem in genom za luciferazo. Ob vezavi dMbCas12a na tetO so pričakovali povečano izražanje luciferaze na račun prisotnosti aktivatorja VP64, v bližini promotorja. Žal nobena od testiranih fgRNA konstrukcij, razen pozitivne kontrole, ni povzročila spremembe v izražanju luciferaze.

Zarja Weingerl: /* Eksperimentalno delo */

2025-05-19T19:52:35Z

Eksperimentalno delo

← Older revision		Revision as of 19:52, 19 May 2025
Line 17:		Line 17:

	=='''Eksperimentalno delo'''==		=='''Eksperimentalno delo'''==
	Za učinkovito kloniranje različnih vmesnikov, ki vsebujejo ''crRNA'' Cas12a, linker in ~~''crRNA''~~ SpCas9, je ekipa zasnovala vhodni vektor, ki vključuje promotor U6, ''tracrRNA'' Cas12a, bakterijski promotor za izražanje gena ccdB in ''tracrRNA'' SpCas9. Uspešna integracija vmesnika vodi do odstranitve gena ccdB, kar omogoča rast bakterij in tako služi kot pokazatelj uspešnega kloniranja.		Za učinkovito kloniranje različnih vmesnikov, ki vsebujejo ''crRNA'' Cas12a, linker in »crRNA« SpCas9, je ekipa zasnovala vhodni vektor, ki vključuje promotor U6, ''tracrRNA'' Cas12a, bakterijski promotor za izražanje gena ccdB in ''tracrRNA'' SpCas9. Uspešna integracija vmesnika vodi do odstranitve gena ccdB, kar omogoča rast bakterij in tako služi kot pokazatelj uspešnega kloniranja.

Zarja Weingerl at 19:43, 19 May 2025

2025-05-19T19:43:45Z

← Older revision		Revision as of 19:43, 19 May 2025
Line 1:		Line 1:
			PICasSO je projekt študentske ekipe iz Heidelberga, ki je na tekmovanju iGEM osvojila glavno nagrado v kategoriji dodiplomskih projektov. Prejeli pa so tudi priznanja za najboljšo temeljno inovacijo, najboljšo zbirko genetskih delov, najboljši računalniški model in najboljšo spletno stran.

	=='''Motivacija'''==		=='''Motivacija'''==
	Vse celice v našem telesu vsebujejo enako DNA zaporedje, vendar tega zelo različno interpretirajo, odvisno od 3D organizacije genoma. To vodi do različnih celičnih fenotipov in v nekaterih primerih določa celo razliko med zdravjem in boleznijo. Znanstveniki se večinoma osredotočajo na spreminjanje zaporedja genoma in pogosto zanemarijo vpliv njegove 3D organizacije. Ekipa iz Heidelberga se je zato s svojim projektom osredotočala na ustvarjanje novih interakcij DNA-DNA, ki so jim omogočale manipulacijo s 3D strukturo genoma. Ustvarili so PICasSO (Plasmid-Integrated Cas-Stapled Origami), nabor orodij za preurejanje 3D arhitekture genoma, z doslej neprimerljivo prostorsko natančnostjo.		Vse celice v našem telesu vsebujejo enako DNA zaporedje, vendar tega zelo različno interpretirajo, odvisno od 3D organizacije genoma. To vodi do različnih celičnih fenotipov in v nekaterih primerih določa celo razliko med zdravjem in boleznijo. Znanstveniki se večinoma osredotočajo na spreminjanje zaporedja genoma in pogosto zanemarijo vpliv njegove 3D organizacije. Ekipa iz Heidelberga se je zato s svojim projektom osredotočala na ustvarjanje novih interakcij DNA-DNA, ki so jim omogočale manipulacijo s 3D strukturo genoma. Ustvarili so PICasSO (Plasmid-Integrated Cas-Stapled Origami), nabor orodij za preurejanje 3D arhitekture genoma, z doslej neprimerljivo prostorsko natančnostjo.

