PowerLeaf – bakterijska solarna baterija - Revision history

Barbara Lipovšek: /* Razgradnja celuloze */

2018-01-22T20:06:13Z

Razgradnja celuloze

← Older revision		Revision as of 20:06, 22 January 2018
Line 23:		Line 23:
	Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.		Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

	Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A'') do glukoze. Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim ([http://parts.igem.org/Part:pSB3K3 pSB3K3]) kot tudi z visokim številom kopij ([http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3]), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten ~~tako~~ v celičnem lizatu ~~kot tudi v mediju~~ ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD<sub>600</sub> = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD<sub>600</sub> = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.		Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A'') do glukoze. Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim ([http://parts.igem.org/Part:pSB3K3 pSB3K3]) kot tudi z visokim številom kopij ([http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3]), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten v celičnem lizatu ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD<sub>600</sub> = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD<sub>600</sub> = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

	=== Zunajcelični prenos elektronov ===		=== Zunajcelični prenos elektronov ===

Barbara Lipovšek: /* ZAKLJUČEK */

2018-01-22T18:08:11Z

ZAKLJUČEK

← Older revision		Revision as of 18:08, 22 January 2018
Line 30:		Line 30:
	== ZAKLJUČEK ==		== ZAKLJUČEK ==

	Namen tega projekta je bil razviti alternativo trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi ~~razvili~~ napravo~~, sestavljeno~~ iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale ~~onesnažila~~ iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.		Namen tega projekta je bil razviti alternativo trenutnim virom energije. Ekipa si v prihodnje želi, da bi to napravo dejansko izdelali. Sestavljena naj bi bila iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnaževalce iz okolja, kar bi poleg pridobivanja trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

	== VIRI ==		== VIRI ==

Barbara Lipovšek: /* Razgradnja celuloze */

2018-01-22T17:46:11Z

Razgradnja celuloze

← Older revision		Revision as of 17:46, 22 January 2018
Line 23:		Line 23:
	Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.		Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

	Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim ([http://parts.igem.org/Part:pSB3K3 pSB3K3]) kot tudi z visokim številom kopij ([http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3]), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD<sub>600</sub> = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD<sub>600</sub> = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.		Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A'') do glukoze. Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim ([http://parts.igem.org/Part:pSB3K3 pSB3K3]) kot tudi z visokim številom kopij ([http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3]), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD<sub>600</sub> = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD<sub>600</sub> = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

	=== Zunajcelični prenos elektronov ===		=== Zunajcelični prenos elektronov ===

Barbara Lipovšek: /* Fiksacija ogljika */

2018-01-22T17:04:14Z

Fiksacija ogljika

← Older revision		Revision as of 17:04, 22 January 2018
Line 6:		Line 6:
	== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==		== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
	=== Fiksacija ogljika ===		=== Fiksacija ogljika ===
	Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptoloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibolokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz operona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je ~~majhen organel~~, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO<sup>3-</sup> do CO<sub>2</sub>, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze.<br />		Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptoloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibolokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz operona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je mikrokompartment, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO<sup>3-</sup> do CO<sub>2</sub>, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze.<br />
	Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.		Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
	Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.		Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

Barbara Lipovšek: /* Fiksacija ogljika */

2018-01-22T17:02:19Z

Fiksacija ogljika

← Older revision		Revision as of 17:02, 22 January 2018
Line 6:		Line 6:
	== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==		== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
	=== Fiksacija ogljika ===		=== Fiksacija ogljika ===
	Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptoloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibolokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz ~~oparona~~ ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO<sup>3-</sup> do CO<sub>2</sub>, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze.<br />		Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptoloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibolokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz operona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO<sup>3-</sup> do CO<sub>2</sub>, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze.<br />
	Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.		Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
	Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.		Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

