Proizvodnja funkcionalnega človeškega IL37 v rastlinah - Revision history

Smalensek at 19:22, 11 March 2019

2019-03-11T19:22:14Z

← Older revision		Revision as of 19:22, 11 March 2019
Line 17:		Line 17:
	<h3>Karakterizacija produktov</h3>		<h3>Karakterizacija produktov</h3>

	Pri vzorcih s pro-IL37b je prenos Western pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Količina izraženega proteina je dosegla 1% TSP. Pri maIL-37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (20kDa), izraženega proteina je bilo manj v primerjavi s pro-obliko (0,01% TSP). Pri fuzijski obliki SBA-IL37b so prevladovale lise pri 50kDa (monomer) in nad 75kDa (dimer, trimer, tetramer), nivo izražanja je dosegel 1% TSP. Restrikcija s proteazo TEV je fuzijsko obliko pričakovano in popolnoma razgradila na dve komponenti (SBA in IL-37b).		Pri vzorcih s pro-IL37b je prenos Western pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Količina izraženega proteina je dosegla 1% TSP <ref> TSP: ''Total soluble protein'' - celokupna količina topnih proteinov </ref>. Pri maIL-37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (20kDa), izraženega proteina je bilo manj v primerjavi s pro-obliko (0,01% TSP). Pri fuzijski obliki SBA-IL37b so prevladovale lise pri 50kDa (monomer) in nad 75kDa (dimer, trimer, tetramer), nivo izražanja je dosegel 1% TSP. Restrikcija s proteazo TEV je fuzijsko obliko pričakovano in popolnoma razgradila na dve komponenti (SBA in IL-37b).

	Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.		Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.

Smalensek at 19:17, 11 March 2019

2019-03-11T19:17:18Z

← Older revision		Revision as of 19:17, 11 March 2019
Line 1:		Line 1:
	Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako ~~pro-oblika~~ kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije ~~pro-vnetnih~~ signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva<ref name="prvi">[https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2 N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma, “Production of functional human interleukin 37 using plants.,” Plant Cell Rep., vol. 38, no. 3, pp. 391–401, Mar. 2019]</ref> <ref name="drugi">[https://doi.org/10.3892/ol.2018.7982 L. Wang, Y. Quan, Y. Yue, X. Heng, and F. Che, “Interleukin-37: A crucial cytokine with multiple roles in disease and potentially clinical therapy.,” Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 4711–4719, Apr. 2018.]</ref>.		Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako prooblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije provnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva<ref name="prvi">[https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2 N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma, “Production of functional human interleukin 37 using plants.,” Plant Cell Rep., vol. 38, no. 3, pp. 391–401, Mar. 2019]</ref> <ref name="drugi">[https://doi.org/10.3892/ol.2018.7982 L. Wang, Y. Quan, Y. Yue, X. Heng, and F. Che, “Interleukin-37: A crucial cytokine with multiple roles in disease and potentially clinical therapy.,” Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 4711–4719, Apr. 2018.]</ref>.
	V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic<ref name = "prvi"/>.		V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic<ref name = "prvi"/>.
	<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v ''Nicotiana tabacum''</h2>		<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v ''Nicotiana tabacum''</h2>
Line 21:		Line 21:
	Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.		Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.
	<h2>Rezultati in zaključek</h2>		<h2>Rezultati in zaključek</h2>
	Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, ~~kjer~~ se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.		Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, v katerem se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.
	Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida <ref name="prvi"/>.		Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida <ref name="prvi"/>.
	Kot ~~novo-odkriti~~ protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa možnost platforme za proizvodnjo. Za razliko od bakterijskih kultur so neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini, kompleksne evkariontske post-translacijske modifikacije so omogočene. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name="prvi"/>. Rastline tako predstavljajo cenovno in energijsko ugodnejše možnosti proizvodnje bioloških zdravil <ref name="tretji">[https://dx.doi.org/10.12688%2Ff1000research.8010.1 Q. Chen and K. R. Davis, “The potential of plants as a system for the development and production of human biologics,” F1000Research, vol. 5, p. F1000 Faculty Rev-912, May 2016.]</ref>.		Kot novoodkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa možnost platforme za proizvodnjo. Za razliko od bakterijskih kultur so neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini, kompleksne evkariontske post-translacijske modifikacije so omogočene. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name="prvi"/>. Rastline tako predstavljajo cenovno in energijsko ugodnejše možnosti proizvodnje bioloških zdravil <ref name="tretji">[https://dx.doi.org/10.12688%2Ff1000research.8010.1 Q. Chen and K. R. Davis, “The potential of plants as a system for the development and production of human biologics,” F1000Research, vol. 5, p. F1000 Faculty Rev-912, May 2016.]</ref>.


