Razreševanje Hollidayevega križišča - Revision history

Nejc Kejžar: /* Nukleolitična resolucija Hollidayevega križišča */

2016-05-30T10:26:22Z

Nukleolitična resolucija Hollidayevega križišča

← Older revision		Revision as of 10:26, 30 May 2016
Line 11:		Line 11:
	Po sami tvorbi, se lahko Hollidayevo križišče premika vzdolž DNA verig ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1e] [3]).[1] Čeprav je sprememba Gibbsove proste energije za ta proces enaka nič, kar bi nakazovalo spontan proces v obeh možnih smereh, je premikanje Hollidayevega križišča po verigi DNA odvisno od hidrolize ATP in zgolj enosmerno.[1] Pri tem sodelujeta dva proteina, že omenjeni RuvA in RuvB.[1] Premik križišča izvaja RuvB s hidrolizo ATP, vendar se mora zaradi šibkih interakcij z DNA na slednjo vezati preko RuvA – slednji torej deluje kot stabilizator križišča in kot vezavno mesto za RuvB. RuvB je aktiven kot heksameren protein, ki v svoji strukturi tvori 30Å kanal, skozi katerega je napeljana veriga DNA.[1] Za premikanje Hollidayevega križišča se tvori kompleks križišča, RuvA tetramera in dveh RuvB heksamerov, ki s svojo aktivnostjo premikata križišče v isto smer ([https://www.shef.ac.uk/mbb/ruva slika 4]).[1] Smer premikanja križišča je odvisna od tega, na kateri par krakov Hollidayevega križišča se pripneta RuvB heksamera.[1]		Po sami tvorbi, se lahko Hollidayevo križišče premika vzdolž DNA verig ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1e] [3]).[1] Čeprav je sprememba Gibbsove proste energije za ta proces enaka nič, kar bi nakazovalo spontan proces v obeh možnih smereh, je premikanje Hollidayevega križišča po verigi DNA odvisno od hidrolize ATP in zgolj enosmerno.[1] Pri tem sodelujeta dva proteina, že omenjeni RuvA in RuvB.[1] Premik križišča izvaja RuvB s hidrolizo ATP, vendar se mora zaradi šibkih interakcij z DNA na slednjo vezati preko RuvA – slednji torej deluje kot stabilizator križišča in kot vezavno mesto za RuvB. RuvB je aktiven kot heksameren protein, ki v svoji strukturi tvori 30Å kanal, skozi katerega je napeljana veriga DNA.[1] Za premikanje Hollidayevega križišča se tvori kompleks križišča, RuvA tetramera in dveh RuvB heksamerov, ki s svojo aktivnostjo premikata križišče v isto smer ([https://www.shef.ac.uk/mbb/ruva slika 4]).[1] Smer premikanja križišča je odvisna od tega, na kateri par krakov Hollidayevega križišča se pripneta RuvB heksamera.[1]

	== ~~Nukleolitična resolucija~~ Hollidayevega križišča ==		== Nukleolitično razreševanje Hollidayevega križišča ==
	V različnih organizmih je bilo odkritih že kar nekaj proteinov, ki prepoznavajo Hollidayevo križišče in ga razrešujejo; tem proteinom s skupnim imenom pravimo resolvaze (iz ang. resolve – razrešiti).[1,2] Morda najbolj znana resolvaza je RuvC iz E. coli.[1,2] Gre za homodimerno endonukleazo, ki ima obe aktivni mesti na isti strani encima – to namiguje na mehanizem simetrične cepitve dveh nasprotnih nukleotidnih verig v Hollidayevem križišču tako, da se RuvC orientira na odprto stran kompleksa RuvAB-Hollidayevo križišče.[1] Nastali kompleks RuvABC-Hollidayevo križišče je tako imenovan resolvosom.[1] Križišče se lahko cepi longitudinalno ([http://genesdev.cshlp.org/content/13/14/1861/F1.large.jpg slika 5], levo, ‘patch’) ali transverzalno ([http://genesdev.cshlp.org/content/13/14/1861/F1.large.jpg slika 5], desno, ‘splice’) – od načina cepitve je odvisno ali bo prišlo do rekombinacije, ali ne.[1] Pri transverzalnem cepljenju (cepljenju ~~ssDNK~~ verig, ki se izmenjata v ~~formaciji~~ križišča) vidimo, da pride zgolj do zamenjav regij, ki jih definira dolžina poti Hollidayevega križišča; dve homologni ~~DNK~~ molekuli si zgolj izmenjata enaka homologna odseka ~~ssDNK~~, kar ne vodi do rekombinantnih produktov.[1] V primeru longitudinalnega cepljenja (cepitev verig, ki se pri tvorbi Hollidayeve zanke nista izmenjali) pa pride do prenosa ~~dsDNK~~ molekul in tako do ~~formacije~~ rekombinantnih dvovijačnih ~~DNK~~ – molekul ~~DNK~~, sestavljenih iz dveh regij iz različnih začetnih ~~dsDNK~~.[1] Na koncu reševanja zanke ~~DNK~~ ligaze produkte povežejo v enotne ~~dsDNK~~.[1]		V različnih organizmih je bilo odkritih že kar nekaj proteinov, ki prepoznavajo Hollidayevo križišče in ga razrešujejo; tem proteinom s skupnim imenom pravimo resolvaze (iz ang. resolve – razrešiti).[1,2] Morda najbolj znana resolvaza je RuvC iz E. coli.[1,2] Gre za homodimerno endonukleazo, ki ima obe aktivni mesti na isti strani encima – to namiguje na mehanizem simetrične cepitve dveh nasprotnih nukleotidnih verig v Hollidayevem križišču tako, da se RuvC orientira na odprto stran kompleksa RuvAB-Hollidayevo križišče.[1] Nastali kompleks RuvABC-Hollidayevo križišče je tako imenovan resolvosom.[1] Križišče se lahko cepi longitudinalno ([http://genesdev.cshlp.org/content/13/14/1861/F1.large.jpg slika 5], levo, ‘patch’) ali transverzalno ([http://genesdev.cshlp.org/content/13/14/1861/F1.large.jpg slika 5], desno, ‘splice’) – od načina cepitve je odvisno ali bo prišlo do rekombinacije, ali ne.[1] Pri transverzalnem cepljenju (cepljenju ssDNA verig, ki se izmenjata v tvorbi križišča) vidimo, da pride zgolj do zamenjav regij, ki jih definira dolžina poti Hollidayevega križišča; dve homologni DNA molekuli si zgolj izmenjata enaka homologna odseka ssDNA, kar ne vodi do rekombinantnih produktov.[1] V primeru longitudinalnega cepljenja (cepitev verig, ki se pri tvorbi Hollidayeve zanke nista izmenjali) pa pride do prenosa dsDNA molekul in tako do tvorbe rekombinantnih dvovijačnih DNA – molekul DNA, sestavljenih iz dveh regij iz različnih začetnih dsDNA.[1] Na koncu reševanja zanke DNA ligaze produkte povežejo v enotne dsDNA.[1]

