Andreja Habič at 15:22, 30 April 2020

2020-04-30T15:22:55Z

Andreja Habič at 11:02, 18 March 2020

2020-03-18T11:02:30Z

← Older revision		Revision as of 11:02, 18 March 2020
Line 67:		Line 67:

	==== IN-NE ====		==== IN-NE ====
	Z logičnimi vrati IN-NE lahko v celice vnesemo program, ki bo vrnil izhodni signal VKLOP le v primeru, ko celice zaznajo natanko en, specifičen vhodni signal. V primeru eritromicina in floretina imamo dve možnosti takšnih vrat: eritromicin IN-NE floretin in floretin IN-NE eritromicin<sup>1</sup>.		Z logičnimi vrati IN-NE (''angl.'' N-IMPLY) lahko v celice vnesemo program, ki bo vrnil izhodni signal VKLOP le v primeru, ko celice zaznajo natanko en, specifičen vhodni signal. V primeru eritromicina in floretina imamo dve možnosti takšnih vrat: eritromicin IN-NE floretin in floretin IN-NE eritromicin<sup>1</sup>.

	Logična vrata eritromicin IN-NE floretin delujejo podobno kot logična vrata NE, le da sta poti eritromicina in floretina sklopljeni. TtgA<sub>1</sub> se izraža konstitutivno in nadzira transkripcijo konstrukta C/D<sub>box</sub>-d2EYFP-p(A). ET1 nadzira izražanje proteina L7Ae, ki prepoznava motiv C/D<sub>box</sub> in s tem prepreči translacijo konstrukta C/D<sub>box</sub>-d2EYFP-p(A). Reporterski protein se tako lahko izraža le v primeru, da eritromicin utiša izražanje L7Ae, delovanje TtgA<sub>1</sub> pa zaradi odsotnosti floretina ni moteno<sup>1</sup> (tabela 3).		Logična vrata eritromicin IN-NE floretin delujejo podobno kot logična vrata NE, le da sta poti eritromicina in floretina sklopljeni. TtgA<sub>1</sub> se izraža konstitutivno in nadzira transkripcijo konstrukta C/D<sub>box</sub>-d2EYFP-p(A). ET1 nadzira izražanje proteina L7Ae, ki prepoznava motiv C/D<sub>box</sub> in s tem prepreči translacijo konstrukta C/D<sub>box</sub>-d2EYFP-p(A). Reporterski protein se tako lahko izraža le v primeru, da eritromicin utiša izražanje L7Ae, delovanje TtgA<sub>1</sub> pa zaradi odsotnosti floretina ni moteno<sup>1</sup> (tabela 3).

Andreja Habič: New page: Prenos informacij v sodobnih elektronskih napravah poteka s pomočjo elektronov, vhodne signale pa obdelajo in uskladijo binarna logična vrata znotraj stikalne plošče. To omogoča enost...

2020-03-16T16:47:11Z

New page: Prenos informacij v sodobnih elektronskih napravah poteka s pomočjo elektronov, vhodne signale pa obdelajo in uskladijo binarna logična vrata znotraj stikalne plošče. To omogoča enost...

New page

Prenos informacij v sodobnih elektronskih napravah poteka s pomočjo elektronov, vhodne signale pa obdelajo in uskladijo binarna logična vrata znotraj stikalne plošče. To omogoča enostavno izvrševanje poljubnih algoritmov in s tem izdelavo računalnikov z visoko zmogljivostjo procesiranja. Računalnikom podobne »naprave« pa najdemo že tudi v naravi: celice, ki neprestano izvajajo veliko število fizioloških procesov, s katerimi usklajujejo zunaj- in znotrajcelične signale ter skrbijo za pravilno odzivanje oz. izhodne signale. To jim omogočajo genetska vezja, ki za razliko od električnih za prenos informacij uporabljajo kemične signale1,2.

Sintezna biologija je s standardiziranim in skrbno načrtanim sestavljanjem delov genetskih vezij, ki temeljijo na inducibilnem nadzoru transkripcije in translacije v celici, močno pospešila napredek pri izdelavi zahtevnejših sintetičnih vezij z želenimi lastnostmi. Sintetična vezja pa so uporabna šele, ko jih vgradimo v celice, pri čemer se je izkazalo, da lahko za to uporabimo tako bakterije in kvasovke kot tudi sesalske celice. Napoved, kako se bodo komponente genetskih vezij v celici obnašale, je praktično nemogoča, še posebej če je komponent veliko – delovati morajo neodvisno ena od druge in povsem ločeno od celičnega metabolizma. Poenostavljeno lahko posamezne komponente vezja vgradimo v ločene celice, ki se med seboj sporazumevajo z zunajceličnimi signali, pripravljeni pa so bili že tudi povsem samostojni enocelični bioračunalniki1,3,4.