	<h2>Viri</h2>		<h2>Viri</h2>
	<references/>		<references/>

Smalensek at 18:46, 11 March 2019

2019-03-11T18:46:16Z

← Older revision		Revision as of 18:46, 11 March 2019
Line 23:		Line 23:
	Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.		Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.
	Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida <ref name="prvi"/>.		Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida <ref name="prvi"/>.
	Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa možnost platforme za proizvodnjo. Za razliko od bakterijskih kultur so neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini, kompleksne evkariontske post-translacijske modifikacije so omogočene. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name="prvi"/>. Rastline tako predstavljajo cenovno in energijsko ugodnejše možnosti proizvodnje bioloških zdravil~~, prvo tako zdravilo~~ <ref name="tretji">[https://dx.doi.org/10.12688%2Ff1000research.8010.1 Q. Chen and K. R. Davis, “The potential of plants as a system for the development and production of human biologics,” F1000Research, vol. 5, p. F1000 Faculty Rev-912, May 2016.]</ref>.		Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa možnost platforme za proizvodnjo. Za razliko od bakterijskih kultur so neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini, kompleksne evkariontske post-translacijske modifikacije so omogočene. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name="prvi"/>. Rastline tako predstavljajo cenovno in energijsko ugodnejše možnosti proizvodnje bioloških zdravil <ref name="tretji">[https://dx.doi.org/10.12688%2Ff1000research.8010.1 Q. Chen and K. R. Davis, “The potential of plants as a system for the development and production of human biologics,” F1000Research, vol. 5, p. F1000 Faculty Rev-912, May 2016.]</ref>.


	<h2>Viri</h2>		<h2>Viri</h2>
	<references/>		<references/>

Smalensek at 18:45, 11 March 2019

2019-03-11T18:45:59Z

← Older revision		Revision as of 18:45, 11 March 2019
Line 13:		Line 13:
	Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.		Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.

	Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens ~~(t.i. »''triparental mating''«)~~. Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo ~~(t.i. »''agrobacterium-mediated leaf disc method''«)~~. S vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo <ref name="prvi"/>.		Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens. Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo. Z vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo <ref name="prvi"/>.

	<h3>Karakterizacija produktov</h3>		<h3>Karakterizacija produktov</h3>
Line 23:		Line 23:
	Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.		Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.
	Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida <ref name="prvi"/>.		Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida <ref name="prvi"/>.
	Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa možnost platforme za proizvodnjo. Za razliko od bakterijskih kultur so neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini, kompleksne evkariontske post-translacijske modifikacije so omogočene. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name="prvi"/>. Rastline tako predstavljajo cenovno in energijsko ugodnejše možnosti proizvodnje bioloških zdravil <ref name="tretji">[https://dx.doi.org/10.12688%2Ff1000research.8010.1 Q. Chen and K. R. Davis, “The potential of plants as a system for the development and production of human biologics,” F1000Research, vol. 5, p. F1000 Faculty Rev-912, May 2016.]</ref>.		Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa možnost platforme za proizvodnjo. Za razliko od bakterijskih kultur so neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini, kompleksne evkariontske post-translacijske modifikacije so omogočene. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name="prvi"/>. Rastline tako predstavljajo cenovno in energijsko ugodnejše možnosti proizvodnje bioloških zdravil, prvo tako zdravilo <ref name="tretji">[https://dx.doi.org/10.12688%2Ff1000research.8010.1 Q. Chen and K. R. Davis, “The potential of plants as a system for the development and production of human biologics,” F1000Research, vol. 5, p. F1000 Faculty Rev-912, May 2016.]</ref>.