	== Viri ==		== Viri ==

Nejc Kejžar: /* Struktura Hollidayevega križišča */

2016-05-30T10:25:11Z

Struktura Hollidayevega križišča

← Older revision		Revision as of 10:25, 30 May 2016
Line 6:		Line 6:

	== Struktura Hollidayevega križišča ==		== Struktura Hollidayevega križišča ==
	Kot že omenjeno je Hollidayevo križišče sestavljeno iz 4 nukleotidnih verig, ki se in vivo prekrižajo v odprti planarni strukturi tako, da križišče zavzame obliko kvadrata, pri katerem iz kotov izhajajo ~~dsDNK~~ ([http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1C7Y slika 3] [5]).[1,2] Takšna struktura seveda ni stabilna sama po sebi, ampak jo stabilizira RuvA homotetramer.[1,2] Kompleks zavzame obliko pekača za kolač, s krožno vdolbino za križajoče se ~~ssDNK~~ in izstopajočim delom v sredini kvadrata Hollidayeve zanke. Ta je sestavljen iz aminokislin Glu55 in Asp56 vsakega RuvA, ki povzročajo elektrostatski odboj s fosfatnimi skupinami ~~ssDNK~~; tako se doseže separacija ~~ssDNK~~ in njihovo vodenje do izmenjave nukleotidnih verig.[1] Vdolbine so prekrite s pozitivnimi aminokislinskimi ostanki, ki ~~DNK~~ verige preko elektrostatskih interakcij stabilizirajo v notranjosti le-teh.[1] Predpostavlja se, da je pravilna in vivo struktura dejansko homooktamer, ki tako ne tvori zgolj vdolbin, ampak tunel za ~~DNK~~ verige (dva pekača obrnjena z vdolbinami drug proti drugemu).		Kot že omenjeno je Hollidayevo križišče sestavljeno iz 4 nukleotidnih verig, ki se in vivo prekrižajo v odprti planarni strukturi tako, da križišče zavzame obliko kvadrata, pri katerem iz kotov izhajajo dsDNA ([http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1C7Y slika 3] [5]).[1,2] Takšna struktura seveda ni stabilna sama po sebi, ampak jo stabilizira RuvA homotetramer.[1,2] Kompleks zavzame obliko pekača za kolač, s krožno vdolbino za križajoče se ssDNA in izstopajočim delom v sredini kvadrata Hollidayeve zanke. Ta je sestavljen iz aminokislin Glu55 in Asp56 vsakega RuvA, ki povzročajo elektrostatski odboj s fosfatnimi skupinami ssDNA; tako se doseže separacija ssDNA in njihovo vodenje do izmenjave nukleotidnih verig.[1] Vdolbine so prekrite s pozitivnimi aminokislinskimi ostanki, ki DNA verige preko elektrostatskih interakcij stabilizirajo v notranjosti le-teh.[1] Predpostavlja se, da je pravilna in vivo struktura dejansko homooktamer, ki tako ne tvori zgolj vdolbin, ampak tunel za DNA verige (dva pekača obrnjena z vdolbinami drug proti drugemu).