Zarja Weingerl: /* Aplikacije */

2025-05-19T19:36:56Z

Aplikacije

← Older revision		Revision as of 19:36, 19 May 2025
Line 7:		Line 7:
	=='''Aplikacije'''==		=='''Aplikacije'''==
	V evkariontskih celicah imamo ogromno regulacijskih elementov, kot so ojačevalna zaporedja (enhancer) in utiševalna zaporedja (silencer), ki preko mediatorjev uravnavajo izražanje genov. PICasSo posnema funkcijo mediatorja in s približanjem ojačevalnega zaporedja in promotorja inducira in uravnava izražanje specifičnih genov. Lahko pa tudi blokira dostop ojačevalnega zaporedja do TATA-sekvence promotorja in tako prepreči izražanje izbranega gena. Poleg posnemanja naravnih sistemov omogoča PICasSO tudi inženiring povsem novih regulacijskih arhitektur genoma, s tem ko na natančno določene lokacije pripelje umetne regulacijske elemente. Ta sintetični način nadzora omogoča natančno uravnavanje izražanja genov ter modeliranje bolezni, katerih mehanizmi izvirajo iz motene 3D organizacije genoma (npr. rak).		V evkariontskih celicah imamo ogromno regulacijskih elementov, kot so ojačevalna zaporedja (enhancer) in utiševalna zaporedja (silencer), ki preko mediatorjev uravnavajo izražanje genov. PICasSo posnema funkcijo mediatorja in s približanjem ojačevalnega zaporedja in promotorja inducira in uravnava izražanje specifičnih genov. Lahko pa tudi blokira dostop ojačevalnega zaporedja do TATA-sekvence promotorja in tako prepreči izražanje izbranega gena. Poleg posnemanja naravnih sistemov omogoča PICasSO tudi inženiring povsem novih regulacijskih arhitektur genoma, s tem ko na natančno določene lokacije pripelje umetne regulacijske elemente. Ta sintetični način nadzora omogoča natančno uravnavanje izražanja genov ter modeliranje bolezni, katerih mehanizmi izvirajo iz motene 3D organizacije genoma (npr. rak).


	Sistem PICasSO omogoča približevanje tako cis- kot trans- regulacijskih elementov genoma, ter dovoljuje uporabo večjega števila Cas-sponk hkrati, kar omogoča multipleksiranje. Z enkratnim vnosom genov, ki kodirata dCas9 in dCas12a, lahko tako vzpostavimo povezave med več izbranimi pari lokusov le z dodajanjem različnih fgRNA. Vsaka fgRNA namreč kodira dve natančno določeni tarči na DNA , ki ju želimo prostorsko približati. Zmožnost multipleksiranja tako omogoča obsežne prostorske prerazporeditve funkcionalnih DNA elementov znotraj 3D genoma, kar odpira nova vrata za sintetično biologijo, gensko terapijo in še mnogo več.		Sistem PICasSO omogoča približevanje tako cis- kot trans- regulacijskih elementov genoma, ter dovoljuje uporabo večjega števila Cas-sponk hkrati, kar omogoča multipleksiranje. Z enkratnim vnosom genov, ki kodirata dCas9 in dCas12a, lahko tako vzpostavimo povezave med več izbranimi pari lokusov le z dodajanjem različnih fgRNA. Vsaka fgRNA namreč kodira dve natančno določeni tarči na DNA , ki ju želimo prostorsko približati. Zmožnost multipleksiranja tako omogoča obsežne prostorske prerazporeditve funkcionalnih DNA elementov znotraj 3D genoma, kar odpira nova vrata za sintetično biologijo, gensko terapijo in še mnogo več.