== Priprava enoceličnih sesalskih bioračunalnikov ==
Leta 2012 je skupina iz Švice pripravila serijo enoceličnih sesalskih bioračunalnikov s sposobnostjo procesiranja dveh vhodnih signalov naenkrat. S kombiniranjem regulatorjev transkripcije in translacije so ustvarili logična vrata NE, IN, NE-IN, IN-NE in IZKLJUČUJOČI ALI, z nadaljnjim kombiniranjem logičnih vrat pa so sestavili tudi polovični odštevalnik in polovični seštevalnik. Sintetična genetska vezja so vnesli v človeške embrionalne ledvične celice (HEK 293) s prehodno kotransfekcijo z do sedmimi ločenimi vektorskimi konstrukti hkrati. Transfeciranim celicam so dodali vhodna signala in po 62 urah merili izhodni signal z ločevalnikom fluorescenčno označenih celic (FACS)1.

=== Osnovne komponente vezij ===
Vezja so v osnovi sestavljena iz treh delov, in sicer iz vhodnih signalov, enote za obdelavo podatkov in vsaj enega izhodnega signala. V opisani študiji sta bila vhodna signala dve organski molekuli: antibiotik '''eritromicin''' in fenol iz listov jablane, '''floretin''', izhodna signala pa dva reporterska proteina: labilen rumeni fluorescenčni protein '''d2EYFP''' in labilen rdeči fluorescenčni protein '''dsRed'''1.

Obdelava podatkov je potekala tako na ravni transkripcije kot translacije. Transkripcijo so nadzirali z uporabo dveh sintetičnih transkripcijskih aktivatorjev, ki sta sestavljena iz transaktivacijske domene, ki prepoznava vhodni signal, in iz DNA-vezavnega motiva, ki prepoznava specifičen minimalni promotor oz. njegovo operatorsko regijo: od eritromicina odvisen transaktivator '''ET1''', ki se veže na promotor '''PERT2''', in od floretina odvisen transaktivator '''TtgA1''', ki se veže na promotor '''PTtgR1'''. Oba transaktivatorja se vežeta in spodbujata transkripcijo v odsotnosti kemičnega signala, v prisotnosti pa ne. Za uravnavanje translacije so izbrali dva RNA-vezavna proteina: bakteriofagni plaščni protein '''MS2''', ki se veže na RNA-motiv '''MS2box''', in ribosomalni protein '''L7Ae''' iz arhej, ki prepoznava RNA-motiv '''C/Dbox'''. Zapisa za motiva MS2box in C/Dbox se v vezjih nahajata navzgor od zapisov za reporterska proteina in sta po transkripciji del 5'-neprevedene regije mRNA. Vezava RNA-vezavnega proteina na tarčni RNA-motiv tako onemogoči translacijo reporterskega proteina1.

=== Logične operacije ===
Premišljena kombinatorika le štirih transkripcijskih oz. translacijskih regulatornih parov znotraj enote za procesiranje je omogočila pripravo različnih vezij z do šestimi enotami za izražanje. Prisotnost (1) ali odsotnost (0) eritromicina in/ali floretina da merljiv izhodni signal VKLOP (1) ali IZKLOP (0), v primeru sestavljanja logičnih vrat pa seštevek oz. razliko vhodnih signalov1.

==== NE ====
Logična vrata NE so bila pripravljena za vsako izmed vhodnih molekul posebej in so dejansko odvisna le od enega izmed obeh vhodnih signalov. Vezje NE-floretin je tako sestavljeno iz transaktivatorja TtgA1, ki se izraža konstitutivno. V odsotnosti floretina se TtgA1 veže na operator promotorja PTtgR1 in aktivira transkripcijo konstrukta C/Dbox-d2EYFP-p(A), pri čemer p(A) predstavlja poliadenilacijski signal. Drugi vhodni signal, eritromicin, prek transaktivatorja ET1 nadzira izražanje proteina MS2, ki pa motiva C/Dbox ne prepoznava – poti med seboj nista sklopljeni. Reporterski protein d2EYFP se torej izraža v odsotnosti floretina in prisotnosti ali odsotnosti eritromicina, v prisotnosti floretina pa ne1 (tabela 1).
{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 1: Pravilnostna tabela NE-floretin.
! style="width: 90px; background: #B3C88A;"|eritromicin
! style="width: 90px; background: #B3C88A;"|floretin
! style="width: 90px; background: #B3C88A;"|d2EYFP
|-
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |1
|-
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |1
|-
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |0
|-
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |0
|}