	<h2>Viri</h2>		<h2>Viri</h2>
	<references/>		<references/>

Smalensek at 18:44, 11 March 2019

2019-03-11T18:44:07Z

← Older revision		Revision as of 18:44, 11 March 2019
Line 1:		Line 1:
	Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva<ref name="prvi">[https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2 N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma, “Production of functional human interleukin 37 using plants.,” Plant Cell Rep., vol. 38, no. 3, pp. 391–401, Mar. 2019]</ref> <ref name="drugi">[https://doi.org/10.3892/ol.2018.7982 L. Wang, Y. Quan, Y. Yue, X. Heng, and F. Che, “Interleukin-37: A crucial cytokine with multiple roles in disease and potentially clinical therapy.,” Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 4711–4719, Apr. 2018.]</ref>.		Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva<ref name="prvi">[https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2 N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma, “Production of functional human interleukin 37 using plants.,” Plant Cell Rep., vol. 38, no. 3, pp. 391–401, Mar. 2019]</ref> <ref name="drugi">[https://doi.org/10.3892/ol.2018.7982 L. Wang, Y. Quan, Y. Yue, X. Heng, and F. Che, “Interleukin-37: A crucial cytokine with multiple roles in disease and potentially clinical therapy.,” Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 4711–4719, Apr. 2018.]</ref>.
	V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic.		V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic<ref name = "prvi"/>.
	Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name = "prvi"/>.

	<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v ''Nicotiana tabacum''</h2>		<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v ''Nicotiana tabacum''</h2>

Line 25:		Line 23:
	Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.		Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.
	Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida <ref name="prvi"/>.		Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida <ref name="prvi"/>.
	Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa ~~ugodnejšo~~ možnost platforme za proizvodnjo.		Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa možnost platforme za proizvodnjo. Za razliko od bakterijskih kultur so neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini, kompleksne evkariontske post-translacijske modifikacije so omogočene. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name="prvi"/>. Rastline tako predstavljajo cenovno in energijsko ugodnejše možnosti proizvodnje bioloških zdravil <ref name="tretji">[https://dx.doi.org/10.12688%2Ff1000research.8010.1 Q. Chen and K. R. Davis, “The potential of plants as a system for the development and production of human biologics,” F1000Research, vol. 5, p. F1000 Faculty Rev-912, May 2016.]</ref>.


	<h2>Viri</h2>		<h2>Viri</h2>
	<references/>		<references/>

Smalensek at 18:36, 11 March 2019

2019-03-11T18:36:08Z

← Older revision		Revision as of 18:36, 11 March 2019
Line 3:		Line 3:
	Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name = "prvi"/>.		Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name = "prvi"/>.

	<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum</h2>		<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v ''Nicotiana tabacum''</h2>

	<h3>Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija</h3>		<h3>Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija</h3>

Smalensek at 18:35, 11 March 2019

2019-03-11T18:35:27Z

← Older revision		Revision as of 18:35, 11 March 2019
Line 1:		Line 1:
	Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva.<ref name="prvi">[https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2 N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma, “Production of functional human interleukin 37 using plants.,” Plant Cell Rep., vol. 38, no. 3, pp. 391–401, Mar. 2019]</ref> <ref name="drugi">[https://doi.org/10.3892/ol.2018.7982 L. Wang, Y. Quan, Y. Yue, X. Heng, and F. Che, “Interleukin-37: A crucial cytokine with multiple roles in disease and potentially clinical therapy.,” Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 4711–4719, Apr. 2018.]</ref>		Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva<ref name="prvi">[https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2 N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma, “Production of functional human interleukin 37 using plants.,” Plant Cell Rep., vol. 38, no. 3, pp. 391–401, Mar. 2019]</ref> <ref name="drugi">[https://doi.org/10.3892/ol.2018.7982 L. Wang, Y. Quan, Y. Yue, X. Heng, and F. Che, “Interleukin-37: A crucial cytokine with multiple roles in disease and potentially clinical therapy.,” Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 4711–4719, Apr. 2018.]</ref>.
	V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic.		V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic.
	Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name = "prvi"/>.		Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name = "prvi"/>.