Barbara Lipovšek: /* Fiksacija ogljika */

2018-01-22T17:01:47Z

Fiksacija ogljika

← Older revision		Revision as of 17:01, 22 January 2018
Line 6:		Line 6:
	== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==		== ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE ==
	=== Fiksacija ogljika ===		=== Fiksacija ogljika ===
	Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), ~~sedoheptuloza~~ 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in ~~fosforibulokinaza~~ A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO<sup>3-</sup> do CO<sub>2</sub>, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze.<br />		Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v ''E. coli'' vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V ''E. coli'' so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v ''E. coli'' potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptoloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibolokinaza A (PRK). Zaradi optimizacije fiksacije ogljika, so nameravali v ''E. coli'' vnesti še gene iz oparona ''cso'' bakterije ''Halothiobacillus neapolitanus'', ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in karboanhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO<sup>3-</sup> do CO<sub>2</sub>, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze.<br />
	Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.		Dva biološka dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465214 BBa_K1465214] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465228 BBa_K1465228], ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla, so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili.
	Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.		Uspeli pa so združiti dela [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465204 BBa_K1465204] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1465209 BBa_K1465209] v kompozit [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2449030 BBa_K2449030], kjer se nahajajo vsi geni operona ''cso'' za tvorbo karboksisoma, ni pa jim uspelo vstaviti promotorja Tac, zato so tudi to nalogo opustili.

Barbara Lipovšek: /* VIRI */

2018-01-22T16:24:28Z

VIRI

← Older revision		Revision as of 16:24, 22 January 2018
Line 33:		Line 33:

	== VIRI ==		== VIRI ==
	- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark<br />		- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark (22. 1. 2018) <br />
	- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of ''Gluconacetobacter hansenii'' at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. <br />		- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of ''Gluconacetobacter hansenii'' at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. <br />
	- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO<sub>2</sub> concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. <br />		- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO<sub>2</sub> concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. <br />
	- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.<br />		- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.<br />

Barbara Lipovšek: /* Razgradnja celuloze */

2018-01-22T16:23:12Z

Razgradnja celuloze

← Older revision		Revision as of 16:23, 22 January 2018
Line 23:		Line 23:
	Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.		Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v ''E. coli'' so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija, izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

	Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD<sub>600</sub> = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD<sub>600</sub> = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.		Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen ''cep94A''). Zapis ''cep94A'' so vstavili tako v plazmid s srednjim ([http://parts.igem.org/Part:pSB3K3 pSB3K3]) kot tudi z visokim številom kopij ([http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3]), obakrat pod kontolo promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu kot tudi v mediju ne glede na število kopij plazmida. ''E. coli'' z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Kot kontrola so služile ''E. coli'' s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A, je dosegla po 48 urah vrednost OD<sub>600</sub> = 0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s ''cep94A'' pa je po 72 urah dosegla vrednost OD<sub>600</sub> = 0,9. Ugotovili so tudi, da so ''E. coli'' rasle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

	=== Zunajcelični prenos elektronov ===		=== Zunajcelični prenos elektronov ===

Barbara Lipovšek: /* Sinteza celuloze */

2018-01-22T16:21:50Z

Sinteza celuloze

← Older revision		Revision as of 16:21, 22 January 2018
Line 11:		Line 11:

	=== Sinteza celuloze ===		=== Sinteza celuloze ===
	Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. <br />Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.		Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo treba v ''E. coli'' vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon ''acsABCD''. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celuloze v sevu ''E. coli'' MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma. <br />Najprej so želeli prenesti celoten operon ''acsABCD'' v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1C3 pSB1C3], gena ''acsC'' in ''acsD'' pa v vektor [http://parts.igem.org/Part:pSB1A3 pSB1A3], obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili.
	Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom »fluorescent brightener 28«, ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.		Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom »fluorescent brightener 28«, ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV-svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze verjetno videli modro barvo.

Barbara Lipovšek: /* VIRI */

2018-01-22T16:20:21Z

VIRI

← Older revision		Revision as of 16:20, 22 January 2018
Line 36:		Line 36:
	- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of ''Gluconacetobacter hansenii'' at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. <br />		- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of ''Gluconacetobacter hansenii'' at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24. <br />
	- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO<sub>2</sub> concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. <br />		- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO<sub>2</sub> concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043. <br />
	- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. ~~Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling~~ Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.<br />		- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe (III) -Reducing Organism ''Geobacter sulfurreducens'' by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.<br />