Pilus+ - Revision history

Tinasimunovic: /* Reaktor za vezavo kovin */

2018-01-15T19:27:07Z

Reaktor za vezavo kovin

← Older revision		Revision as of 19:27, 15 January 2018
Line 59:		Line 59:
	=== Reaktor za vezavo kovin ===		=== Reaktor za vezavo kovin ===

	Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski ~~odrski~~ obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.		Reaktor vsebuje tekoče gojišče z ''E.coli'' in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. ''E. coli'' rastejo na polipropilenski stopničasto obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.

	=== Mehanizem za biovarnost ===		=== Mehanizem za biovarnost ===

Tinasimunovic: /* Sestavljanje konstruktov */

2018-01-15T18:53:25Z

Sestavljanje konstruktov

← Older revision		Revision as of 18:53, 15 January 2018
Line 25:		Line 25:
	Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.		Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.

	Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, prisotnost na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.		Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo z IPTG inducirajočega promotorja T7, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, prisotnost na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.

	Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je ob dodatku 2 % ramnoze izražal v vseh štirih sevih. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.		Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je ob dodatku 2 % ramnoze izražal v vseh štirih sevih. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.

Tinasimunovic: /* Sestavljanje konstruktov */

2018-01-15T18:49:22Z

Sestavljanje konstruktov

← Older revision		Revision as of 18:49, 15 January 2018
Line 23:		Line 23:
	=== Sestavljanje konstruktov ===		=== Sestavljanje konstruktov ===

	Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in ~~hkrati~~ preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.		Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.

	Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, prisotnost na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.		Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, prisotnost na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.

Tinasimunovic: /* Mehanizem za biovarnost */

2018-01-14T18:19:33Z

Mehanizem za biovarnost

← Older revision		Revision as of 18:19, 14 January 2018
Line 64:		Line 64:

	Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje.		Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje.
	Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % ~~bakterija~~, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon		Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterij, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni, da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon

	== Model ==		== Model ==

Tinasimunovic: /* Uporaba konstruktov */

2018-01-14T14:28:12Z

Uporaba konstruktov

← Older revision		Revision as of 14:28, 14 January 2018
Line 51:		Line 51:

	Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji.		Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji.
	Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili ~~tro~~-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.		Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tri-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.

	=== Hidrociklon ===		=== Hidrociklon ===
Line 65:		Line 65:
	Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje.		Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje.
	Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterija, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon		Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterija, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon


	== Model ==		== Model ==

Tinasimunovic: /* Biološki deli */

2018-01-14T13:50:50Z

Biološki deli

← Older revision		Revision as of 13:50, 14 January 2018
Line 35:		Line 35:
	Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), z IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator.		Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), z IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator.

	Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies ~~IDT~~ kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.		Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.

	== Dvoplazmidni sistem ==		== Dvoplazmidni sistem ==

Tinasimunovic: /* Biološki deli */

2018-01-14T12:27:42Z

Biološki deli

← Older revision		Revision as of 12:27, 14 January 2018
Line 33:		Line 33:
	Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018]).		Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324002 BBa_K2324002]), FimH_225_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324001 BBa_K2324001]) in FimH_258_sfGFP ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324003 BBa_K2324003]). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324014 BBa_K2324014]), FimH_1_SynMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324004 BBa_K2324004]) in FimH_1_MouseMT ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324005 BBa_K2324005]) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon ''fim'', ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324016 BBa_K2324016], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324017 BBa_K2324017], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2324018 BBa_K2324018]).

	Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator.		Za [http://2017.igem.org/Team:Exeter/Composite_Part sestavljene dele] so uporabili pet promotorjev: T7 promoter ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614000 BBa_K1614000]),P_Rha ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K902065 BBa_K902065]), P_ara ([http://parts.igem.org/Part:BBa_I13453 BBa_I13453]), z IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 BBa_J23100]). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015] pa je služil kot dvojni terminator.

	Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies IDT kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.		Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies IDT kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon ''fim'' pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.


	== Dvoplazmidni sistem ==		== Dvoplazmidni sistem ==

Tinasimunovic: /* Sestavljanje konstruktov */

2018-01-14T11:33:40Z

Sestavljanje konstruktov

← Older revision		Revision as of 11:33, 14 January 2018
Line 27:		Line 27:
	Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, prisotnost na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.		Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, prisotnost na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.

	Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je v ~~primeru transformacije~~ vseh štirih ~~sevov izražal~~. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.		Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je ob dodatku 2 % ramnoze izražal v vseh štirih sevih. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.

	=== Biološki deli ===		=== Biološki deli ===

Tinasimunovic: /* Sestavljanje konstruktov */

2018-01-14T11:29:10Z

Sestavljanje konstruktov

← Older revision		Revision as of 11:29, 14 January 2018
Line 25:		Line 25:
	Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in hkrati preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.		Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in hkrati preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon ''fim'' pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih ''fimH'' (in wt ''fimH'') pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.

	Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, ~~nahajane~~ na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.		Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta '''T7_FimH_225_sfGFP''' - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, prisotnost na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.

	Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je v primeru transformacije vseh štirih sevov izražal. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.		Konstrukt '''P_Rha_FimH_1_His''', ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je v primeru transformacije vseh štirih sevov izražal. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.

Tinasimunovic at 11:08, 14 January 2018

2018-01-14T11:08:00Z

← Older revision		Revision as of 11:08, 14 January 2018
Line 15:		Line 15:

	S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).		S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).



	=== Izbira šasije ===		=== Izbira šasije ===



	Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.		Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve ''E.coli'', ki so jih testirali na prisotnost operona ''fim''. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona ''fim''. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.