	Ena izmed pomembnih aplikacij sistema je modeliranje pojava enhancer hijacking. Gre za pojav, ki je razširjen pri mnogih oblikah raka. Pri enhancer hijacking pride do prekomerne aktivacije (onko)gena, ki jo povzroči oddaljeno ojačevalno zaporedje, ko se zaradi preoblikovanja 3D-strukture genoma znajde v prostorski bližini (onko)gena. Do sedaj je bilo ta mehanizem zelo težko raziskovati, zaradi pomanjkanja učinkovitih orodij za nadzor prostorske bližine, med genetskimi regijami v živih celicah. Ekipi pa je z uporabo modela DaVinci za načrtovanje specializiranih Cas-sponk uspelo ustvariti sintetični enhancer hijacking in ga eksperimentalno potrditi v celicah HEK293T. To je prvi tovrstni poskus s prilagodljivim in večnamenskim pristopom. To odpira vrata nadaljnjemu raziskovanju bolezni in razvoju natančne genske terapije.		Ena izmed pomembnih aplikacij sistema je modeliranje pojava enhancer hijacking. Gre za pojav, ki je razširjen pri mnogih oblikah raka. Pri enhancer hijacking pride do prekomerne aktivacije (onko)gena, ki jo povzroči oddaljeno ojačevalno zaporedje, ko se zaradi preoblikovanja 3D-strukture genoma znajde v prostorski bližini (onko)gena. Do sedaj je bilo ta mehanizem zelo težko raziskovati, zaradi pomanjkanja učinkovitih orodij za nadzor prostorske bližine, med genetskimi regijami v živih celicah. Ekipi pa je z uporabo modela DaVinci za načrtovanje specializiranih Cas-sponk uspelo ustvariti sintetični enhancer hijacking in ga eksperimentalno potrditi v celicah HEK293T. To je prvi tovrstni poskus s prilagodljivim in večnamenskim pristopom. To odpira vrata nadaljnjemu raziskovanju bolezni in razvoju natančne genske terapije.

Zarja Weingerl: /* Eksperimentalno delo */

2025-05-19T19:36:34Z

Eksperimentalno delo

← Older revision		Revision as of 19:36, 19 May 2025
Line 14:		Line 14:
	=='''Eksperimentalno delo'''==		=='''Eksperimentalno delo'''==
	Za učinkovito kloniranje različnih vmesnikov, ki vsebujejo ''crRNA'' Cas12a, linker in ''crRNA'' SpCas9, je ekipa zasnovala vhodni vektor, ki vključuje promotor U6, ''tracrRNA'' Cas12a, bakterijski promotor za izražanje gena ccdB in ''tracrRNA'' SpCas9. Uspešna integracija vmesnika vodi do odstranitve gena ccdB, kar omogoča rast bakterij in tako služi kot pokazatelj uspešnega kloniranja.		Za učinkovito kloniranje različnih vmesnikov, ki vsebujejo ''crRNA'' Cas12a, linker in ''crRNA'' SpCas9, je ekipa zasnovala vhodni vektor, ki vključuje promotor U6, ''tracrRNA'' Cas12a, bakterijski promotor za izražanje gena ccdB in ''tracrRNA'' SpCas9. Uspešna integracija vmesnika vodi do odstranitve gena ccdB, kar omogoča rast bakterij in tako služi kot pokazatelj uspešnega kloniranja.


	Ekipa je najprej testirala delovanje fgRNA s katalitsko aktivnimi Cas proteini Cas9 in Cas12a v sesalskih celicah HEK293-T. Fuzijsko usmerjevalno RNA (fgRNA) so zasnovali s kombinacijo sgRNA iz SpCas9 in crRNA iz Cas12a. Kot tarči za Cas12a in Cas9 sta bila izbrana gena VEGFA in FANCF. Vsak od izbranih tarčnih genov je bil nato testiran z vsakim katalitsko aktivnim proteinom Cas. Učinkovitost urejanja je bila analizirana s pomočjo T7 endonukleaze I. Kot pozitivne kontrole so bile uporabljene posamezne sgRNA, kot negativne kontrole pa netarčne usmerjevalne RNA. Visoko stopnjo urejanja genoma so zaznali pri uporabi posameznih sgRN, opazili pa so tudi urejanje pri fgRNA. Ti rezultati so potrdili, da fgRNA omogoča učinkovito urejanje genoma in je zato primerna za nadaljnje testiranje.		Ekipa je najprej testirala delovanje fgRNA s katalitsko aktivnimi Cas proteini Cas9 in Cas12a v sesalskih celicah HEK293-T. Fuzijsko usmerjevalno RNA (fgRNA) so zasnovali s kombinacijo sgRNA iz SpCas9 in crRNA iz Cas12a. Kot tarči za Cas12a in Cas9 sta bila izbrana gena VEGFA in FANCF. Vsak od izbranih tarčnih genov je bil nato testiran z vsakim katalitsko aktivnim proteinom Cas. Učinkovitost urejanja je bila analizirana s pomočjo T7 endonukleaze I. Kot pozitivne kontrole so bile uporabljene posamezne sgRNA, kot negativne kontrole pa netarčne usmerjevalne RNA. Visoko stopnjo urejanja genoma so zaznali pri uporabi posameznih sgRN, opazili pa so tudi urejanje pri fgRNA. Ti rezultati so potrdili, da fgRNA omogoča učinkovito urejanje genoma in je zato primerna za nadaljnje testiranje.