	== Premikanje Hollidayevega križišča ==		== Premikanje Hollidayevega križišča ==

Nejc Kejžar: /* Migracija Hollidayevega križišča */

2016-05-30T10:24:28Z

Migracija Hollidayevega križišča

← Older revision		Revision as of 10:24, 30 May 2016
Line 8:		Line 8:
	Kot že omenjeno je Hollidayevo križišče sestavljeno iz 4 nukleotidnih verig, ki se in vivo prekrižajo v odprti planarni strukturi tako, da križišče zavzame obliko kvadrata, pri katerem iz kotov izhajajo dsDNK ([http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1C7Y slika 3] [5]).[1,2] Takšna struktura seveda ni stabilna sama po sebi, ampak jo stabilizira RuvA homotetramer.[1,2] Kompleks zavzame obliko pekača za kolač, s krožno vdolbino za križajoče se ssDNK in izstopajočim delom v sredini kvadrata Hollidayeve zanke. Ta je sestavljen iz aminokislin Glu55 in Asp56 vsakega RuvA, ki povzročajo elektrostatski odboj s fosfatnimi skupinami ssDNK; tako se doseže separacija ssDNK in njihovo vodenje do izmenjave nukleotidnih verig.[1] Vdolbine so prekrite s pozitivnimi aminokislinskimi ostanki, ki DNK verige preko elektrostatskih interakcij stabilizirajo v notranjosti le-teh.[1] Predpostavlja se, da je pravilna in vivo struktura dejansko homooktamer, ki tako ne tvori zgolj vdolbin, ampak tunel za DNK verige (dva pekača obrnjena z vdolbinami drug proti drugemu).		Kot že omenjeno je Hollidayevo križišče sestavljeno iz 4 nukleotidnih verig, ki se in vivo prekrižajo v odprti planarni strukturi tako, da križišče zavzame obliko kvadrata, pri katerem iz kotov izhajajo dsDNK ([http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1C7Y slika 3] [5]).[1,2] Takšna struktura seveda ni stabilna sama po sebi, ampak jo stabilizira RuvA homotetramer.[1,2] Kompleks zavzame obliko pekača za kolač, s krožno vdolbino za križajoče se ssDNK in izstopajočim delom v sredini kvadrata Hollidayeve zanke. Ta je sestavljen iz aminokislin Glu55 in Asp56 vsakega RuvA, ki povzročajo elektrostatski odboj s fosfatnimi skupinami ssDNK; tako se doseže separacija ssDNK in njihovo vodenje do izmenjave nukleotidnih verig.[1] Vdolbine so prekrite s pozitivnimi aminokislinskimi ostanki, ki DNK verige preko elektrostatskih interakcij stabilizirajo v notranjosti le-teh.[1] Predpostavlja se, da je pravilna in vivo struktura dejansko homooktamer, ki tako ne tvori zgolj vdolbin, ampak tunel za DNK verige (dva pekača obrnjena z vdolbinami drug proti drugemu).

	== ~~Migracija~~ Hollidayevega križišča ==		== Premikanje Hollidayevega križišča ==
	Po sami ~~formaciji~~, Hollidayevo križišče ~~lahko migrira~~ vzdolž ~~DNK~~ verig ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1e] [3]).[1] Čeprav je sprememba Gibbsove proste energije za ta proces enaka nič, kar bi nakazovalo spontan proces v obeh možnih smereh, je premikanje Hollidayevega križišča po verigi ~~DNK~~ odvisno od hidrolize ATP in zgolj enosmerno.[1] Pri tem sodelujeta dva proteina, že omenjeni RuvA in RuvB.[1] Premik križišča izvaja RuvB s hidrolizo ATP, vendar se mora zaradi šibkih interakcij z ~~DNK~~ na slednjo vezati preko RuvA – slednji torej deluje kot stabilizator križišča in kot vezavno mesto za RuvB. RuvB je aktiven kot heksameren protein, ki v svoji strukturi tvori 30Å kanal, skozi katerega je napeljana veriga ~~DNK~~.[1] Za premikanje Hollidayevega križišča se tvori kompleks križišča, RuvA tetramera in dveh RuvB heksamerov, ki s svojo aktivnostjo premikata križišče v isto smer ([https://www.shef.ac.uk/mbb/ruva slika 4]).[1] Smer premikanja križišča je odvisna od tega, na kateri par krakov Hollidayevega križišča se pripneta RuvB heksamera.[1]		Po sami tvorbi, se lahko Hollidayevo križišče premika vzdolž DNA verig ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1e] [3]).[1] Čeprav je sprememba Gibbsove proste energije za ta proces enaka nič, kar bi nakazovalo spontan proces v obeh možnih smereh, je premikanje Hollidayevega križišča po verigi DNA odvisno od hidrolize ATP in zgolj enosmerno.[1] Pri tem sodelujeta dva proteina, že omenjeni RuvA in RuvB.[1] Premik križišča izvaja RuvB s hidrolizo ATP, vendar se mora zaradi šibkih interakcij z DNA na slednjo vezati preko RuvA – slednji torej deluje kot stabilizator križišča in kot vezavno mesto za RuvB. RuvB je aktiven kot heksameren protein, ki v svoji strukturi tvori 30Å kanal, skozi katerega je napeljana veriga DNA.[1] Za premikanje Hollidayevega križišča se tvori kompleks križišča, RuvA tetramera in dveh RuvB heksamerov, ki s svojo aktivnostjo premikata križišče v isto smer ([https://www.shef.ac.uk/mbb/ruva slika 4]).[1] Smer premikanja križišča je odvisna od tega, na kateri par krakov Hollidayevega križišča se pripneta RuvB heksamera.[1]

	== Nukleolitična resolucija Hollidayevega križišča ==		== Nukleolitična resolucija Hollidayevega križišča ==