Ker pari uporabljenih transkripcijskih in translacijskih regulatorjev delujejo na enak način, je vezje NE-eritromicin v osnovi enako kot vezje NE-floretin, le da vlogo TtgA1 nadomesti ET1, ki nadzira prepis konstrukta MS2box-d2EYFP-p(A), TtgA1 pa deluje v neodvisni poti, ki nadzira izražanje L7Ae1.

==== IN ====
Logična vrata IN so iz dveh medsebojno povezanih delov. Konstitutivno izražen TtgA1 aktivira izražanje MS2, konstitutivno izražen ET1 pa izražanje L7Ae. Konstitutivno se prepisuje tudi konstrukt MS2box-C/Dbox-dsRed-p(A), katerega translacija je zaradi vezave MS2 in L7Ae na oba RNA-motiva navzgor od zapisa za reporterski protein onemogočena. Šele v primeru odsotnosti obeh RNA-vezavnih proteinov se reporterski protein dejansko izraža – to se zgodi v primeru inaktivacije tako TtgA1 kot ET1, torej v prisotnosti eritromicina in floretina1 (tabela 2).
{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 2: Pravilnostna tabela IN.
! style="width: 90px; background: #B3C88A;"|eritromicin
! style="width: 90px; background: #B3C88A;"|floretin
! style="width: 90px; background: #B3C88A;"|dsRed
|-
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |0
|-
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |0
|-
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |0
|-
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |1
|}

==== IN-NE ====
Z logičnimi vrati IN-NE lahko v celice vnesemo program, ki bo vrnil izhodni signal VKLOP le v primeru, ko celice zaznajo natanko en, specifičen vhodni signal. V primeru eritromicina in floretina imamo dve možnosti takšnih vrat: eritromicin IN-NE floretin in floretin IN-NE eritromicin1.

Logična vrata eritromicin IN-NE floretin delujejo podobno kot logična vrata NE, le da sta poti eritromicina in floretina sklopljeni. TtgA1 se izraža konstitutivno in nadzira transkripcijo konstrukta C/Dbox-d2EYFP-p(A). ET1 nadzira izražanje proteina L7Ae, ki prepoznava motiv C/Dbox in s tem prepreči translacijo konstrukta C/Dbox-d2EYFP-p(A). Reporterski protein se tako lahko izraža le v primeru, da eritromicin utiša izražanje L7Ae, delovanje TtgA1 pa zaradi odsotnosti floretina ni moteno1 (tabela 3).
{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+style="width: 320px; text-align:center" | Tabela 3: Pravilnostna tabela eritromicin IN-NE floretin.
! style="width: 90px; background: #B3C88A;" | eritromicin
! style="width: 90px; background: #B3C88A;" | floretin
! style="width: 90px; background: #B3C88A;" | d2EYFP
|-
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |0
|-
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |1
|-
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |0
|-
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |0
|}

Na enak način delujejo vrata floretin IN-NE eritromicin: ET1 nadzira transkripcijo konstrukta MS2box-d2EYFP-p(A), TtgA1 pa izražanje MS21.