	Sledilo je testiranje katalitsko neaktivnih dCas. V svojem eksperimentu so uporabili dCas9 z vezanim aktivatorjem VP64. Pripravili so fgRNA, ki so vsebovale ''crRNA'' dMbCas12a, usmerjeno proti tetO zaporedju, ter ne ciljno ''crRNA'' dCas9. Zaporedje TetO je bilo nameščeno pred minimalnim promotorjem in genom za luciferazo. Ob vezavi dMbCas12a na tetO so pričakovali povečano izražanje luciferaze na račun prisotnosti aktivatorja VP64, v bližini promotorja. Žal nobena od testiranih fgRNA konstrukcij, razen pozitivne kontrole, ni povzročila spremembe v izražanju luciferaze.		Sledilo je testiranje katalitsko neaktivnih dCas. V svojem eksperimentu so uporabili dCas9 z vezanim aktivatorjem VP64. Pripravili so fgRNA, ki so vsebovale ''crRNA'' dMbCas12a, usmerjeno proti tetO zaporedju, ter ne ciljno ''crRNA'' dCas9. Zaporedje TetO je bilo nameščeno pred minimalnim promotorjem in genom za luciferazo. Ob vezavi dMbCas12a na tetO so pričakovali povečano izražanje luciferaze na račun prisotnosti aktivatorja VP64, v bližini promotorja. Žal nobena od testiranih fgRNA konstrukcij, razen pozitivne kontrole, ni povzročila spremembe v izražanju luciferaze.


	Pripravili so tudi eksperiment, v katerem so testirali, ali lahko fgRNA hkrati veže dva dCas proteina in tako poveže dva ločena DNA fragmenta ter povzroči trans-aktivacijo želenega gena. Uporabili so reporterski plazmid z genom za luciferazo in ojačevalni plazmid z vezavnim mestom za Gal4-VP64. Ob povezavi teh dveh plazmidov s Cas-sponko so pričakovali, da bo prišlo do večjega izražanja luciferaze zaradi aktivatorja VP64. Pri uporabi posameznih dCas proteinov se je z daljšanjem linkerja v fgRNA povečala luminiscenca, kar pomeni boljšo učinkovitost. Pri fuzijskih dCas proteinih pa je bila skupna aktivnost nižja, najboljše rezultate so dosegli pri srednje dolgih linkerjih (20–30 nt).		Pripravili so tudi eksperiment, v katerem so testirali, ali lahko fgRNA hkrati veže dva dCas proteina in tako poveže dva ločena DNA fragmenta ter povzroči trans-aktivacijo želenega gena. Uporabili so reporterski plazmid z genom za luciferazo in ojačevalni plazmid z vezavnim mestom za Gal4-VP64. Ob povezavi teh dveh plazmidov s Cas-sponko so pričakovali, da bo prišlo do večjega izražanja luciferaze zaradi aktivatorja VP64. Pri uporabi posameznih dCas proteinov se je z daljšanjem linkerja v fgRNA povečala luminiscenca, kar pomeni boljšo učinkovitost. Pri fuzijskih dCas proteinih pa je bila skupna aktivnost nižja, najboljše rezultate so dosegli pri srednje dolgih linkerjih (20–30 nt).