Nejc Kejžar: /* Formacija Hollidayevega križišča */

2016-05-30T10:16:30Z

Formacija Hollidayevega križišča

← Older revision		Revision as of 10:16, 30 May 2016
Line 2:		Line 2:
	Hollidayevo križišče je struktura DNA, ki se pojavi pri homologni rekombinaciji genov.[1,2] Nastane iz dveh dsDNA (dvoverižna DNA, ang. double strand DNA), ki se povežeta tako, da 4 ssDNA (enoverižne DNA molekule, ang. single strand DNA) tvorijo obliko križa ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1d] [3]).[1,2] To strukturo je leta 1964 predlagal Robin Holliday, kot možno razlago za nenavadno dedovanje pri mejotskih delitvah nekaterih gliv.[2] Po teoriji Gregorja Mendela, začetnika genetike, bi se morali geni starševskih celic dedovati v razmerju A:a=2:2, kar pa pri nekaterih organizmih ne drži vedno – pojavi se lahko tudi razmerje dedovanja A:a=3:1.[2] Prvi takšen primer je opisal nemški genetik Hans Winkler in leta 1930 predstavil svojo idejo o spreminjanju genov kot razlago za to deviacijo, pravo molekularno obrazlago pa izpopolnil Holliday.[2]		Hollidayevo križišče je struktura DNA, ki se pojavi pri homologni rekombinaciji genov.[1,2] Nastane iz dveh dsDNA (dvoverižna DNA, ang. double strand DNA), ki se povežeta tako, da 4 ssDNA (enoverižne DNA molekule, ang. single strand DNA) tvorijo obliko križa ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1d] [3]).[1,2] To strukturo je leta 1964 predlagal Robin Holliday, kot možno razlago za nenavadno dedovanje pri mejotskih delitvah nekaterih gliv.[2] Po teoriji Gregorja Mendela, začetnika genetike, bi se morali geni starševskih celic dedovati v razmerju A:a=2:2, kar pa pri nekaterih organizmih ne drži vedno – pojavi se lahko tudi razmerje dedovanja A:a=3:1.[2] Prvi takšen primer je opisal nemški genetik Hans Winkler in leta 1930 predstavil svojo idejo o spreminjanju genov kot razlago za to deviacijo, pravo molekularno obrazlago pa izpopolnil Holliday.[2]

	== ~~Formacija~~ Hollidayevega križišča ==		== Tvorba Hollidayevega križišča ==
	Najbolje raziskan model ~~formacije~~ in razrešitve Hollidayevega križišča je iz E. coli zato si bomo tega ogledali podrobneje. Hollidayev model pravi, da se po ~~DNK~~ replikaciji, ki podvoji vse pare heterozigotnih alelov, sproži rekombinacija le-teh s simetričnim rezanjem dveh homolognih ~~DNK~~ molekul, ki vsebujeta dva različna alela ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1b] [3]).[1,2] To omogoči križno povezovanje dvojnih vijačnic preko ~~ssDNK~~ ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1c] [3]) in tvorbo križne strukture, ki ji pravimo Hollidayevo križišče ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1d] [3]).[1,2] ~~Formacijo~~ katalizira proteinski kompleks RecBCD, sestavljen iz treh proteinov.[1] RecB deluje kot 3'->5' helikaza in nukleaza, RecD kot 5'->3' helikaza, RecC pa oba povezuje v skupen kompleks.[1] ~~dsDNK~~ vstopi v kompleks skozi tunel med RecB in RecC proteinoma, zanka na RecC pa nukleotidni verigi loči – 3' konec se veže na RecB, 5' konec pa na RecD ([https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/HR_RecBCD_RecA.svg/2000px-HR_RecBCD_RecA.svg.png slika 2.2] [4]).[1] Posamezni ~~ssDNK~~ potujeta skozi ločena tunela, ki ju tvori RecC z omenjenima proteinoma ter na drugem koncu prideta v stik z nukleazno domeno RecB.[1] Na slednji se 3' konec cepi hitreje kot 5' konec, saj 3' konec izstopi iz tunela bližje aktivnemu mestu, kakor 5' konec; za cepitev kompleks porablja ATP ([https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/HR_RecBCD_RecA.svg/2000px-HR_RecBCD_RecA.svg.png slika 2.3] [4]).[1,2] Aktivnost proteina se spremeni, ko naleti na zaporedje χ (GCTGGTGG) na 3' koncu.[1] Ta se močneje poveže z RecC proteinom in ustavi procesiranje 3' konca proteina.[1] Ob tem se poveča frekvenca cepljenja 5' konca ~~DNK~~, saj se 3' ne cepi več in sprosti nukleazno mesto (slika 2.5 [4]).[1] To omogoči tvorbo ~~ssDNK~~ prostega konca, ki je nujen za tvorbo križišča, saj se le na enoverižno ~~DNK~~ lahko vežejo RecA proteini ([https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/HR_RecBCD_RecA.svg/2000px-HR_RecBCD_RecA.svg.png slika 2.6] [4]).[1] Ti so ključni za stabilizacijo ~~ssDNK~~ ter izmenjavo nukleotidnih verig v tvorbi križišča.[1] Povezavo dveh verig DNA s komplementarnimi baznimi pari po Watson-Cricku katalizirajo s hidrolizo ATP.[1] Svojo funkcijo prično opravljati ob vezavi ~~ssDNK~~ v vezavno mesto z istočasno vezanim ATP.[1] Ko ta kompleks sreča ~~dsDNK~~ s komplementarnim zaporedjem, povzroči RecA delno razvitje ~~dsDNK~~ in ob hidrolizi ATP izmenja en del razvite ~~dsDNK~~ z ~~ssDNK~~, kar tvori intermediatno troverižno ~~DNK~~, obdano z enotami RecA.[1] Za ~~formacijo~~ križišča sta tako potrebni dve takšni reakciji.[1]		Najbolje raziskan model tvorbe in razrešitve Hollidayevega križišča je iz E. coli zato si bomo tega ogledali podrobneje. Hollidayev model pravi, da se po DNA replikaciji, ki podvoji vse pare heterozigotnih alelov, sproži rekombinacija le-teh s simetričnim rezanjem dveh homolognih DNA molekul, ki vsebujeta dva različna alela ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1b] [3]).[1,2] To omogoči križno povezovanje dvojnih vijačnic preko ssDNA ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1c] [3]) in tvorbo križne strukture, ki ji pravimo Hollidayevo križišče ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1d] [3]).[1,2] Tvorbo katalizira proteinski kompleks RecBCD, sestavljen iz treh proteinov.[1] RecB deluje kot 3'->5' helikaza in nukleaza, RecD kot 5'->3' helikaza, RecC pa oba povezuje v skupen kompleks.[1] dsDNA vstopi v kompleks skozi tunel med RecB in RecC proteinoma, zanka na RecC pa nukleotidni verigi loči – 3' konec se veže na RecB, 5' konec pa na RecD ([https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/HR_RecBCD_RecA.svg/2000px-HR_RecBCD_RecA.svg.png slika 2.2] [4]).[1] Posamezni ssDNA potujeta skozi ločena tunela, ki ju tvori RecC z omenjenima proteinoma ter na drugem koncu prideta v stik z nukleazno domeno RecB.[1] Na slednji se 3' konec cepi hitreje kot 5' konec, saj 3' konec izstopi iz tunela bližje aktivnemu mestu, kakor 5' konec; za cepitev kompleks porablja ATP ([https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/HR_RecBCD_RecA.svg/2000px-HR_RecBCD_RecA.svg.png slika 2.3] [4]).[1,2] Aktivnost proteina se spremeni, ko naleti na zaporedje χ (GCTGGTGG) na 3' koncu.[1] Ta se močneje poveže z RecC proteinom in ustavi procesiranje 3' konca proteina.[1] Ob tem se poveča frekvenca cepljenja 5' konca DNA, saj se 3' ne cepi več in sprosti nukleazno mesto (slika 2.5 [4]).[1] To omogoči tvorbo ssDNA prostega konca, ki je nujen za tvorbo križišča, saj se le na enoverižno DNA lahko vežejo RecA proteini ([https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/HR_RecBCD_RecA.svg/2000px-HR_RecBCD_RecA.svg.png slika 2.6] [4]).[1] Ti so ključni za stabilizacijo ssDNA ter izmenjavo nukleotidnih verig v tvorbi križišča.[1] Povezavo dveh verig DNA s komplementarnimi baznimi pari po Watson-Cricku katalizirajo s hidrolizo ATP.[1] Svojo funkcijo prično opravljati ob vezavi ssDNA v vezavno mesto z istočasno vezanim ATP.[1] Ko ta kompleks sreča dsDNA s komplementarnim zaporedjem, povzroči RecA delno razvitje dsDNA in ob hidrolizi ATP izmenja en del razvite dsDNA z ssDNA, kar tvori intermediatno troverižno DNA, obdano z enotami RecA.[1] Za tvorbo križišča sta tako potrebni dve takšni reakciji.[1]