==== IZKLJUČUJOČI ALI ====
IZKLJUČUJOČI ALI je s stališča priprave genetskega vezja še posebej zahteven, saj mora dva vhodna signala uskladiti tako, da dobimo izhodni signal VKLOP samo v primeru, ko je prisotna le ena izmed vhodnih molekul, ne pa, ko sta prisotni obe (tabela 4). Predhodno so bila ta logična vrata pripravljena le v izvenceličnem vezju, ki temelji na obdelavi podatkov z deoksiribocimi5, in prek medcelične komunikacije v bakterijah4 in kvasovkah3. Skupina iz Švice pa je pripravila delujoč IZKLJUČUJOČI ALI v sesalskih celicah tako, da je enostavno združila logična vrata eritromicin IN-NE floretin in floretin IN-NE eritromicin. Vsak izmed transaktivatorjev ima v takšnem vezju dve funkciji: TtgA1 nadzira transkripcijo konstrukta C/Dbox-d2EYFP-p(A) in izražanje MS2, ET1 pa nadzira transkripcijo konstrukta MS2box-d2EYFP-p(A) in izražanje L7Ae. Reporterski protein je še vedno le eden in se prepisuje bodisi iz konstrukta C/Dbox-d2EYFP-p(A) bodisi iz konstrukta MS2box-d2EYFP-p(A), nikoli pa iz obeh hkrati – v odsotnosti obeh vhodnih molekul je translacija obeh mRNA-konstruktov onemogočena z RNA-vezavnima proteinoma, v pristnosti eritromicina in floretina se nobeden izmed mRNA-konstruktov sploh ne prepisuje, v prisotnosti le ene izmed vhodnih molekul pa se izražata en mRNA-konstrukt in en RNA-vezavni protein, ki tega mRNA-konstrukta ne prepoznava1.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 4: Pravilnostna tabela IZKLJUČUJOČI ALI.
! style="width: 90px; background: #B3C88A;" | eritromicin
! style="width: 90px; background: #B3C88A;" | floretin
! style="width: 90px; background: #B3C88A;" | d2EYFP
|-
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |0
|-
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |1
|-
| style="background: #FCFCFC;" |0
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |1
|-
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |1
| style="background: #FCFCFC;" |0
|}

Da bi določili prispevek posameznih komponent vezja k njegovemu obnašanju, so posamične dele odstranili. Po odstranitvi enega izmed zapisov za reporterski gen so nastala logična vrata IN-NE, po odstranitvi enega izmed transaktivatorjev so nastala logična vrata NE, po odstranitvi enega izmed RNA-vezavnih proteinov pa so nastala logična vrata NE-IN, ki vrnejo izhodni signal VKLOP vedno, razen ko sta prisotni obe vhodni signalni molekuli. Ti rezultati poudarjajo predvidljivost uporabljenih delov in možnost njihovega poljubnega kombiniranja1.

==== Sestavljanje kompleksnejših operacij ====
V elektronskih računalniških vezjih se pogosto uporabljajo tudi operacije, ki dvobitne vhodne signale odštevajo ali seštevajo in vrnejo več kot en izhodni signal. Z uvedbo dveh različnih reporterskih proteinov (d2EYFP in dsRed hkrati) in z nadaljnjim sestavljanjem logičnih vrat IZKLJUČUJOČI ALI in IN-NE so ustvarili sesalske celice, ki so delovale kot '''polovični odštevalniki''' (tabela 5), z združevanjem logičnih vrat IZKLJUČUJOČI ALI in IN pa so celice delovale kot '''polovični seštevalniki''' (tabela 6). To je pomembno, ker lahko s tema dvema operacijama v digitalni elektroniki izvedemo katerokoli drugo, bolj kompleksno operacijo1.

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+Tabela 5: Pravilnostna tabela polovičnega odštevalnika.
! style="width: 150px; background: #B3C88A;" | eritromicin – floretin
! style="width: 120px; background: #B3C88A;" | d2EYFP (razlika)
! style="width: 120px; background: #B3C88A;" | dsRed (sposodek)
|-
| style="width: 150px; background: #FCFCFC;" |0 – 0
| style="width: 120px; background: #FCFCFC;" |0
| style="width: 120px; background: #FCFCFC;" |0
|-
| style="width: 150px; background: #FCFCFC;" |0 – 1
| style="width: 120px; background: #FCFCFC;" |1
| style="width: 120px; background: #FCFCFC;" |1
|-
| style="width: 150px; background: #FCFCFC;" |1 – 0
| style="width: 120px; background: #FCFCFC;" |1
| style="width: 120px; background: #FCFCFC;" |0
|-
| style="width: 150px; background: #FCFCFC;" |1 – 1
| style="width: 120px; background: #FCFCFC;" |0
| style="width: 120px; background: #FCFCFC;" |0
|}
 