	Za kvantitativno oceno učinkovitosti Cas-sponk so razvili FRET (Fluorescenčni resonančni prenos energije) sistem, ki omogoča merjenje bližine med DNA regijami v živih celicah. FRET analiza je bila razvita z uporabo dvo-plazmidnega sistema v bakterijskih celicah E. coli. Ekspresijski plazmid je vseboval zapise za: fuzirana proteina tetR-Oct1(sponka), Oct1-mNeonGreen (FRET donor), tetR-mScarlet-I (FRET akceptor) pod kontrolo T7 promotorja in 15 ponovitev tetR vezavnega motiva. Drug plazmid pa je vseboval 15 ponovitev vezavnega mesta za Oct1. Pri uspešni vezavi sponke na oba plazmida pride do prostorske bližine donorja in akceptorja, kar omogoči meritev FRET signala, kot dokaz učinkovitega približanja plazmidov. FRET signal je povečana fluorescenčna emisija akceptorja (mScarlet-I), ki ni posledica njegovega neposrednega vzbujanja, temveč prenosa energije z donorja (mNeonGreen). Kot pozitivno kontrolo so uporabili fuzijo mNeonGreen-mScarlet-I, kot negativno pa plazmid brez ponovitev vezavnega mesta za Oct1. Pokazali so, da nižja koncentracija IPTG vodi v višjo FRET učinkovitost, kar so pripisali manjši celični obremenitve. Pozitivna kontrola je pokazala najvišji FRET signal, medtem ko je bila testna sponka značilno učinkovitejša od negativne kontrole. To je potrdilo uspešno delovanje sistema za prostorsko povezovanje DNA v bakterijskih celicah.		Za kvantitativno oceno učinkovitosti Cas-sponk so razvili FRET (Fluorescenčni resonančni prenos energije) sistem, ki omogoča merjenje bližine med DNA regijami v živih celicah. FRET analiza je bila razvita z uporabo dvo-plazmidnega sistema v bakterijskih celicah E. coli. Ekspresijski plazmid je vseboval zapise za: fuzirana proteina tetR-Oct1(sponka), Oct1-mNeonGreen (FRET donor), tetR-mScarlet-I (FRET akceptor) pod kontrolo T7 promotorja in 15 ponovitev tetR vezavnega motiva. Drug plazmid pa je vseboval 15 ponovitev vezavnega mesta za Oct1. Pri uspešni vezavi sponke na oba plazmida pride do prostorske bližine donorja in akceptorja, kar omogoči meritev FRET signala, kot dokaz učinkovitega približanja plazmidov. FRET signal je povečana fluorescenčna emisija akceptorja (mScarlet-I), ki ni posledica njegovega neposrednega vzbujanja, temveč prenosa energije z donorja (mNeonGreen). Kot pozitivno kontrolo so uporabili fuzijo mNeonGreen-mScarlet-I, kot negativno pa plazmid brez ponovitev vezavnega mesta za Oct1. Pokazali so, da nižja koncentracija IPTG vodi v višjo FRET učinkovitost, kar so pripisali manjši celični obremenitve. Pozitivna kontrola je pokazala najvišji FRET signal, medtem ko je bila testna sponka značilno učinkovitejša od negativne kontrole. To je potrdilo uspešno delovanje sistema za prostorsko povezovanje DNA v bakterijskih celicah.

Zarja Weingerl: Created page with "=='''Motivacija'''== Vse celice v našem telesu vsebujejo enako DNA zaporedje, vendar tega zelo različno interpretirajo, odvisno od 3D organizacije genoma. To vodi do različnih celičnih fenotipov in v nekaterih primerih določa celo razliko med zdravjem in boleznijo. Znanstveniki se večinoma osredotočajo na spreminjanje zaporedja genoma in pogosto zanemarijo vpliv njegove 3D organizacije. Ekipa iz Heidelberga se je zato s svojim projektom osredotočala na ustvarjanj..."