Smalensek at 18:29, 11 March 2019

2019-03-11T18:29:09Z

Smalensek at 18:16, 11 March 2019

2019-03-11T18:16:02Z

← Older revision		Revision as of 18:16, 11 March 2019
Line 1:		Line 1:
	Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva		Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva
	~~Prekomerno~~ izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα)~~, v študijah na transgenih miših je to vodilo v »profilakso« pred srčno ishemijo ali ishemičnimi poškodbami jeter~~. ~~Dodatek~~ IL-37 mišim prepreči ~~psoriazo~~, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic.		V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic.
			Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g.
	~~Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37 predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni~~.
	Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije ~~s sesalskimi patogeni /~~ bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g.

	<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum</h2>		<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum</h2>

Smalensek at 18:13, 11 March 2019

2019-03-11T18:13:35Z

← Older revision		Revision as of 18:13, 11 March 2019
Line 1:		Line 1:
	Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva		Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva
	Prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα), v študijah na transgenih miših je to vodilo v »profilakso« pred srčno ishemijo ali ishemičnimi poškodbami jeter. Dodatek IL-37 mišim prepreči psoriazo, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic. Kot novo-odkriti protivnetni citokin predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni.		Prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα), v študijah na transgenih miših je to vodilo v »profilakso« pred srčno ishemijo ali ishemičnimi poškodbami jeter. Dodatek IL-37 mišim prepreči psoriazo, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic.

			Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37 predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni.
	Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije s sesalskimi patogeni / bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g.		Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije s sesalskimi patogeni / bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g.