{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: none; background: none;"
|+
Tabela 6: Pravilnostna tabela polovičnega seštevalnika.
! style="width: 150px; background: #B3C88A;" | eritromicin + floretin
! style="width: 120px; background: #B3C88A;" | d2EYFP (vsota)
! style="width: 120px; background: #B3C88A;" | dsRed (prenos)
|-
| style="width: 150px; background: #FCFCFC;" | 0 + 0
| style="width: 120px; background: #FCFCFC;" | 0
| style="width: 120px; background: #FCFCFC;" | 0
|-
| style="width: 150px; background: #FCFCFC;" | 0 + 1
| style="width: 120px; background: #FCFCFC;" | 1
| style="width: 120px; background: #FCFCFC;" | 0
|-
| style="width: 150px; background: #FCFCFC;" | 1 + 0
| style="width: 120px; background: #FCFCFC;" | 1
| style="width: 120px; background: #FCFCFC;" | 0
|-
| style="width: 150px; background: #FCFCFC;" | 1 + 1
| style="width: 120px; background: #FCFCFC;" | 0
| style="width: 120px; background: #FCFCFC;" | 1
|}

== Pomen enoceličnih sesalskih bioračunalnikov ==
V predstavljeni študiji pripravljeni enocelični sesalski bioračunalniki so se izkazali za izjemno robustne, logična vezja niso vplivala na preživetje celic, prav tako ni prihajalo do interference med komponentami enote za obdelavo podatkov, zato je bilo celice mogoče enostavno »programirati«1. Napredek v razvoju takšnih bioračunalnikov je izrednega pomena, saj imajo zaradi zmožnosti zaznavanja okolice in proizvajanja želenih izhodnih signalov velik terapevtski potencial – njihova učinkovitost je že bila dokazana tako na celičnih linijah kot na živalskih modelih, in sicer predvsem za zdravljenje bolezni metabolizma6–12 in rakavih obolenj14,15.
== Viri ==
1. Auslände, S., Ausländer, D., Müller, M., Wieland, M. & Fussenegger, M. Programmable single-cell mammalian biocomputers. ''Nature'' '''487''', 123–127 (2012).

2. Bandyopadhyay, S. et al. Rewiring of genetic networks in response to DNA damage. ''Science'' '''330''', 1385–1389 (2010).

3. Regot, S. et al. Distributed biological computation with multicellular engineered networks. ''Nature'' '''469''', 207–211 (2011).

4. Tamsir, A., Tabor, J. J. & Voigt, C. A. Robust multicellular computing using genetically encoded NOR gates and chemical ‘wires’. ''Nature'' '''469''', 212–215 (2011).

5. Stojanović, M. N. & Stefanović, D. Deoxyribozyme-based half-adder. ''J. Am. Chem. Soc.'' '''125''', 6673–6676 (2003).

6. Kemmer, C. et al. Self-sufficient control of urate homeostasis in mice by a synthetic circuit. ''Nat. Biotechnol.'' '''28''', 355–360 (2010).

7. Ye, H., Baba, M. D. El, Peng, R. W. & Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. ''Science'' '''332''', 1565–
1568 (2011).

8. Stanley, S. A. et al. Radio-wave heating of iron oxide nanoparticles can regulate plasma glucose in mice. ''Science'' '''336''', 604–608 (2012).

9. Ye, H. et al. Pharmaceutically controlled designer circuit for the treatment of the metabolic syndrome. ''Proc. Natl. Acad. Sci. USA'' '''110''', 141–146 (2013).

10. Rössger, K., Charpin-El-Hamri, G. & Fussenegger, M. A closed-loop synthetic gene circuit for the treatment of diet-induced obesity in mice. ''Nat. Commun.'' '''4''', 1–9 (2013).

11. Rössger, K., Charpin-El-Hamri, G. & Fussenegger, M. Bile acid-controlled transgene expression in mammalian cells and mice. ''Metab. Eng.'' '''21''', 81–90 (2014).

12. Rössger, K., Hamri, G. C. El & Fussenegger, M. Reward-based hypertension control by a synthetic brain-dopamine interface. ''Proc. Natl. Acad. Sci. USA'' '''110''', 18150–18155 (2013).

13. Nissim, L. & Bar-Ziv, R. H. A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. ''Mol. Syst. Biol.'' '''6''', 444 (2010).

14. Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R. & Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. ''Science'' '''333''', 1307–1311 (2011).

Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki - Revision history

Andreja Habič at 15:22, 30 April 2020

Andreja Habič at 11:02, 18 March 2020

Andreja Habič: New page: Prenos informacij v sodobnih elektronskih napravah poteka s pomočjo elektronov, vhodne signale pa obdelajo in uskladijo binarna logična vrata znotraj stikalne plošče. To omogoča enost...