2025-05-19T19:35:35Z

Created page with "=='''Motivacija'''== Vse celice v našem telesu vsebujejo enako DNA zaporedje, vendar tega zelo različno interpretirajo, odvisno od 3D organizacije genoma. To vodi do različnih celičnih fenotipov in v nekaterih primerih določa celo razliko med zdravjem in boleznijo. Znanstveniki se večinoma osredotočajo na spreminjanje zaporedja genoma in pogosto zanemarijo vpliv njegove 3D organizacije. Ekipa iz Heidelberga se je zato s svojim projektom osredotočala na ustvarjanj..."

New page

=='''Motivacija'''==
Vse celice v našem telesu vsebujejo enako DNA zaporedje, vendar tega zelo različno interpretirajo, odvisno od 3D organizacije genoma. To vodi do različnih celičnih fenotipov in v nekaterih primerih določa celo razliko med zdravjem in boleznijo. Znanstveniki se večinoma osredotočajo na spreminjanje zaporedja genoma in pogosto zanemarijo vpliv njegove 3D organizacije. Ekipa iz Heidelberga se je zato s svojim projektom osredotočala na ustvarjanje novih interakcij DNA-DNA, ki so jim omogočale manipulacijo s 3D strukturo genoma. Ustvarili so PICasSO (Plasmid-Integrated Cas-Stapled Origami), nabor orodij za preurejanje 3D arhitekture genoma, z doslej neprimerljivo prostorsko natančnostjo.

=='''Zasnova projekta'''==
Sistem PICasSO je zasnovan na bivalentnem CRISPR/dCas sistemu, ki je povezan preko fuzijske usmerjevalne RNA (fgRNA). Bivalenten CRISPR/dCas sistem sestavljata katalitično neaktivna Cas proteina dCas9 in dCas12a, ki ju v celico dostavimo preko enega plazmida. Kompleks nastane, ko se oba proteina Cas povežeta preko fuzijske usmerjevalne RNA (fgRNA), pri čemer nastane trojni CRISPR/Cas kompleks, imenovan Cas-sponka. Vsak od proteinov dCas, ki sestavljata Cas-sponko, se bo vezal na specifično mesto na DNA, kar bo privedlo do prostorskega približanja teh dveh mest.

=='''Aplikacije'''==
V evkariontskih celicah imamo ogromno regulacijskih elementov, kot so ojačevalna zaporedja (enhancer) in utiševalna zaporedja (silencer), ki preko mediatorjev uravnavajo izražanje genov. PICasSo posnema funkcijo mediatorja in s približanjem ojačevalnega zaporedja in promotorja inducira in uravnava izražanje specifičnih genov. Lahko pa tudi blokira dostop ojačevalnega zaporedja do TATA-sekvence promotorja in tako prepreči izražanje izbranega gena. Poleg posnemanja naravnih sistemov omogoča PICasSO tudi inženiring povsem novih regulacijskih arhitektur genoma, s tem ko na natančno določene lokacije pripelje umetne regulacijske elemente. Ta sintetični način nadzora omogoča natančno uravnavanje izražanja genov ter modeliranje bolezni, katerih mehanizmi izvirajo iz motene 3D organizacije genoma (npr. rak).

Sistem PICasSO omogoča približevanje tako cis- kot trans- regulacijskih elementov genoma, ter dovoljuje uporabo večjega števila Cas-sponk hkrati, kar omogoča multipleksiranje. Z enkratnim vnosom genov, ki kodirata dCas9 in dCas12a, lahko tako vzpostavimo povezave med več izbranimi pari lokusov le z dodajanjem različnih fgRNA. Vsaka fgRNA namreč kodira dve natančno določeni tarči na DNA , ki ju želimo prostorsko približati. Zmožnost multipleksiranja tako omogoča obsežne prostorske prerazporeditve funkcionalnih DNA elementov znotraj 3D genoma, kar odpira nova vrata za sintetično biologijo, gensko terapijo in še mnogo več.