	== Struktura Hollidayevega križišča ==		== Struktura Hollidayevega križišča ==

Nejc Kejžar: /* Uvod */

2016-05-30T10:14:17Z

Uvod

← Older revision		Revision as of 10:14, 30 May 2016
Line 1:		Line 1:
	== Uvod ==		== Uvod ==
	Hollidayevo križišče je struktura DNA, ki se pojavi pri homologni rekombinaciji genov.[1,2] Nastane iz dveh ~~dsDNK~~ (dvoverižna ~~DNK~~, ang. double strand DNA), ki se povežeta tako, da 4 ~~ssDNK~~ (enoverižne ~~DNK~~ molekule, ang. single strand DNA) tvorijo obliko križa ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1d] [3]).[1,2] To strukturo je leta 1964 predlagal Robin Holliday, kot možno razlago za nenavadno dedovanje pri mejotskih delitvah nekaterih gliv.[2] Po teoriji Gregorja Mendela, začetnika genetike, bi se morali geni starševskih celic dedovati v razmerju A:a=2:2, kar pa pri nekaterih organizmih ne drži vedno – pojavi se lahko tudi razmerje dedovanja A:a=3:1.[2] Prvi takšen primer je opisal nemški genetik Hans Winkler in leta 1930 predstavil svojo idejo o spreminjanju genov kot razlago za to deviacijo, pravo molekularno obrazlago pa izpopolnil Holliday.[2]		Hollidayevo križišče je struktura DNA, ki se pojavi pri homologni rekombinaciji genov.[1,2] Nastane iz dveh dsDNA (dvoverižna DNA, ang. double strand DNA), ki se povežeta tako, da 4 ssDNA (enoverižne DNA molekule, ang. single strand DNA) tvorijo obliko križa ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1d] [3]).[1,2] To strukturo je leta 1964 predlagal Robin Holliday, kot možno razlago za nenavadno dedovanje pri mejotskih delitvah nekaterih gliv.[2] Po teoriji Gregorja Mendela, začetnika genetike, bi se morali geni starševskih celic dedovati v razmerju A:a=2:2, kar pa pri nekaterih organizmih ne drži vedno – pojavi se lahko tudi razmerje dedovanja A:a=3:1.[2] Prvi takšen primer je opisal nemški genetik Hans Winkler in leta 1930 predstavil svojo idejo o spreminjanju genov kot razlago za to deviacijo, pravo molekularno obrazlago pa izpopolnil Holliday.[2]

	== Formacija Hollidayevega križišča ==		== Formacija Hollidayevega križišča ==

Nejc Kejžar: /* Formacija Hollidayevega križišča */

2016-05-28T15:08:32Z

Formacija Hollidayevega križišča

← Older revision		Revision as of 15:08, 28 May 2016
Line 3:		Line 3:

	== Formacija Hollidayevega križišča ==		== Formacija Hollidayevega križišča ==
	Najbolje raziskan model formacije in razrešitve Hollidayevega križišča je iz E. coli zato si bomo tega ogledali podrobneje. Hollidayev model pravi, da se po DNK replikaciji, ki podvoji vse pare heterozigotnih alelov, sproži rekombinacija le-teh s simetričnim rezanjem dveh homolognih DNK molekul, ki vsebujeta dva različna alela ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1b] [3]).[1,2] To omogoči križno povezovanje dvojnih vijačnic preko ssDNK ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1c] [3]) in tvorbo križne strukture, ki ji pravimo Hollidayevo križišče ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=~~objectonlyslika~~ 1d] [3]).[1,2] Formacijo katalizira proteinski kompleks RecBCD, sestavljen iz treh proteinov.[1] RecB deluje kot 3'->5' helikaza in nukleaza, RecD kot 5'->3' helikaza, RecC pa oba povezuje v skupen kompleks.[1] dsDNK vstopi v kompleks skozi tunel med RecB in RecC proteinoma, zanka na RecC pa nukleotidni verigi loči – 3' konec se veže na RecB, 5' konec pa na RecD ([https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/HR_RecBCD_RecA.svg/2000px-HR_RecBCD_RecA.svg.png slika 2.2] [4]).[1] Posamezni ssDNK potujeta skozi ločena tunela, ki ju tvori RecC z omenjenima proteinoma ter na drugem koncu prideta v stik z nukleazno domeno RecB.[1] Na slednji se 3' konec cepi hitreje kot 5' konec, saj 3' konec izstopi iz tunela bližje aktivnemu mestu, kakor 5' konec; za cepitev kompleks porablja ATP ([https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/HR_RecBCD_RecA.svg/2000px-HR_RecBCD_RecA.svg.png slika 2.3] [4]).[1,2] Aktivnost proteina se spremeni, ko naleti na zaporedje χ (GCTGGTGG) na 3' koncu.[1] Ta se močneje poveže z RecC proteinom in ustavi procesiranje 3' konca proteina.[1] Ob tem se poveča frekvenca cepljenja 5' konca DNK, saj se 3' ne cepi več in sprosti nukleazno mesto (slika 2.5 [4]).[1] To omogoči tvorbo ssDNK prostega konca, ki je nujen za tvorbo križišča, saj se le na enoverižno DNK lahko vežejo RecA proteini ([https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/HR_RecBCD_RecA.svg/2000px-HR_RecBCD_RecA.svg.png slika 2.6] [4]).[1] Ti so ključni za stabilizacijo ssDNK ter izmenjavo nukleotidnih verig v tvorbi križišča.[1] Povezavo dveh verig DNA s komplementarnimi baznimi pari po Watson-Cricku katalizirajo s hidrolizo ATP.[1] Svojo funkcijo prično opravljati ob vezavi ssDNK v vezavno mesto z istočasno vezanim ATP.[1] Ko ta kompleks sreča dsDNK s komplementarnim zaporedjem, povzroči RecA delno razvitje dsDNK in ob hidrolizi ATP izmenja en del razvite dsDNK z ssDNK, kar tvori intermediatno troverižno DNK, obdano z enotami RecA.[1] Za formacijo križišča sta tako potrebni dve takšni reakciji.[1]		Najbolje raziskan model formacije in razrešitve Hollidayevega križišča je iz E. coli zato si bomo tega ogledali podrobneje. Hollidayev model pravi, da se po DNK replikaciji, ki podvoji vse pare heterozigotnih alelov, sproži rekombinacija le-teh s simetričnim rezanjem dveh homolognih DNK molekul, ki vsebujeta dva različna alela ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1b] [3]).[1,2] To omogoči križno povezovanje dvojnih vijačnic preko ssDNK ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1c] [3]) in tvorbo križne strukture, ki ji pravimo Hollidayevo križišče ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1d] [3]).[1,2] Formacijo katalizira proteinski kompleks RecBCD, sestavljen iz treh proteinov.[1] RecB deluje kot 3'->5' helikaza in nukleaza, RecD kot 5'->3' helikaza, RecC pa oba povezuje v skupen kompleks.[1] dsDNK vstopi v kompleks skozi tunel med RecB in RecC proteinoma, zanka na RecC pa nukleotidni verigi loči – 3' konec se veže na RecB, 5' konec pa na RecD ([https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/HR_RecBCD_RecA.svg/2000px-HR_RecBCD_RecA.svg.png slika 2.2] [4]).[1] Posamezni ssDNK potujeta skozi ločena tunela, ki ju tvori RecC z omenjenima proteinoma ter na drugem koncu prideta v stik z nukleazno domeno RecB.[1] Na slednji se 3' konec cepi hitreje kot 5' konec, saj 3' konec izstopi iz tunela bližje aktivnemu mestu, kakor 5' konec; za cepitev kompleks porablja ATP ([https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/HR_RecBCD_RecA.svg/2000px-HR_RecBCD_RecA.svg.png slika 2.3] [4]).[1,2] Aktivnost proteina se spremeni, ko naleti na zaporedje χ (GCTGGTGG) na 3' koncu.[1] Ta se močneje poveže z RecC proteinom in ustavi procesiranje 3' konca proteina.[1] Ob tem se poveča frekvenca cepljenja 5' konca DNK, saj se 3' ne cepi več in sprosti nukleazno mesto (slika 2.5 [4]).[1] To omogoči tvorbo ssDNK prostega konca, ki je nujen za tvorbo križišča, saj se le na enoverižno DNK lahko vežejo RecA proteini ([https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/HR_RecBCD_RecA.svg/2000px-HR_RecBCD_RecA.svg.png slika 2.6] [4]).[1] Ti so ključni za stabilizacijo ssDNK ter izmenjavo nukleotidnih verig v tvorbi križišča.[1] Povezavo dveh verig DNA s komplementarnimi baznimi pari po Watson-Cricku katalizirajo s hidrolizo ATP.[1] Svojo funkcijo prično opravljati ob vezavi ssDNK v vezavno mesto z istočasno vezanim ATP.[1] Ko ta kompleks sreča dsDNK s komplementarnim zaporedjem, povzroči RecA delno razvitje dsDNK in ob hidrolizi ATP izmenja en del razvite dsDNK z ssDNK, kar tvori intermediatno troverižno DNK, obdano z enotami RecA.[1] Za formacijo križišča sta tako potrebni dve takšni reakciji.[1]