	<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum</h2>		<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum</h2>
	Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija
	V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b:		<h3>Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija</h3>
	• Prekurzorska oblika: proIL-37b (celotna dolžina)
			V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b.
			*Prekurzorska oblika: '''proIL-37b''', ''celotna dolžina''
	pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi.		pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi.
	• Zrela oblika: matIL-37b (brez nativnega signalnega peptida)		*Zrela oblika: '''matIL-37b''', ''brez nativnega signalnega peptida''
	Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER.		Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER.
	• Fuzijski protein: SBA-IL-37b (fuzija z aglutininom iz soje)		*Fuzijski protein: '''SBA-IL-37b''', ''fuzija z aglutininom iz soje''
	Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.		Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.
	Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens (t.i. ~~»triparental mating«~~). Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo (t.i. ~~»agrobacterium~~-mediated leaf disc ~~method«~~). S vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo.
	<h2>Karakterizacija produktov</h2>		Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens (t.i. »''triparental mating''«). Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo (t.i. »''agrobacterium-mediated leaf disc method''«). S vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo.
	~~Prenos Western vzorcev~~ s ~~proIL~~-~~37b~~ je pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Pri ~~matIL~~-37b ~~in SBA-IL37b~~ je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (~~19kDa~~), ~~dimerne oblike ni~~ bilo.
	Pri ~~pro~~-~~obliki~~ so ~~dosegli zelo visoko izražanje~~ (1% TSP~~), količina zrele oblike pa~~ je ~~bila precej nižja. Verjetno to nakazuje, da ER ni primerno mesto za lokalizacijo zrele oblike produkta~~ (~~s humanim~~ IL-4, IL-~~13, oranžnim fluorescenčnim proteinom je bilo pokazano, da lokalizacija~~ v ~~ER poveča izplen~~ in ~~stabilnost produkta)~~. Pro-oblika je ~~za razliko od zrele/fuzijske oblike~~ ostala v citoplazmi ~~– verjetno~~ rastlinska celica ne prepozna nativnega ~~N-končnega~~ signalnega peptida, ~~prisotnost slednjega~~ pa je ~~verjetno razlog večjemu izplenu pro-IL37b. Sumi se~~, ~~da ima nativni signalni peptid stabilizacijsko vlogo~~. IL-37b je ~~v splošnem~~ nestabilni protein~~, saj vsebuje funkcionalne elemente~~ mRNA za »nestabilnost«~~. Ti imajo vlogo negativne povratne zanke pri regulaciji izražanja mRNA/proteina~~, ~~njihov izbris~~ pa ~~vodi v povečanje izražanja.~~		<h3>Karakterizacija produktov</h3>
	~~Izplen matIL-37b~~ so povečali s fuzijo s SBA ~~na primerljiv nivo s pro-obliko (1% TSP)~~. ~~SBA je tetramerni glikoprotein, za katerega~~ je značilna visoka stopnja stabilnosti~~. Kot fuzijski partner tako~~ poveča nivo ~~izražanja tarčnega~~ proteina. ~~Je lektin~~, ~~ki se specifično veže na N~~-~~acetil-D-galaktozamin~~, ~~kar olajša čiščenje produkta z afinitetno kromatografijo~~ na ~~agarozni koloni~~, ~~povezani z izbranim sladkorjem. Ločitev tarčnega proteina od fuzijskega partnerja jim~~ je ~~omogočilo vmesno TEV-prepoznavno mesto in endoproteolitska restrikcija s proteazo TEV~~.
	~~Biološko aktivnost produktov so preizkušali in vitro na mišjih primarnih renalnih celicah iz epitela ledvičnega korteksa. Celice so podvrgli različnim koncentracijam IL~~-~~37b~~, ~~kot standard so uporabili komercialni rekombinantni~~ IL-37b in ~~nato z endotoksinom LPS inducirali sintezo pro-vnetnih citokinov. V supernatantih kultur so nato analizirali koncentracijo TNF α. Sintezo slednje bi prisotnost IL-37b morala znižati.~~		Pri vzorcih s pro-IL37b je prenos Western pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Količina izraženega proteina je dosegla 1% TSP. Pri maIL-37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (20kDa), izraženega proteina je bilo manj v primerjavi s pro-obliko (0,01% TSP). Pri fuzijski obliki SBA-IL37b so prevladovale lise pri 50kDa (monomer) in nad 75kDa (dimer, trimer, tetramer), nivo izražanja je dosegel 1% TSP. Restrikcija s proteazo TEV je fuzijsko obliko pričakovano in popolnoma razgradila na dve komponenti (SBA in IL-37b).
	~~Tako matIL-37b kot tudi pro-IL37b sta biološko aktivna~~, ~~zrela oblika toliko bolj zaradi neprisotnosti nativnega signalnega peptida – konformacijsko ugodnejša oblika pripomore k boljši vezavi na receptor~~.
	~~<h2>Pomen študije</h2>~~		Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.
			<h2>Rezultati in zaključek</h2>
			Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.
			Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida.
			Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa ugodnejšo možnost platforme za proizvodnjo.

← Older revision		Revision as of 18:29, 11 March 2019
Line 1:		Line 1:
	Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva		Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva.<ref name="prvi">[https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2 N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma, “Production of functional human interleukin 37 using plants.,” Plant Cell Rep., vol. 38, no. 3, pp. 391–401, Mar. 2019]</ref> <ref name="drugi">[https://doi.org/10.3892/ol.2018.7982 L. Wang, Y. Quan, Y. Yue, X. Heng, and F. Che, “Interleukin-37: A crucial cytokine with multiple roles in disease and potentially clinical therapy.,” Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 4711–4719, Apr. 2018.]</ref>
	V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic.		V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic.
	Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g.		Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name = "prvi"/>.

	<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum</h2>		<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum</h2>
Line 15:		Line 15:
	Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.		Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.

	Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens (t.i. »''triparental mating''«). Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo (t.i. »''agrobacterium-mediated leaf disc method''«). S vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo.		Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens (t.i. »''triparental mating''«). Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo (t.i. »''agrobacterium-mediated leaf disc method''«). S vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo <ref name="prvi"/>.

	<h3>Karakterizacija produktov</h3>		<h3>Karakterizacija produktov</h3>
Line 24:		Line 24:
	<h2>Rezultati in zaključek</h2>		<h2>Rezultati in zaključek</h2>
	Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.		Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.
	Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida.		Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida <ref name="prvi"/>.
	Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa ugodnejšo možnost platforme za proizvodnjo.		Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa ugodnejšo možnost platforme za proizvodnjo.

			<h2>Viri</h2>
			<references/>