Ena izmed pomembnih aplikacij sistema je modeliranje pojava enhancer hijacking. Gre za pojav, ki je razširjen pri mnogih oblikah raka. Pri enhancer hijacking pride do prekomerne aktivacije (onko)gena, ki jo povzroči oddaljeno ojačevalno zaporedje, ko se zaradi preoblikovanja 3D-strukture genoma znajde v prostorski bližini (onko)gena. Do sedaj je bilo ta mehanizem zelo težko raziskovati, zaradi pomanjkanja učinkovitih orodij za nadzor prostorske bližine, med genetskimi regijami v živih celicah. Ekipi pa je z uporabo modela DaVinci za načrtovanje specializiranih Cas-sponk uspelo ustvariti sintetični enhancer hijacking in ga eksperimentalno potrditi v celicah HEK293T. To je prvi tovrstni poskus s prilagodljivim in večnamenskim pristopom. To odpira vrata nadaljnjemu raziskovanju bolezni in razvoju natančne genske terapije.

=='''Eksperimentalno delo'''==
Za učinkovito kloniranje različnih vmesnikov, ki vsebujejo ''crRNA'' Cas12a, linker in ''crRNA'' SpCas9, je ekipa zasnovala vhodni vektor, ki vključuje promotor U6, ''tracrRNA'' Cas12a, bakterijski promotor za izražanje gena ccdB in ''tracrRNA'' SpCas9. Uspešna integracija vmesnika vodi do odstranitve gena ccdB, kar omogoča rast bakterij in tako služi kot pokazatelj uspešnega kloniranja.

Ekipa je najprej testirala delovanje fgRNA s katalitsko aktivnimi Cas proteini Cas9 in Cas12a v sesalskih celicah HEK293-T. Fuzijsko usmerjevalno RNA (fgRNA) so zasnovali s kombinacijo sgRNA iz SpCas9 in crRNA iz Cas12a. Kot tarči za Cas12a in Cas9 sta bila izbrana gena VEGFA in FANCF. Vsak od izbranih tarčnih genov je bil nato testiran z vsakim katalitsko aktivnim proteinom Cas. Učinkovitost urejanja je bila analizirana s pomočjo T7 endonukleaze I. Kot pozitivne kontrole so bile uporabljene posamezne sgRNA, kot negativne kontrole pa netarčne usmerjevalne RNA. Visoko stopnjo urejanja genoma so zaznali pri uporabi posameznih sgRN, opazili pa so tudi urejanje pri fgRNA. Ti rezultati so potrdili, da fgRNA omogoča učinkovito urejanje genoma in je zato primerna za nadaljnje testiranje.

Sledilo je testiranje katalitsko neaktivnih dCas. V svojem eksperimentu so uporabili dCas9 z vezanim aktivatorjem VP64. Pripravili so fgRNA, ki so vsebovale ''crRNA'' dMbCas12a, usmerjeno proti tetO zaporedju, ter ne ciljno ''crRNA'' dCas9. Zaporedje TetO je bilo nameščeno pred minimalnim promotorjem in genom za luciferazo. Ob vezavi dMbCas12a na tetO so pričakovali povečano izražanje luciferaze na račun prisotnosti aktivatorja VP64, v bližini promotorja. Žal nobena od testiranih fgRNA konstrukcij, razen pozitivne kontrole, ni povzročila spremembe v izražanju luciferaze.

Pripravili so tudi eksperiment, v katerem so testirali, ali lahko fgRNA hkrati veže dva dCas proteina in tako poveže dva ločena DNA fragmenta ter povzroči trans-aktivacijo želenega gena. Uporabili so reporterski plazmid z genom za luciferazo in ojačevalni plazmid z vezavnim mestom za Gal4-VP64. Ob povezavi teh dveh plazmidov s Cas-sponko so pričakovali, da bo prišlo do večjega izražanja luciferaze zaradi aktivatorja VP64. Pri uporabi posameznih dCas proteinov se je z daljšanjem linkerja v fgRNA povečala luminiscenca, kar pomeni boljšo učinkovitost. Pri fuzijskih dCas proteinih pa je bila skupna aktivnost nižja, najboljše rezultate so dosegli pri srednje dolgih linkerjih (20–30 nt).