	== Struktura Hollidayevega križišča ==		== Struktura Hollidayevega križišča ==

Nejc Kejžar: /* Viri */

2016-05-28T15:06:39Z

Viri

← Older revision		Revision as of 15:06, 28 May 2016
Line 20:		Line 20:
	4. Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Gaudier, M., Kowalczykowski, S. C. & Wigley, D. B. Crystal structure of RecBCD enzyme reveals a machine for processing DNA breaks. Nature 432, 187–93 (2004). <br />		4. Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Gaudier, M., Kowalczykowski, S. C. & Wigley, D. B. Crystal structure of RecBCD enzyme reveals a machine for processing DNA breaks. Nature 432, 187–93 (2004). <br />
	5. Ariyoshi, M., Nishino, T., Iwasaki, H., Shinagawa, H. & Morikawa, K. Crystal structure of the holliday junction DNA in complex with a single RuvA tetramer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 8257–8262 (2000). <br />		5. Ariyoshi, M., Nishino, T., Iwasaki, H., Shinagawa, H. & Morikawa, K. Crystal structure of the holliday junction DNA in complex with a single RuvA tetramer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 8257–8262 (2000). <br />

			[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Nejc Kejžar: /* Nukleolitična resolucija Hollidayevega križišča */

2016-05-28T15:03:16Z

Nukleolitična resolucija Hollidayevega križišča

← Older revision		Revision as of 15:03, 28 May 2016
Line 12:		Line 12:

	== Nukleolitična resolucija Hollidayevega križišča ==		== Nukleolitična resolucija Hollidayevega križišča ==
	V različnih organizmih je bilo odkritih že kar nekaj proteinov, ki prepoznavajo Hollidayevo križišče in ga razrešujejo; tem proteinom s skupnim imenom pravimo resolvaze (iz ang. resolve – razrešiti).[1,2] Morda najbolj znana resolvaza je RuvC iz E. coli.[1,2] Gre za homodimerno endonukleazo, ki ima obe aktivni mesti na isti strani encima – to namiguje na mehanizem simetrične cepitve dveh nasprotnih nukleotidnih verig v Hollidayevem križišču tako, da se RuvC orientira na odprto stran kompleksa RuvAB-Hollidayevo križišče.[1] Nastali kompleks RuvABC-Hollidayevo križišče je tako imenovan resolvosom.[1] Križišče se lahko cepi longitudinalno (slika 5, levo, ‘patch’) ali transverzalno (slika 5, desno, ‘splice’) – od načina cepitve je odvisno ali bo prišlo do rekombinacije, ali ne.[1] Pri transverzalnem cepljenju (cepljenju ssDNK verig, ki se izmenjata v formaciji križišča) vidimo, da pride zgolj do zamenjav regij, ki jih definira dolžina poti Hollidayevega križišča; dve homologni DNK molekuli si zgolj izmenjata enaka homologna odseka ssDNK, kar ne vodi do rekombinantnih produktov.[1] V primeru longitudinalnega cepljenja (cepitev verig, ki se pri tvorbi Hollidayeve zanke nista izmenjali) pa pride do prenosa dsDNK molekul in tako do formacije rekombinantnih dvovijačnih DNK – molekul DNK, sestavljenih iz dveh regij iz različnih začetnih dsDNK.[1] Na koncu reševanja zanke DNK ligaze produkte povežejo v enotne dsDNK.[1]		V različnih organizmih je bilo odkritih že kar nekaj proteinov, ki prepoznavajo Hollidayevo križišče in ga razrešujejo; tem proteinom s skupnim imenom pravimo resolvaze (iz ang. resolve – razrešiti).[1,2] Morda najbolj znana resolvaza je RuvC iz E. coli.[1,2] Gre za homodimerno endonukleazo, ki ima obe aktivni mesti na isti strani encima – to namiguje na mehanizem simetrične cepitve dveh nasprotnih nukleotidnih verig v Hollidayevem križišču tako, da se RuvC orientira na odprto stran kompleksa RuvAB-Hollidayevo križišče.[1] Nastali kompleks RuvABC-Hollidayevo križišče je tako imenovan resolvosom.[1] Križišče se lahko cepi longitudinalno ([http://genesdev.cshlp.org/content/13/14/1861/F1.large.jpg slika 5], levo, ‘patch’) ali transverzalno ([http://genesdev.cshlp.org/content/13/14/1861/F1.large.jpg slika 5], desno, ‘splice’) – od načina cepitve je odvisno ali bo prišlo do rekombinacije, ali ne.[1] Pri transverzalnem cepljenju (cepljenju ssDNK verig, ki se izmenjata v formaciji križišča) vidimo, da pride zgolj do zamenjav regij, ki jih definira dolžina poti Hollidayevega križišča; dve homologni DNK molekuli si zgolj izmenjata enaka homologna odseka ssDNK, kar ne vodi do rekombinantnih produktov.[1] V primeru longitudinalnega cepljenja (cepitev verig, ki se pri tvorbi Hollidayeve zanke nista izmenjali) pa pride do prenosa dsDNK molekul in tako do formacije rekombinantnih dvovijačnih DNK – molekul DNK, sestavljenih iz dveh regij iz različnih začetnih dsDNK.[1] Na koncu reševanja zanke DNK ligaze produkte povežejo v enotne dsDNK.[1]

	== Viri ==		== Viri ==

Nejc Kejžar: /* Migracija Hollidayevega križišča */

2016-05-28T15:02:29Z

Migracija Hollidayevega križišča

← Older revision		Revision as of 15:02, 28 May 2016
Line 9:		Line 9:

	== Migracija Hollidayevega križišča ==		== Migracija Hollidayevega križišča ==
	Po sami formaciji, Hollidayevo križišče lahko migrira vzdolž DNK verig (slika 1e [3]).[1] Čeprav je sprememba Gibbsove proste energije za ta proces enaka nič, kar bi nakazovalo spontan proces v obeh možnih smereh, je premikanje Hollidayevega križišča po verigi DNK odvisno od hidrolize ATP in zgolj enosmerno.[1] Pri tem sodelujeta dva proteina, že omenjeni RuvA in RuvB.[1] Premik križišča izvaja RuvB s hidrolizo ATP, vendar se mora zaradi šibkih interakcij z DNK na slednjo vezati preko RuvA – slednji torej deluje kot stabilizator križišča in kot vezavno mesto za RuvB. RuvB je aktiven kot heksameren protein, ki v svoji strukturi tvori 30Å kanal, skozi katerega je napeljana veriga DNK.[1] Za premikanje Hollidayevega križišča se tvori kompleks križišča, RuvA tetramera in dveh RuvB heksamerov, ki s svojo aktivnostjo premikata križišče v isto smer (slika 4).[1] Smer premikanja križišča je odvisna od tega, na kateri par krakov Hollidayevega križišča se pripneta RuvB heksamera.[1]		Po sami formaciji, Hollidayevo križišče lahko migrira vzdolž DNK verig ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1e] [3]).[1] Čeprav je sprememba Gibbsove proste energije za ta proces enaka nič, kar bi nakazovalo spontan proces v obeh možnih smereh, je premikanje Hollidayevega križišča po verigi DNK odvisno od hidrolize ATP in zgolj enosmerno.[1] Pri tem sodelujeta dva proteina, že omenjeni RuvA in RuvB.[1] Premik križišča izvaja RuvB s hidrolizo ATP, vendar se mora zaradi šibkih interakcij z DNK na slednjo vezati preko RuvA – slednji torej deluje kot stabilizator križišča in kot vezavno mesto za RuvB. RuvB je aktiven kot heksameren protein, ki v svoji strukturi tvori 30Å kanal, skozi katerega je napeljana veriga DNK.[1] Za premikanje Hollidayevega križišča se tvori kompleks križišča, RuvA tetramera in dveh RuvB heksamerov, ki s svojo aktivnostjo premikata križišče v isto smer ([https://www.shef.ac.uk/mbb/ruva slika 4]).[1] Smer premikanja križišča je odvisna od tega, na kateri par krakov Hollidayevega križišča se pripneta RuvB heksamera.[1]

	== Nukleolitična resolucija Hollidayevega križišča ==		== Nukleolitična resolucija Hollidayevega križišča ==

Nejc Kejžar: /* Struktura Hollidayevega križišča */

2016-05-28T15:01:26Z

Struktura Hollidayevega križišča

← Older revision		Revision as of 15:01, 28 May 2016
Line 6:		Line 6:

	== Struktura Hollidayevega križišča ==		== Struktura Hollidayevega križišča ==
	Kot že omenjeno je Hollidayevo križišče sestavljeno iz 4 nukleotidnih verig, ki se in vivo prekrižajo v odprti planarni strukturi tako, da križišče zavzame obliko kvadrata, pri katerem iz kotov izhajajo dsDNK (slika 3 [5]).[1,2] Takšna struktura seveda ni stabilna sama po sebi, ampak jo stabilizira RuvA homotetramer.[1,2] Kompleks zavzame obliko pekača za kolač, s krožno vdolbino za križajoče se ssDNK in izstopajočim delom v sredini kvadrata Hollidayeve zanke. Ta je sestavljen iz aminokislin Glu55 in Asp56 vsakega RuvA, ki povzročajo elektrostatski odboj s fosfatnimi skupinami ssDNK; tako se doseže separacija ssDNK in njihovo vodenje do izmenjave nukleotidnih verig.[1] Vdolbine so prekrite s pozitivnimi aminokislinskimi ostanki, ki DNK verige preko elektrostatskih interakcij stabilizirajo v notranjosti le-teh.[1] Predpostavlja se, da je pravilna in vivo struktura dejansko homooktamer, ki tako ne tvori zgolj vdolbin, ampak tunel za DNK verige (dva pekača obrnjena z vdolbinami drug proti drugemu).		Kot že omenjeno je Hollidayevo križišče sestavljeno iz 4 nukleotidnih verig, ki se in vivo prekrižajo v odprti planarni strukturi tako, da križišče zavzame obliko kvadrata, pri katerem iz kotov izhajajo dsDNK ([http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1C7Y slika 3] [5]).[1,2] Takšna struktura seveda ni stabilna sama po sebi, ampak jo stabilizira RuvA homotetramer.[1,2] Kompleks zavzame obliko pekača za kolač, s krožno vdolbino za križajoče se ssDNK in izstopajočim delom v sredini kvadrata Hollidayeve zanke. Ta je sestavljen iz aminokislin Glu55 in Asp56 vsakega RuvA, ki povzročajo elektrostatski odboj s fosfatnimi skupinami ssDNK; tako se doseže separacija ssDNK in njihovo vodenje do izmenjave nukleotidnih verig.[1] Vdolbine so prekrite s pozitivnimi aminokislinskimi ostanki, ki DNK verige preko elektrostatskih interakcij stabilizirajo v notranjosti le-teh.[1] Predpostavlja se, da je pravilna in vivo struktura dejansko homooktamer, ki tako ne tvori zgolj vdolbin, ampak tunel za DNK verige (dva pekača obrnjena z vdolbinami drug proti drugemu).

	== Migracija Hollidayevega križišča ==		== Migracija Hollidayevega križišča ==