Za kvantitativno oceno učinkovitosti Cas-sponk so razvili FRET (Fluorescenčni resonančni prenos energije) sistem, ki omogoča merjenje bližine med DNA regijami v živih celicah. FRET analiza je bila razvita z uporabo dvo-plazmidnega sistema v bakterijskih celicah E. coli. Ekspresijski plazmid je vseboval zapise za: fuzirana proteina tetR-Oct1(sponka), Oct1-mNeonGreen (FRET donor), tetR-mScarlet-I (FRET akceptor) pod kontrolo T7 promotorja in 15 ponovitev tetR vezavnega motiva. Drug plazmid pa je vseboval 15 ponovitev vezavnega mesta za Oct1. Pri uspešni vezavi sponke na oba plazmida pride do prostorske bližine donorja in akceptorja, kar omogoči meritev FRET signala, kot dokaz učinkovitega približanja plazmidov. FRET signal je povečana fluorescenčna emisija akceptorja (mScarlet-I), ki ni posledica njegovega neposrednega vzbujanja, temveč prenosa energije z donorja (mNeonGreen). Kot pozitivno kontrolo so uporabili fuzijo mNeonGreen-mScarlet-I, kot negativno pa plazmid brez ponovitev vezavnega mesta za Oct1. Pokazali so, da nižja koncentracija IPTG vodi v višjo FRET učinkovitost, kar so pripisali manjši celični obremenitve. Pozitivna kontrola je pokazala najvišji FRET signal, medtem ko je bila testna sponka značilno učinkovitejša od negativne kontrole. To je potrdilo uspešno delovanje sistema za prostorsko povezovanje DNA v bakterijskih celicah.

=='''DaVinci'''==
Ker je inženiring genoma zelo zahteven proces, se je ekipa odločila optimizirati dizajn Cas-sponk z uporabo orodja za modeliranje DaVinci (the Digital Architecture for Visualization and Integration of Novel Interactions). To omogoča iskanje optimalnih proteinskih sponk za želeni dizajn. DaVinci združuje orodja AlphaFold3, GROMACS in oxDNA v enoten sistem, s katerim lahko dinamično ocenjujemo interakcije med proteini in DNA, tako na makroskopski kot atomski ravni. Sistem raziskovalcem omogoča vnos parametrov, kot so ciljna zaporedja, temperatura in koncentracija soli, ter tako napove izvedljivost spenjanja določenih regij DNA v prilagojenih eksperimentalnih pogojih. DaVinci je bistveno pospešil načrtovanje in optimizacijo PICasSO sponk ter omogočil njihovo uporabo v praksi. Njegova validacija je bila izvedena z uporabo eksperimentalnih podatkov in dodatnih podatkov iz literature.

=='''Zaključek'''==
Za zagotavljanje široke uporabnosti sistema PICasSO je ekipa predstavila zbirko standardiziranih gradnikov in testov za sestavo in preverjanje učinkovitosti različnih Cas-sponk, vključno z referenčnimi kontrolami. Ključni del sistema predstavljata testa EMSA, ki omogoča izračun vezavne afinitete Cas-sponk in FRET za spremljanje interakcij DNA-DNA v živih celicah. Vse komponente se v celico dostavijo z enim plazmidom, kar sicer poenostavi vnos, vendar lahko zaradi velikosti konstrukta predstavlja izziv. Zato si ekipa v prihodnje prizadeva razviti nov način prenosa na osnovi bakterijske konjugacije okrepljen z nanotelesi za ciljno dostavo.

=='''Viri in literatura'''==
[1] PICasSO - Plasmid-Integrated Cas-Stapled Origami https://2024.igem.wiki/heidelberg/